Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Biz mükemmel hayvan bakımı için Timo Fritsch için müteşekkiriz. Köster ve Steinert laboratuvarları üyelerine destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Dr. Dandan Han'a el yazını eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Biz minnetle Aşağı Saksonya Federal Devlet, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) tarafından fon kabul ediyoruz.

Burada açıklanan tüm hayvan işleri yasal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (AB Direktifi 2010/63, lisans AZ 325.1.53/56.1-TUBS ve lisans AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Düşük Eritme Agarose, Jel Levha ve Mikroenjeksiyon/Mikrogavaj İğnelerinin Hazırlanması
<ol><li>0.08 g düşük eriyen agarose(Malzeme Tablosu, agarose A2576) 10 mL danieau'nun orta (0.12 mM MgSO4, 0.18 mM Ca [NO3]2), 0.21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile.">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li><li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance.">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li><li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain,+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078.">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li><li>P&#233;pin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea:+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec.">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li><li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis.">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li><li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation.">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li><li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1.">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li><li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

Sunulan yöntemler değiştirmek ve hem enjeksiyon ve mikrogavage 10 ,14gerçekleştirerek zebra balığı larvaları enfekte mevcut bir yaklaşım genişletmek. Ayrıca zebrabalığı larvaları22ile anaerobik patojenleri incelemek için bir yaklaşım göstermektedir. Buna ek olarak, protokol CDI üzerine in vivo doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının analizini kolaylaştırır ve zebra balıklarında C. difficile<...

C. difficile bir gram-pozitif, spor oluşturan, anaerobik, ve gastrointestinal sistemde ciddi enfeksiyonların önde gelen nedeni dir toksin üreten bacillus1. CDI tipik belirtileri ishal dahil, karın ağrısı, ve ölümcül psödomembranöz kolit, ve bazen ölüme yol açabilir1,2. Kanıtlar, konak immün yanıtların bu hastalığın hem ilerlemesinde hem de sonuçlarında kritik bir rol oynadığını göstermiştir3. Bağışıklık yanıtına ek olarak, yerli bağırsak mikrobiyota başlangıcı ve CDI patogenezi için çok önemlidir4. Son on yılda, c. difficile (BI/NAP1/027)5,6hipervirulent suşu ortaya çıkması nedeniyle olgu ların sayısı ve CDI mortalite oranı önemli ölçüde artmıştır. Altta yatan bağışıklık mekanizmaları ve CDI sırasında mikrobiyota rolünün daha iyi anlaşılması yeni terapötik gelişmelere ve gelişmelere yol açacaktır, Bu salgının daha iyi kontrol sağlayan.
Hamster ve fare gibi çeşitli hayvan modelleri, C. difficilekarşıbağışıklık savunma içine fikir sağlamak için geliştirilmiştir7 ,8. Ancak, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin rolü hala kötü anlaşılmaktadır, özellikle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışı ağırlıklı olarak histolojik analiz veya in vitro kültürlü hücrelerden türetilmiştir beri. Bu nedenle, canlı bir omurgalı organizmanın içinde C. difficile doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ortaya çıkarmak için şeffaf bir zebrabalığı modeli kurulması bu tür çalışmaları kolaylaştıracaktır. Zebra balığı larvaları fonksiyonel doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahiptir, ancak döllenmeden 4-6 hafta sonraya kadar adaptif bağışıklık sistemiyoktur. Bu benzersiz özellik zebra balığı larvaları CDI izole yanıt ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model yapar.
Bu rapor, makrofajlar ve nötrofiller gibi C. difficile ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için zebra balığı larvaları kullanarak yeni yöntemler açıklamaktadır. İlk olarak, C. difficile inokül ve boyama içeren lokalize bir mikroenjeksiyon protokolü sunulmuştur. İn vivo konfokal zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak nötrofillerin ve makrofajların enfeksiyon bölgesine tepkisi kaydedilir ve nötrofiller ve makrofajlar tarafından bakterilerin fagositozisi gözlenir. Ancak, enjeksiyon kendisi doku hasarına neden olduğu bildirilmiştir ve bakteri bağımsız lökosit işe yol açar10. Bu nedenle, zebrabalığı larvalarının bağırsağı içine C. difficile teslim etmek için noninvaziv bir mikrogavaj protokolü daha sonra açıklanmıştır. Önceki çalışmalar yerli gastrointestinal mikrobiyota C. difficile11kolonizasyonuna karşı bir konak korumak göstermiştir. Bu nedenle, gnotobiyotik zebra balığı larvaları da enfekte zebra balığı yatkınlık için kullanılır 12. Daha sonra, bağırsak diseksiyonu uygun C. difficile kurtarmak ve zebrabalığı bağırsak larında varlığının süresini doğrulamak için yapılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) Amerika Birleşik Devletleri'nde en yaygın sağlık ilişkili gastrointestinal enfeksiyonlardan biri olarak kabul edilir. C. difficile karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanımlanmıştır, ancak CDI nötrofiller ve makrofajlar tam rolleri daha az anlaşılmaktadır. Mevcut çalışmada, Danio rerio (zebrabalığı) larvaları in vivo bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin davranış ve işbirliği görüntüleme için bir C. difficile enfeksiyon modeli oluşturmak için kullanılır. C. difficileizlemek için, floresan boya kullanılarak bir etiketleme protokolü kurulmuştur. Lokalize enfeksiyon, zebra balığı nın bağırsak sisteminde aktif olarak yetişen ve CDI'deki intestinal epitel hasarı taklit eden C. difficile etiketli mikroenjeksiyon ile elde edilir. Ancak, bu doğrudan enfeksiyon protokolü invaziv ve deneysel sonuçları etkileyebilir mikroskobik yaralar, neden olur. Bu nedenle, daha noninvaziv bir mikrogavage protokolü burada açıklanmıştır. Yöntem açık ağız yoluyla entübasyon yoluyla doğrudan zebrabalığı larvaları bağırsak içine C. difficile hücrelerinin teslim içerir. Bu enfeksiyon yöntemi yakından C. difficiledoğal enfeksiyon rotasını taklit eder.

C. difficile kesinlikle anaerobik, ancak floresan proteinlerin kromofor genellikle olgun oksijen gerektirir. Bu sorunu aşmak için, bir floresan boya aktif olarak büyüyen canlı C. difficile hücreleri leke kullanılmıştır (R20291, bir ribotype 027 suş; Şekil 1A). Gal4/UAS sistemi kullanılarak, canlı görüntüleme için kararlı transgenik zebra balığı hatları oluşturuldu ve mpeg1.1 veya lyZ organizatörleri EGFP floresan p...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Burada mikroenjeksiyon ve noninvaziv mikrogavaj ile floresan olarak etiketlenmiş anaerobik C. difficile ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için güvenli ve etkili bir yöntemdir.

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Bu yöntem, makrofajların bu patojeni tanıyıp tanıyabileceği veya fagositoze neden olduğu gibi Clostridium enfeksiyonunda doğuştan gelen bağışıklık sisteminin rolü hakkındaki temel soruyu yanıtlayabilir. Bu yöntemin ana avantajı birçok farklı anaerobik bakterilere uygulanabilir olmasıdır, enfeksiyon süresi manipüle edilebilir, ve oral uygulama çok daha yakın normal insan enfeksiyonu temsil eder. Kültürden sonra, kültürün bir mililitresini spektrofotometre cuvette'ine aktarın ve OD600'ü ölçün.Son hacmin bir mililitresinde 1 ila 1,2'lik son bir OD'ye ulaşmak için gerekli miktarı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir mililitre 1X PBS ile bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 5,000 kez g santrifüj. 1X PBS bir mililitre resuspend.Bir mililitrelik bakteriyel süspansiyon içine hazırlanan floresan boya çalışma çözeltisi üç mikrolitre ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, lekeli Clostridioides difficile bir kez 1X PBS artık boya kaldırmak için yıkama ve 1X PBS bir mililitre resuspend bir OD600 elde etmek için 1.0.İlk olarak, kapsayacak bir Petri kabında zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları yanal konuma hafifçe ayarlayın. Petri kabını 30-60 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin ve düşük eriyen agarose'un katılamasını bekleyin.Agarose kapsayacak şekilde% 0.02 ila 0.04% tricaine içeren% 30 Danieau's orta ekleyin. Enjeksiyon çözeltisi hazırlamak için, boya lekeli Clostridioides difficile inoculum dokuz mikrolitre içine PBS çözeltisi% 0.5 fenol kırmızı bir mikrolitre ekleyin. Microloader kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.Yüklü iğneyi bir mikromanipülatöre yerleştirin ve stereo mikroskop altında yerleştirin. Enjeksiyon basıncını 600 ile 900 hektopascal arasında ayarlayın. 0,5 ila 1,0 nanolitre elde etmek için enjeksiyon süresini 0,1 ila 0,3 saniye olarak ayarlayın.İğneyi mikromanipülatöre yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve gömülü larvaları işaret edin. İğne ucunu gastrointestinal sistem üzerine, ürogenital gözeneğe yakın bir yere yerleştirin. Agarose'u del, sonra iğne ucuolan kasları.Sonra bağırsak lümen içine yerleştirin ve Clostridioides difficile 0.5 ila 1.0 nanolitre enjekte. Enjekte edilen larvaları izlemek için floresan mikroskobu kullanın ve konfokal görüntüleme için düzgün enjekte edilen larvaları almak için esnek bir Microloader ucu kullanın. Olukları ile% 1.5 agarose plaka, kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük eriyen agarose bir damla yerleştirin.Larvaları, olukta 45 derecelik açılarda dik bakacak şekilde larvaları ve kuyrukları oluğun duvarına doğru yavaşça ayarlayın. İğneyi agarose'dan, sonra da yemek borusundan zebra balığı larvalarının ağzına doğru yavaşça çalıştırın. İğneucu ön bağırsak ampul içinde bir kez, bakteri kültürünün 0,5 bir nanolitre serbest bırakmak için enjeksiyon pedalına basın.Bağırsağın lümenini doldurun. Yemek borusundan veya cloaca'dan taşmasına izin vermeyin. İğneyi zebra balığının ağzından yavaşça çekin.Gavaj'ı takiben, enfekte zebra balığı larvalarını önce agarose'u keserek, sonra larvaları kaldırarak esnek bir Microloader ucuyla agarose'dan kurtarın. Bu larvaları steril %30 Danieau'nun orta makinesine aktarın ve iki kez durula. Zebra balığı larvalarını anestezi ettikten sonra, anestezili larvaları kapsayacak şekilde %1'lik düşük eriyen agarose'un 200 ila 300 mikrolitresini ekleyin.Larvaların enfekte bölgesini mümkün olduğunca yakından cam bir kaydırağa karşı yerleştirin. Agarose 30-60 saniye buz üzerinde katılaşmak sağlar. Agarose%30 Danieau'nun %0,02 ila %0,04 trikotin içeren ortamına batırın.Larvaları bir konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüye devam edin. Enfekte zebra balığı larvaları ötenazi sonra, zebrabalığı larvaları baş yakın dorsal gövde içine bir iğne yerleştirin zebrabalığı hareketsiz hale getirmek için. Bir mızrak ile solungaçları arkasındaki baş çıkarın.Sırt gövdesinin ortasına ikinci bir iğne yerleştirin. Zebra balığının karnına üçüncü bir iğne yerleştirin ve bağırsakları vücut boşluğundan çekin. 10 ila 15 bağırsakları 200 mikrolitre steril 1X PBS içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.Dokuyu bozmak ve homojenleri hazırlamak için bağırsakları bir zararlı ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için haşere tüp altına ulaştığından emin olun. Homojenatlar içine, Clostridioides difficile yetiştirme orta D-sikloserin ve sefüsitin içeren ekleyin, veya taurokolate olmadan, ve bir anaerobik odada kuluçka.Bu çalışmada hem nötrofiller hem de makrofajlar enfeksiyon bölgelerine ulaşabilmektedir. İki bakteriyi aktive eden makrofaj fagositizasyonu örneği, fagositoz ile temizlenmesini ve etiketli Clostridioides difficile'nin sindirimini göstermektedir. Flüoresans etiketli Clostridioides'in makrofaj ve nötrofil muhabir hatlarının bağırsak lümenine beş gün sonra döllenme sonrası yaygınlaşması, Clostridioids difficile enfeksiyonunun doğal yolunu taklit etmesi dir.Ancak nötrofiller ve makrofajlar mikrogavajdan sonra 12 saate kadar gastrointestinal sistemde belirgin bir göç göstermediler. Bu arada, etiketli Clostridioides difficile floresan yaklaşık beş saat sonra mikrogavage sonra kayboldu. İnfeksiyon sonrası 24 saat bağırsak örnekleri incelenmiş ve bakteriyel büyüme göstermiştir.Kontrol grubunda bakteri büyümedi. Daha sonraki zaman noktalarında, kuluçkaya yatan örnekler sadece TCA içeren ortamda büyüdü, bu da bağırsaktaki total Clostridioides difficile'nin sporlar oluşturduğunu düşündürdü. 16S rDNA PCR clostridioides difficile olarak yetiştirilen bakteri tespit, hangi öngörülebilir boyutta özel PCR amplicons üretmek etrafında 800 baz çiftleri.CHROMID plakası üzerine yetiştirilen bakteri kültürleri tipik siyah koloniler olarak ortaya çıktı, bu da zebra balığı bağırsaklarından gelen bakterilerin Clostridioides difficile olduğunu gösterdi. Anaerobik bakterilerle çalışmak aerobik adımların kısa tutulmasını gerektirir çünkü bu bakterilerin biyolojisini etkiler. Zebra balığıdoğuştan bağışıklık hücresi manipüle edilebilir.Örneğin, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının mekanizmasını deşifre edebilirler. Yöntemimiz, zebra balığının insan bağırsanın anaerobik patojenini incelemek için bir araç olabileceğini gösterdi. Çok dirençli patojenlerle çalışmak için uygun güvenlik önlemlerinin alınması gerekmektedir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Larva A roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot kullanarak Zebra balığı Electroretinogram kayıt

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...