Name: combined conditional knockdown and adapted sphere formation assay to study a stemness-associated gene of patient-derived gastric cancer stem cells
Uploaded: 2020-05-09T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela Nature Science Foundation da província de Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), a Medical Scientific Research Foundation da Província de Guangdong (A2019405), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81772957), a Ciência e Programa de Tecnologia da Província de Guangdong, na China (2017B030301016), e da Fundação indústria e tecnologia da informação de Shenzhen (20180309100135860).

Todas as experimentações utilizando células-tronco de câncer gástrico derivadas do paciente descritas aqui foram aprovadas pelo comitê de ética local7.
1. Cultura de células-tronco do câncer gástrico
<ol><li>Preparação de GCSCs meio de cultura completa<ol>
<li>Prepare os GCSCs meio de cultura completa adicionando meio DME/F12 fresco com os seguintes ingredientes essenciais: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrin/Selenita de sódio, 0,2% de gl...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2016.">Cancer statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Valent, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+definitions+and+terminology:+the+devil+is+in+the+details.">Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).</li><li>P&#252;tzer, B. M., Solanki, M., Herchenr&#246;der, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cancer+stem+cell+targeting:+How+to+strike+the+evil+at+its+root.">Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).</li><li>Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cancer+Stemness+in+the+Clinic:+From+Hype+to+Hope.">Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope.</a> Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).</li><li>Takaishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gastric+cancer+stem+cells+using+the+cell+surface+marker+CD44.">Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44.</a> Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+cancer+stem+cells+in+tumor+tissues+and+peripheral+blood+derived+from+gastric+adenocarcinoma+patients.">Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients.</a> Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li><li>Hannon, G. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+potential+of+the+human+genome+with+RNA+interference.">Unlocking the potential of the human genome with RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).</li><li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+gene+knockdown+in+mice+using+a+tight,+inducible+shRNA+expression+system.">Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system.</a> Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).</li><li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verteporfin+blocks+Clusterin+which+is+required+for+survival+of+gastric+cancer+stem+cell+by+modulating+HSP90+function.">Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).</li><li>Ohkawa, J., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+functional+activity+of+an+antisense+RNA+by+a+tetracycline-responsive+derivative+of+the+human+U6+snRNA+promoter.">Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.</a> Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).</li></ol>

GC é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Os GCSCs são críticos na recaída do câncer gástrico, metástase e resistência a medicamentos. O uso de GCSCs de pacientes com câncer gástrico nos permitirá explorar seu ponto fraco e desenvolver os medicamentos direcionados para o tratamento de pacientes com GC.
O ensaio de formação de esferas é um método útil para examinar o potencial de auto-renovação das células-tronco do câncer in vitro. Os ...

O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer1. Apesar dos avanços na cirurgia combinada, quimioterapia e radioterapia na terapia GC, o prognóstico permanece ruim e a taxa de sobrevivência de cinco anos ainda é muito baixa2. A recidiva e a metástase são as principais razões que causam as mortes pós-tratamento.
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são um subconjunto de células cancerígenas que possuem a capacidade de se auto-renovar e gerar as diferentes linhagens celulares que reconstituem o tumor3. Acredita-se que os CSCs sejam responsáveis pela recaída do câncer e pela metástase devido às suas capacidades de autoconexão e semeadura de novos tumores, bem como sua resistência à quimioterapia e radioterapias tradicionais4. Portanto, direcionar CSCs e eliminar CSCs fornecem um potencial empolgante para melhorar o tratamento e reduzir a mortalidade de pacientes com câncer.
Os CSCs foram isolados de muitos tipos de tumores sólidos5. Em 2009, células-tronco de câncer gástrico (GCSCs) isoladas das linhas celulares de câncer gástrico humano foram originalmente descritas por Takaishi et al.6. Chen e colegas primeiro identificaram e purificaram GCSCs de tecidos tumorais de adenocarcinoma gástrico humano (GAC)7. Esses achados não apenas proporcionam uma oportunidade de estudar biologia dos GCSCs, mas também fornecem grande importância clínica.
Uma característica particular dos CSCs é sua capacidade de formar uma esfera8. Células únicas são banhadas em condições nãoadherentes em baixa densidade, e apenas as células possuídas com auto-renovação podem crescer em um aglomerado sólido e esférico chamado esfera. Assim, o ensaio de formação da esfera tem sido considerado como o ensaio padrão-ouro e amplamente utilizado para avaliar o potencial de auto-renovação das células-tronco in vitro.
A interferência de RNA (RNAi) é uma poderosa ferramenta de pesquisa para estudar a função genética pela derrubada de um gene específico9. No entanto, tecnologias de knockdown de genes estáveis de longo prazo têm certas limitações, como o desafio de explorar a função de um gene que é essencial para a sobrevivência celular. Sistemas RNAi condicional podem ser úteis para a baixa regulação dos genes desejados de forma temporal e/ou especial controlada pela administração de um agente indutor. Os sistemas induutíveis tetraciclina (Tet) são um dos sistemas condicionais mais utilizados10. Os sistemas indutíveis de Tet podem induzir o silenciamento genético alvo controlando a expressão de shRNA após a adição de um indutor exógeno (preferencialmente doxiciclina, Dox). Os sistemas indutíveis do Tet podem ser divididos em dois tipos: sistemas Tet-On ou Tet-Off. A expressão de shRNA pode ser ligada (Tet-On) ou desligada (Tet-Off) na presença do indutor. No sistema Tet-ON sem um indutor, o repressor Tet (TetR) expresso constitutivamente se liga à sequência de elementos tet-responsivo (TRE) contendo um promotor dependente pol III sensível ao Tet para expressão de shRNA, reprimindo assim a expressão do shRNA. Enquanto, após a adição de Dox, o TetR é sequestrado longe do promotor dependente de Pol III. Isso facilita a expressão do shRNA e leva ao knockdown genético.
O protocolo descrito aqui emprega um sistema de shRNA indutível de tetraciclina funcional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar a função de clusterin em GCSCs derivados do paciente. Clusterin foi identificado como uma molécula-chave nova para manter a hasteza e a sobrevivência dos GCSCs em um estudo anterior11. Utilizamos o protocolo descrito para estudar os efeitos da clusterina na auto-renovação dos GCSCs. Essa metodologia também é aplicável a outros tipos de células-tronco cancerígenas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2068586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Australia</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiviral vector</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>GV307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell Culture/Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>171099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper 1.0 (gag/pol component)</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>pHelper 1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper 2.0 (VSVG component)</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>pHelper 2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>11890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Inverted Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined conditional knockdown and adapted sphere formation assay to study a stemness-associated gene of patient-derived gastric cancer stem cells

As células-tronco cancerígenas (CSCs) estão implicadas na iniciação, desenvolvimento e recidiva do tumor após o tratamento, e tornaram-se o centro de atenção de muitos estudos nas últimas décadas. Por isso, é importante desenvolver métodos para investigar o papel dos genes-chave envolvidos na haste celular cancerosa. O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer. Acredita-se que as células-tronco do câncer gástrico (GCSCs) sejam a raiz da recaída do câncer gástrico, da metástase e da resistência a medicamentos. A compreensão da biologia dos GCSCs é necessária para avançar no desenvolvimento de terapias-alvo e, eventualmente, reduzir a mortalidade entre os pacientes. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

As células-tronco do câncer gástrico do adenocarcinoma gástrico primário foram cultivadas em meio de cultura livre de soro. Após 6 dias, as células se expandiram do fenótipo de célula única(Figura 1A)para formar grandes esferas(Figura 1B).
Para avaliar a função de clusterin em GCSCs, sequências de shRNA contra clusterin e m...

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Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Células-tronco cancerígenas estão implicadas em metástase recaída do câncer na resistência a medicamentos. Este protocolo fornece um método eficiente para investigar as funções dos genes-chave nas células-tronco do câncer. Usando um sistema de knockdown condicional e ensaio de formação de esfera adaptada, este método é facilmente adaptado para estudar funções in vitro e in vivo em genes associados à haste em diferentes tipos de células-tronco cancerosas.Demonstrando o procedimento, estarão Yuting Li e Xiangyu Tan, assistentes de pesquisa do meu laboratório. Para gerar partículas de lentivírus, sementes quatro milhões de células de embalagem lentiviral 293T em uma placa de Petri de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, certificando-se de que as células são 50 a 80% confluentes no dia da transfecção.Leve a temperatura média e ambiente reduzida e prepare os tubos A e B de acordo com as instruções do manuscrito. Adicione o conteúdo do tubo A ao tubo B.Misture bem e incuba o tubo por 15 minutos à temperatura ambiente para preparar complexos lipídicos-DNA. Remova cinco mililitros de meio do prato de cultura celular.Em seguida, adicione cinco mililitros do complexo lipídio-DNA na cultura celular gota sábio e suavemente redemoinho o prato. Incubar o prato de cultura por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, remova cuidadosamente o meio de transfecção e substitua-o por 10 mililitros de DMEM pré-aquecidos complementados com 10% de FBS.Incubar as células por mais 24 horas. Aproximadamente 48 horas após a transfecção, colhe 10 mililitros de lentivírus contendo supernacantes e filtra-os com um filtro de 0,45 micrômetros para remover detritos celulares. Todos os vasos de cultura celular, pontas, filtros e seringas podem conter lentivírus e devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.Transfira um supernatante esclarecido para um recipiente estéril. Adicione o concentrador Lenti-X e misture com a inversão suave. Incubar a mistura a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, centrifugar a amostra a 1500 vezes G por 45 minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o supernasce, tomando cuidado para não perturbar a pelota na parte inferior. Suspenda suavemente a pelota em um mililitro de DMEM suplementado com 10% de FBS e armazene-a a menos 80 graus Celsius.Semente 6 milhões de células-tronco de câncer gástrico ou GCSC's em uma placa de Petri de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS. Cultue as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, aspire o meio do prato e adicione as partículas lentivirais concentradas diluídas com quatro milímetros de meio DMEM completo, contendo reagente polibreno.Devolva as células à incubadora por 18 horas. A polibrene deve ser testada em diferentes condições para determinar a concentração efetiva, que geralmente está na faixa de 2 a 10 miligramas por mililitro. Após 18 horas, substitua o meio por 10 mililitros de DMEM por 10% de FBS e devolva as células à incubadora por 24 horas.Em seguida, aspire o supernaente com os detritos celulares e adicione DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 2,5 microgramas por mililitro de Puromicina. Incubar as células por mais 24 horas. Em seguida, mude o médio novamente para DMEM fresco complementado com 10% FBS e cinco microgramas por mililitro Puromicina.Após outra incubação de 24 horas, enxágue os GCSCs aderentes duas vezes com cinco mililitros de DPBS sem cálcio e magnésio. Dissociar as células com um mililitro de solução de dissociação celular pré-aquecida e incuba-las por dois a três minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione cinco mililitros de médio cultura completa GCSC pré-aquecida fresca à suspensão celular.Distribua três mililitros desta suspensão em um tubo de centrífuga de 15 mililitros para criopreservação, e os outros três mililitros em outro tubo para indução com doxiciclina. Centrifugar ambos os tubos a 800 vezes G por cinco minutos. Em seguida, aspire o supernaente do tubo B e suspenda novamente as células em um mililitro de meio de cultura completa GCSC pré-aquecido fresco.Semente um número apropriado de células em uma nova placa de Petri de 100 milímetros com 10 mililitros de médio cultura completa GCSC pré-aquecido fresco e 2,5 microgramas por doxiciclina mililitro. Em seguida, incubar o prato por 48 horas. Use um contador celular automatizado para determinar a densidade de uma amostra de 10 microliter de células.Em seguida, ajuste o volume com meio de cultura completa GCSC pré-aquecido para obter uma concentração de 20.000 células viáveis por mililitro. Dispense 100 microliters da suspensão celular em cada poço de uma nova placa de cultura de 96 bem-intencionados. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.A formação da esfera deve ocorrer dentro de três a dez dias. Imagem a formação da esfera tumoral a cada dois dias. Células-tronco de câncer gástrico do adenocarcinoma gástrico primário foram cultivadas em meio de cultura livre de soro.Após seis dias, as células expandiram-se do fenótipo unicelular para grandes esferas. Para avaliar a função de clusterin em GCSCs, sequências de RNA de grampo de cabelo curto contra clusterin foram clonadas no vetor Tet-GV307-RFP-Puro. As células transfeinadas com o vetor de expressão foram tratadas com doxiciclina por 48 horas.Em seguida, a expressão de clusterin foi verificada pela mancha ocidental e quantificada por densitometria. A presença de doxiciclina e knockdown de clusterin em GCSCs inibiram a formação da esfera tumoral. Embora nenhuma inibição da formação da esfera tumoral tenha sido observada em células transduzidas com os controles de shRNA mexidos, indicando que a doxiciclina por si só não inibiu a formação da esfera tumoral.Esses resultados sugerem que, após o silenciamento de clusterin, os GCSCs crescem lentamente e não conseguem formar esferas tumorais. Com base nesses dados, a clusterina desempenha um papel fundamental na promoção da atividade de autoconexão dos GCSCs, indicando que pode ser um alvo promissor para suprimir células-tronco cancerígenas em pacientes com câncer gástrico. As esferas tumorais devem ser estruturas redondas sólidas em células individuais ou agregadas, não devem ser consideradas esferas tumorais.No entanto, algumas células-tronco cancerígenas podem não formar estruturas típicas da esfera tumoral. Este procedimento pode ser seguido com outros métodos para examinar células-tronco cancerígenas para potencial renovável in vitro. Por exemplo, a expressão de marcadores relacionados à haste pode ser estudada.O protocolo pode ser estendido para estudar as funções dos genes críticos em células-tronco cancerosas, como a stemness sobre a sobrevivência.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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