Name: combined conditional knockdown and adapted sphere formation assay to study a stemness-associated gene of patient-derived gastric cancer stem cells
Uploaded: 2020-05-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2018A030310586, 2020A1515010989), הקרן למחקר מדעי רפואי של מחוז גואנגדונג (A2019405), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81772957), המדע והתוכנית הטכנולוגית של מחוז גואנגדונג בסין (2017B030301016), והקרן לתעשייה וטכנולוגיה מידע של שנג'ן (20180309100135860).

כל הניסויים באמצעות תאי גזע סרטן קיבה נגזר המטופל המתוארים בכאן אושרו על ידי הוועדה האתית המקומית7.
1. סרטן הקיבה תרבות תאי גזע
<ol><li>הכנת GCSCs תרבות מלאה בינונית<ol>
<li>להכין GCSCs תרבות מלאה בינוני על ידי הוספת טרי DME / F12 בינוני עם המרכיבים החיוניים הבאים: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL ...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2016.">Cancer statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Valent, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+definitions+and+terminology:+the+devil+is+in+the+details.">Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).</li><li>P&#252;tzer, B. M., Solanki, M., Herchenr&#246;der, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cancer+stem+cell+targeting:+How+to+strike+the+evil+at+its+root.">Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).</li><li>Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cancer+Stemness+in+the+Clinic:+From+Hype+to+Hope.">Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope.</a> Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).</li><li>Takaishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gastric+cancer+stem+cells+using+the+cell+surface+marker+CD44.">Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44.</a> Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+cancer+stem+cells+in+tumor+tissues+and+peripheral+blood+derived+from+gastric+adenocarcinoma+patients.">Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients.</a> Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li><li>Hannon, G. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+potential+of+the+human+genome+with+RNA+interference.">Unlocking the potential of the human genome with RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).</li><li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+gene+knockdown+in+mice+using+a+tight,+inducible+shRNA+expression+system.">Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system.</a> Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).</li><li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verteporfin+blocks+Clusterin+which+is+required+for+survival+of+gastric+cancer+stem+cell+by+modulating+HSP90+function.">Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).</li><li>Ohkawa, J., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+functional+activity+of+an+antisense+RNA+by+a+tetracycline-responsive+derivative+of+the+human+U6+snRNA+promoter.">Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.</a> Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).</li></ol>

GC הוא הגורם המוביל השלישי למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם. GCSCs הם קריטיים בנסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. באמצעות GCSCs מחולים בסרטן הקיבה יאפשר לנו לחקור את נקודת התורפה שלהם ולפתח את תרופות מיקוד לטיפול של חולי GC.
היווצרות כדור assay היא שיטה שימושית כדי לבחון את פוטנ?...

סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר ומוות של סרטן1. למרות ההתקדמות בניתוח משולב, כימותרפיה והקרנות בטיפול GC, הפרוגנוזה נשארת עניה שיעור ההישרדות של חמש שנים הוא עדיין נמוך מאוד2. הישנות וגרורות הן הסיבות העיקריות לגרום למוות שלאחר הטיפול.
תאי גזע סרטניים (CSCs) הם תת קבוצה של תאים סרטניים בעלי היכולת לחדש את עצמו וליצור את תריסות התא השונות לשחזר את הגידול3. CSCs הם האמינו להיות אחראי על נסיגה סרטן גרורות בשל היכולות שלהם של התחדשות עצמית ותזיטת גידולים חדשים, כמו גם ההתנגדות שלהם כימותרפיה מסורתית- ורדיותרפיות4. לכן, מיקוד CSCs וחיסול של CSCs לספק פוטנציאל מרגש כדי לשפר את הטיפול ולהפחית את התמותה של חולי סרטן.
CSCs כבר מבודדים מסוגים רבים של גידולים מוצקים5. בשנת 2009, תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) מבודדים קווי תאים סרטניים קיבה אנושיים תוארו במקור על ידי Takaishi ואח'6. חן ועמיתיו זיהו לראשונה ומטוהרים GCSCs מ אדנוקרצינומה קיבה אנושית (GAC) רקמות גידול7. ממצאים אלה לא רק מספקים הזדמנות ללמוד ביולוגיה GCSCs, אלא גם לספק חשיבות קלינית רבה.
מאפיין מסוים של CSCs הוא היכולת שלהם ליצור כדור8. תאים בודדים מצופה בתנאים לא דביקים בצפיפות נמוכה, ורק התאים בעלי התחדשות עצמית יכולים לגדול לתוך אשכול מוצק וכורי הנקרא כדור. לכן, ההתווייה של היווצרות הכדור נחשבה ל-assay תקן הזהב ונעשה בה שימוש נרחב להערכת פוטנציאל החידוש העצמי של תאי גזע במבחנה.
הפרעות RNA (RNAi) הוא כלי מחקר רב עוצמה כדי ללמוד את תפקוד הגנים על ידי נוק-דאון של גן מסוים9. עם זאת, טכנולוגיות נוק-דאון גנים יציבים לטווח ארוך יש מגבלות מסוימות, כגון האתגר של חקר הפונקציה של גן חיוני להישרדות תאים. מערכות RNAi מותנות יכולות להיות שימושיות לרישום של הגנים הרצויים באופן זמני ו/או מבוקר מיוחד על ידי ניהול של סוכן גורם. מערכות טטרציקלין (Tet)-inducible הן אחת ממערכות RNAi המותנות הנפוצות ביותר10. מערכות Tet-inducible יכול לגרום השתקת גנים היעד על ידי שליטה הביטוי של shRNA בתוספת של גורם אקסוגני (דוקסיציקלין עדיף, דוקס). ניתן לחלק את מערכות Tet-inducible לשני סוגים: מערכות Tet-On או Tet-Off. ניתן להדליק את הביטוי shRNA (Tet-On) או לכבות (Tet-Off) בנוכחות ה-inducer. במערכת Tet-ON ללא גורם, המדכא Tet (TetR) התבטא באופן קבוע כקושר לרצף הרכיב המגיב של Tet (TRE) המכיל יחצ"ן התלוי ב-Tet Pol III לביטוי shRNA, ובכך מדחיק את הביטוי של shRNA. בעוד עם תוספת של Dox, TetR מבודד מן היזם המגיב Tet Pol III תלוי. זה מקל על הביטוי של shRNA ומוביל לחיסול גנים.
הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מערכת shRNA טטרציקלין-בלתי ניתן להושר ומערכת היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את הפונקציה של clusterin ב GCSCs נגזר המטופל. Clusterin זוהה כמוקולת מפתח רומן לשמירה על הגזע והישרדות של GCSCsבמחקר קודם 11. אנו משתמשים בפרוטוקול המתואר כדי ללמוד את ההשפעות של clusterin ב-GCSCs התחדשות עצמית. מתודולוגיה זו ישימה גם על סוגים אחרים של תאי גזע סרטניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2068586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Australia</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiviral vector</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>GV307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell Culture/Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>171099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper 1.0 (gag/pol component)</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>pHelper 1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper 2.0 (VSVG component)</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>pHelper 2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>11890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Inverted Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined conditional knockdown and adapted sphere formation assay to study a stemness-associated gene of patient-derived gastric cancer stem cells

תאי גזע סרטניים (CSCs) מעורבים חניכה גידול, התפתחות והישנות לאחר הטיפול, והפכו למרכז תשומת הלב של מחקרים רבים בעשורים האחרונים. לכן, חשוב לפתח שיטות לחקור את התפקיד של גנים מרכזיים המעורבים גזע תאים סרטניים. סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר של סרטן. תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) נחשבים השורש של נסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. הבנת ביולוגיה GCSCs נדרש כדי לקדם את הפיתוח של טיפולים ממוקדים ובסופו של דבר כדי להפחית את התמותה בקרב חולים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.

תאי גזע סרטן הקיבה אדנוקרצינומה קיבה אנושית העיקרית היו תרבותיים במדיום תרבות ללא סרום. לאחר 6 ימים, התאים התרחבו מהפנוטיפ היחיד הדומה לתא (איור 1א') כדי ליצור ספירות גדולות (איור 1ב').
כדי ל...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells at JoVE.com

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.

נוק-דאון מותנה משולב ואסא היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד גן הקשורים לגזע של תאי גזע נגזר סרטן הקיבה נגזר

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

תאי גזע סרטניים מעורבים גרורות סרטן relapsed על עמידות לתרופות. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לחקר הפונקציות של גנים מרכזיים בתאי גזע סרטניים. באמצעות מערכת נוקאאוט מותנית והתאמה מותאמת של היווצרות כדור, שיטה זו מותאמת בקלות לחקר פונקציות במבחנה וב-vivo על גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של תאי גזע סרטניים.להדגים את ההליך, יהיו יואטינג לי ושיאנגיו טאן, עוזרי מחקר מהמעבדה שלי. כדי ליצור חלקיקי lentivirus, זרע ארבעה מיליון תאי אריזה lentiviral 293T לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לוודא כי התאים הם 50 עד 80% confluent ביום של transfection.הביאו ירידה בטמפרטורת הסרום לטמפרטורת החדר והכינו צינורות A ו-B בהתאם לכיווני כתב היד. מוסיפים את תכולת הצינור A לצינור B.Mix היטב ומדגירה את הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין מתחמי שומנים בדנ"א. הסר חמישה מיליליטר של מדיום מן צלחת תרבות התא.לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של קומפלקס השומנים-DNA לתוך צלחת תרבות התא טיפה חכם בעדינות מערבל את המנה. הדגירה את צלחת התרבות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את מדיום ההמרה והחלף אותו ב-10 מיליליטר של DMEM מחומם מראש בתוספת 10%FBS.דגירה התאים לעוד 24 שעות. כ 48 שעות לאחר transfection, לקצור 10 מיליליטר של lentivirus המכיל על טבעי ולסנן אותם עם מסנן 0.45 מיקרומטר לשפוך כדי להסיר פסולת הסלולר. כל כלי תרבות התא, טיפים, מסננים ומזרקים עשויים להכיל lentivirus ויש לטפל עם 10% אקונומיקה לפני סילוק.מעבירים על-טבעי מובהר למיכל סטרילי. מוסיפים את רכז Lenti-X ומערבבים עם היפוך עדין. הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס לילה.ביום שלמחר, צנטריפוגה המדגם ב 1500 פעמים G במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant, דואג לא להפריע את גלולה בתחתית. בעדינות להשעות את גלולה במיליליטר אחד של DMEM בתוספת 10% FBS ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.זרעים 6 מיליון תאי גזע סרטניים קיבה או GCSC של לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS. תרבו את התאים במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. כאשר התאים מגיעים ל-70 עד 80%, שאפו את המדיום מהצלחת והוסיפו את החלקיקים המרוכזים המדוללים בארבעה מילימטרים של מדיום DMEM שלם, המכילים רגנט פוליברין.מחזירים את התאים לאנקובטור למשך 18 שעות. פוליברין צריך להיבדק בתנאים שונים כדי לקבוע את הריכוז היעיל, אשר בדרך כלל בטווח של 2 עד 10 מיליגרם למיליליטר. לאחר 18 שעות, החלף את המדיום ב- 10 מיליליטר של DMEM ב- 10%FBS והחזר את התאים לאנקובטור למשך 24 שעות.לאחר מכן, שאפו את העל-טבעי עם פסולת התאים והוסיפו DMEM טרי בתוספת 10%FBS ו-2.5 מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין. דגירה התאים לעוד 24 שעות. לאחר מכן, לשנות את המדיום שוב DMEM טרי בתוספת 10%FBS וחמישה מיקרוגרם למיליליטר Puromycin.לאחר דגירה נוספת 24 שעות ביממה, לשטוף את GCSCs חסיד פעמיים עם חמישה מיליליטר של DPBS ללא סידן ומגנזיום. נתק את התאים עם מיליליטר אחד של פתרון ניתוב תאים מחומם מראש ותדגר אותם במשך שתיים עד שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של טרי מחומם מראש GCSC להשלים את מדיום התרבות כדי ההשעיה התא.מחלקים שלושה מיליליטר של ההשעיה הזאת לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר להקפאה, ושלושת המיליליטרים האחרים לתוך צינור אחר לגיוס עם דוקסיציקלין. צנטריפוגה שני הצינורות ב 800 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את העל-טבעי מצינור B והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות שלם GCSC מחומם מראש.זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר חדש עם 10 מיליליטר של טרי מחומם מראש GCSC תרבות מלאה בינוני ו 2.5 מיקרוגרם לכל דוקסיציקלין מיליליטר. לאחר מכן, לה הדגירה את המנה במשך 48 שעות. השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את הצפיפות של דגימת תאים של 10 מיקרוליטר.לאחר מכן, להתאים את עוצמת הקול עם אמצעי תרבות מלא GCSC מחומם מראש כדי לקבל ריכוז של 20, 000 תאים קיימא למיליליטר. לוותר על 100 microliters של ההשעיה התא לתוך כל באר של חדש, חיבור נמוך במיוחד 96 צלחת תרבות היטב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.היווצרות כדור צריכה להתרחש בתוך שלושה עד עשרה ימים. תדמיין את היווצרות כדור הגידול כל יומיים. סרטן קיבה תאי גזע מן אדנוקרצינומה קיבה אנושית ראשונית היו מתורבתים במדיום תרבות ללא סרום.לאחר שישה ימים, התאים התרחבו מתא יחיד כמו פנוטיפ לכדורים גדולים. כדי להעריך את הפונקציה של clusterin GCSCs, רצפי RNA סיכת ראש קצרים נגד clusterin היו משובט לתוך וקטור Tet-GV307-RFP-Puro. תאים שעברו חילוף בווקטור הביטוי טופלו ב דוקסיציקלין במשך 48 שעות.לאחר מכן, ביטוי האשכולות אומת על ידי כתם מערבי וכמת על ידי צפיפות. הנוכחות של דוקסיציקלין ונוקאאוט של clusterin ב GCSCs עיכב היווצרות כדור הגידול. בעוד שום עיכוב של היווצרות כדור הגידול נצפתה בתאים שהתומרו עם פקדי shRNA מקושקשות, המציין כי דוקסיציקלין לבד לא לעכב היווצרות כדור הגידול.תוצאות אלה מצביעות על כך שלאחר השתחת clusterin, GCSCs לגדול לאט ולא יכול ליצור כדורי גידול. בהתבסס על נתונים אלה, clusterin ממלא תפקיד קריטי בקידום פעילות התחדשות עצמית של GCSCs, המציין כי זה יכול להיות יעד תרופה מבטיחה לדיכוי תאי גזע סרטניים בחולים בסרטן קיבה. כדורי הגידול צריכים להיות מבנים עגולים מוצקים על תאים בודדים או מצטברים, לא צריך להיחשב כדורי גידול.עם זאת, כמה תאי גזע סרטניים לא יכול ליצור מבנים טיפוסיים כדור הגידול. הליך זה ניתן לבצע עם שיטות אחרות כדי לבחון תא גזע סרטן עבור פוטנציאל מתחדש במבחנה. לדוגמה, ניתן ללמוד את הביטוי של סמנים הקשורים לגזע.ניתן להאריך את הפרוטוקול כדי לחקור את הפונקציות של הגנים הקריטיים בתאי גזע סרטניים כגון גזע על הישרדות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...