Name: visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Brianna Alexander, Caolan O'Donnell ve Michael Warkala'ya bu el yazmasının dikkatli okumaları ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 SA tarafından finanse edildi; AJR NHLBI HL103920-08S1 ve Ulusal Artrit Enstitüsü ve Kas-Iskelet ve Cilt Hastalıkları Eğitimi hibe T32052283-11 tarafından desteklenir.

Hayvan kullanımı ve prosedürleri Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Çözümlerin hazırlanması
<ol><li>%0,1 Triton-X-100 (PBST) ile 1 L fosfat tamponlu tuzlu su hazırlayın ve sterilize edin. Bu çözelti en az bir yıl oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.</li>
	<li>PBST'de normal eşek serumunun %10'undan oluşan 600 μL bloke tamponhazırlayın. Bu çözümü her seferinde taze yapın.</li>
	<li>Bir akış kaputunda aşağ...

<ol>
	<li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo.">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li><li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations.">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3,+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field.">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice.">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li><li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+(HREM).">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).</li><li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis.">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li><li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis.">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Becker, K., J&#228;hrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains.">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li></ol>

3D fare embriyolarında endotel görselleştirmek için yeteneği onların gelişimi içine yeni anlayışlar sağlamıştır3. Burada embriyoların yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme, vasküler bağlantı nın görselleştirilmesi ve PAA oluşumunun kantitatif analizleri için izin veren bir protokol sıyoruz. Bu protokol, genetik değişikliklerin veya çevresel hakaretlerin PAA gelişimini nasıl etkilediğini görmek için kullanılabilir. Burada bildirilen prosedür, PAA oluşumunu ...

Fare embriyogenezi sırasında, faringeal arch arterler (PAAs) dorsal aort ile kalp bağlamak arterlerin simetrik, çift taraflı çiftleri olarak ortaya çıkar1. Embriyo geliştikçe, PAAs ilk ve ikinci çiftleri regress, süre 3,4th, ve6 PAAs aort kemer arterler oluşturmak için asimetrik remodeling olaylar bir dizi geçmesi2.
PAAs 3, 4 ve 6 vaskülogenez yoluyla gelişir, hangi kan damarlarının de novo oluşumudur3. Bu kemer arterlerin oluşumu veya remodeling kusurları çeşitli konjenital kalp defektleri yol açar, DiGeorge Sendromu olan hastalarda görülen gibi4,5. Bu nedenle PAA'ların gelişimini düzenleyen mekanizmaların anlaşılması konjenital kalp hastalığı (KH) etiyolojisinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
PAA gelişimini görselleştirmek ve analiz etmek için güncel yaklaşımlar arasında doku kesitlerinin immünororesansı, vasküler dökümler, Hindistan mürekkep enjeksiyonu, yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi ve/veya tam montajlı immünohistokimya1,4,5,,6,7sayılabilir. Burada, hacimsel verileri, vasküler bağlanabilirliği ve hücre kimliğini toplamak, analiz etmek ve ölçmek için tam bir immünofofloresans, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu görüntü oluşturmayı birleştiren bir protokol tanımlıyoruz. Ayrıca, faringeal kemer vasküler pleksus oluşumu nu incelemek ve PAAs içine remodeling bir araç olarak her faringeal kemer EC'lerin sayısını bölümlere ayırmak ve ölçmek için bir yöntem detay. Bu protokol PAA gelişimini analiz etmek için tasarlanmış olsa da, diğer gelişmekte olan vasküler ağları analiz etmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>PBS10X02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Imaris 9.2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18701.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (5 mg/mL stock)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast wells</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ERG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab214341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scapels</td>
			<td>Exelint International Co.</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of pharyngeal arch arteries using whole-mount immunohistochemistry and 3d reconstruction

Faringeal kemer arterlerin (PAAs) 3, 4 ve 6'nın yanlış oluşumu veya yeniden biçimlendirilmesi konjenital kalp hastalığının en şiddetli formlarından bazılarına katkıda bulunur. PAAs oluşumunu incelemek için, benil alkol /benzil benzoat (BABB) doku temizleme ve konfokal mikroskopi ile birleştiğinde tam montaj immünororesans kullanarak bir protokol geliştirdik. Bu ince bir hücresel çözünürlükte faringeal kemer endotel görselleştirme yanı sıra vaskülatür 3D bağlantısı sağlar. Yazılımı kullanarak, PAAs endotel hücrelerinin (ECs) sayısını ölçmek için bir protokol kurduk, yanı sıra faringeal kemerler içinde PAAs çevreleyen vasküler pleksus içinde ECs sayısı 3, 4, ve 6. Tüm embriyouygulandığında, bu metodoloji embriyonik vaskülatür kapsamlı bir görselleştirme ve kantitatif analiz sağlar.

Burada sunulan tüm montaj immünofloresan protokolü net ve temiz sonuçlar üretir, faringeal kemer endotel 3D rekonstrüksiyonu için izin, Şekil 1Agörüldüğü gibi . Her antikor çözeltisinde yeterli miktarda embriyo kuluçkaya yatırılması ve antikor kuluçka sonrası embriyoların iyice yıkanması önemlidir. Şekil 1B'debüyük, parlak nokta, antikorveya engelleme tampon çözeltil...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction at JoVE.com

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Burada, faringeal kemer arterlerin 3, 4 ve 6'sını tam montaj lı immünororesans, doku temizleme, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol uyguluyoruz.

Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Bu yöntem, her faringeal kemer bölümlere ayrılmasını sağlar. Endotel hücre numaraları daha sonra faringeal kemer arter gelişimi çalışma aracı olarak her kemer ölçülebilir. Bu yaklaşımın başlıca avantajları farklı vasküler yapılar arasındaki ilişkiyi görselleştirme yeteneği ve yapıların mutantları nasıl etkilediğini nicel olarak belirleyebilme yeteneğidir.Aort kemer arterler genellikle konjenital kalp hastalığında mutasyona uğrar. Yöntemimiz mutasyonların damar oluşumu ve remodeling fizyolojik süreci nasıl değiştirdiğini çalışma sağlar. Konjenital kalp hastalığının mekanizmaları hakkında bilgi edinmek için bu yöntemi kullanmamıza rağmen, özellikle hafif sac mikroskobun ortaya çıkmasıyla diğer sistemlere uygulanabilir.Her fare embriyonik gün 9.5 veya 10.5 embriyo bireysel iki mililitre tüpler pbs içeren aktarmak için bir cam pipet kullanarak başlayın. Fiksasyondan sonra, embriyoyu arka ekstremitenin hemen üzerinde dikkatlice çimdiklemek ve embriyonun arka yarısını çıkarmak için enine bir kesim yapmak için ince profalar kullanın. Embriyoları permeabilize etmek için, PBST ile PBS değiştirin ve bir gecede nazik ajitasyon ile dört derece santigrat embriyoyerleştirin.Ertesi gün, pbst'yi embriyolara dokunmadan 600 mikrolitre bloke edici tampon ile değiştirin. Ertesi sabah, bloke tamponunu, dört santigrat derecede dört ila beş günlük bir kuluçka için tüp başına ilginin birincil antikorunun 600 mikrolitresi ile değiştirin. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında pbs her saat değişen nazik ajitasyon ile dört ila beş saat pBST bir mililitre için embriyoları yıkayın, dört derece santigrat taze PBST bir gecede kuluçka takip ve dört ila beş ek bir saat ertesi gün yıkar.Son yıkamadan sonra, her tüpteki PBST'yi dört ila beş günlük bir kuluçka için uygun ikincil antikor çözeltisinin 600 mikrolitresi ile değiştirin. Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi yıkama başına taze PBST bir mililitre embriyoyıkamak ve yavaşça bireysel plastik parafin kalıpları içine her embriyo aktarmak için bir cam pipet kullanın. Dikkatle her embriyo etrafında herhangi bir PBST kaldırmak ve bir sagittal pozisyonda her embriyo yönlendirmek.Sonra hızlı bir şekilde her embriyo sadece kaplı ve agarose katılaşmış kadar buz alüminyum folyo ile kaplı kalıpları yerleştirin kadar her kalıp sıcak agarose yaklaşık 500 mikrolitre ekleyin. Embriyonik örneklerin dehidratasyonu için, her embriyo etrafında agarose bir blok kesmek için temiz bir neşter kullanın ve% 25 metanol bir mililitre içeren etiketli iki mililitre tüp içine transferi için agarose kavramak için forseps kullanın. Karanlıkta nazik ajitasyon ile bir saatlik kuluçka sonra, karanlıkta ek bir saatlik kuluçka için tüp başına% 50 metanol bir mililitre ile% 25 metanol değiştirin.Dehidratasyon sona erdikten sonra, karanlıkta nazik ajitasyon ile bir saatlik kuluçka için% 50 BABB bir mililitre ile% 100 metanol değiştirin. Kuluçka sonunda, karanlıkta nazik ajitasyon ile bir saatlik kuluçka için tüp başına% 100 BABB bir mililitre ile% 50 BABB değiştirin, sadece gösterildiği gibi% 100 BABB ile ikinci bir kuluçka izledi. Görüntüleme için embriyoları monte etmek için, hızlı bir kuyu tampon yapıştırıcı çıkarın ve bir 24 altı mililitre sayısı 1.5 cam coverslip üzerine tampon yerleştirin.Kapak ve tampon arasındaki hava kabarcıklarını gidermek için yapıştırıcıya hafif basınç uygulayın ve her tüpten %100 BABB'yi dikkatlice atın. Daha sonra embriyoya dokunmadan embriyoyu hızlı kuyuya dikkatlice aktarmak için ince terlikler kullanın ve tampona ikinci bir kapak kaydırın. Tüm üçüncü faringeal kemer endotel yüzey için, yazılım ilgi görüntü açın ve yeni bir yüzey eklemek tıklayın.Bir yüzeye çift tıklayın ve yeni yüzeyi üçüncü faringeal kemerle yeniden adlandırın. Otomatik oluşturmayı atla'yı seçin, el ile edin ve yüzey yönünü YZ düzlemine ayarlayın. Üçüncü faringeal kemer yüzey düzlemini üçüncü PAA ve dorsal aortun bağlandığı yere yerleştirmek için dilim konumunu kullanın.Görüntüyü, üçüncü faringeal kemer yüzey düzleminin görünümünde olacak şekilde döndürün ve ortodilimleyiciyi kapatın. Çizim kontur modu altında, mesafe çizim modu işlevini seçin ve parametre ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, Kaçış tuşuna basın ve fare imleci ile üçüncü faringeal kemerin çevresini izlemek için çizime tıklayın.Daha sonra 10 ila 25 dilim taşımak ve faringeal kemer çevre izlemek için dilim konumunu kullanın. Tüm kemer izlendiğinde, izlenen bölgenin yüzeyini oluşturmak için yüzey oluştur'u tıklatın. Yüzeyli yapıların maskelemesini yapmak için, edit menüsünde, üçüncü PAA ve DAPI için maske seçimini seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından yeni kanalı PAA DAPI olarak yeniden adlandırın.Kalan kanallar için bu adımı yineleyin. Endotel pleksusunun PAA'dan ayrı olarak görselleştirilmesi için üçüncü PAA için maske seçimini seçin ve DAPI'yi seçin. Seçil voxel'leri yüzeyin dışına doğru çekin ve yüzeyin içindeki voxel'leri kontrol edin.Yüzeyin içindeki voxel'leri sıfıra ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Yeni kanalı PAA DAPI olmayan olarak yeniden adlandırın. Kalan kanallar için bu adımı yineleyin. Üçüncü PA için maske seçimini seçin ve PAA OLMAYAN DAPI'yi seçin ve Tamam'ı tıklatın. Yeni kanalı pleksus DAPI olarak yeniden adlandırın.Kalan kanallar için bu adımı yineleyin. İlgi çekici her yapıdaki tek tek endotel hücrelerini ölçmek için, ekran ayarlamaları panelinde, PAA ERG kanalı dışındaki tüm kanalları kapatın. Özellikler menüsünün altında, yeni noktalar ekleyin ve noktalar bir PAA toplam endotel hücre sayısını yeniden adlandırmak için tıklatın.Mavi oku tıklatın ve kaynak kanal için PAA ERG kanalını seçin. Tahmini XY çapını dört mikrometreye ayarlayın ve bir sonraki panele geçmek için mavi oku tıklatın. Her ERG pozitif endotel hücre çekirdeğinin tek bir nokta yla temsil edilmesini sağlamak için nokta sayısını ayarlamak için kayan ölçeği kullanın.Ardından, yeşil çift oku tıklatın ve ekran ayarlama panelindeki PAA ERG kanalını kapatın. PAA endotelgörselleştirmek için PAA VEGFR2 kanalını açın ve nesnenin yüzeyini seçmek için düzenle ve ekle/sil'i tıklatın. Daha sonra Kaçış tuşuna basın ve VEGFR2 pozitif olmayan noktaları silmek için Shift tuşuna basılı tutun ve endotel hücrelerinin toplam sayısını belirlemek için istatistik sekmesini tıklatın.Tüm montaj immünofloresannet faringeal kemer endotel 3D rekonstrüksiyon sağlayan net ve temiz sonuçlar üretir. Bu resimde, büyük parlak nokta varlığı ya antikor veya engelleme tampon çözeltileri partikül sonucudur. Faringeal kemer ve PAA yüzey boyama sonra, maske fonksiyonunun kullanımı yüzey bölgeleri görsel olarak ayrılmış ve bağımsız olarak analiz sağlar.Maskeleme aynı zamanda her yapı içinde endotel hücre sayılarının ayrı ayrı analiz ve niceliklendirilmesine olanak sağlar. Örneğin, burada nokta özelliği, ERG ifade eden her çekirdek için tek bir nokta atayarak hem PAA hem de pleksus endotel hücrelerinin toplam sayısını ölçmek için kullanılmıştır. Bu resimde spot fonksiyonu tarafından oluşturulan bir ERG pozitif VEGFR2 negatif nokta görülebilir.Bu nedenle, yazılım tarafından tanınan her nokta aslında tek bir endotel hücresini temsil ettiğini doğrulamak esastır. Temiz ve net görüntüler elde etmek için, tüm çözümleri aşağı spin ve düzgün ve iyice antikor kuluçka sonra her embriyo yıkamak için unutmayın. BABB'nin aşındırıcı ve zehirli olduğunu unutmamak önemlidir.Solventi düzgün bir şekilde talın ve atın ve BABB sızıntısını önlemek için erimiş embriyoları tamamen mühürlediğinden emin olun.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...