Name: combined conditional knockdown and adapted sphere formation assay to study a stemness-associated gene of patient-derived gastric cancer stem cells
Uploaded: 2020-05-09T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de la Provincia de Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), la Fundación de Investigación Científica Médica de la provincia de Guangdong (A2019405), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772957), la Science y Programa de Tecnología de la Provincia de Guangdong en China (2017B030301016), y la Fundación de Industria y Tecnología de la Información de Shenzhen (20180309100135860).

Toda experimentación utilizando células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente descritas en este documento fue aprobada por el comité ético local7.
1. Cultivo de células madre de cáncer gástrico
<ol><li>Preparación de los GCSC medio de cultivo completo<ol>
<li>Preparar el medio de cultivo completo de los GCSC añadiendo un medio fresco DME/F12 con los siguientes ingredientes esenciales: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrina/Selenita ...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2016.">Cancer statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Valent, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+definitions+and+terminology:+the+devil+is+in+the+details.">Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).</li><li>P&#252;tzer, B. M., Solanki, M., Herchenr&#246;der, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cancer+stem+cell+targeting:+How+to+strike+the+evil+at+its+root.">Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).</li><li>Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cancer+Stemness+in+the+Clinic:+From+Hype+to+Hope.">Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope.</a> Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).</li><li>Takaishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gastric+cancer+stem+cells+using+the+cell+surface+marker+CD44.">Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44.</a> Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+cancer+stem+cells+in+tumor+tissues+and+peripheral+blood+derived+from+gastric+adenocarcinoma+patients.">Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients.</a> Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li><li>Hannon, G. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+potential+of+the+human+genome+with+RNA+interference.">Unlocking the potential of the human genome with RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).</li><li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+gene+knockdown+in+mice+using+a+tight,+inducible+shRNA+expression+system.">Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system.</a> Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).</li><li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verteporfin+blocks+Clusterin+which+is+required+for+survival+of+gastric+cancer+stem+cell+by+modulating+HSP90+function.">Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).</li><li>Ohkawa, J., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+functional+activity+of+an+antisense+RNA+by+a+tetracycline-responsive+derivative+of+the+human+U6+snRNA+promoter.">Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.</a> Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).</li></ol>

GC es la tercera causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Los GCSC son críticos en la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. El uso de GCSC de pacientes con cáncer gástrico nos permitirá explorar su punto débil y desarrollar los medicamentos de orientación para el tratamiento de pacientes con GC.
El ensayo de formación de la esfera es un método útil para examinar el potencial de auto-renovación de células madre cancero...

El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales1. A pesar de los avances en la cirugía combinada, la quimioterapia y la radioterapia en la terapia de GC, el pronóstico sigue siendo pobre y la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo muy baja2. La recurrencia y la metástasis son las principales razones por las que las muertes después del tratamiento.
Las células madre cancerosas (CSC) son un subconjunto de células cancerosas que poseen la capacidad de autorre renovarse y generar los diferentes linajes celulares que reconstituyen el tumor3. Se cree que las CSC son responsables de la recaída del cáncer y la metástasis debido a sus capacidades de auto-renovación y siembra de nuevos tumores, así como su resistencia a las quimios y radioterapias tradicionales4. Por lo tanto, la orientación a las CSC y la eliminación de las CSC proporcionan un potencial emocionante para mejorar el tratamiento y reducir la mortalidad de los pacientes con cáncer.
Los CSC se han aislado de muchos tipos de tumores sólidos5. En 2009, las células madre de cáncer gástrico (GCSC) aisladas de las líneas celulares de cáncer gástrico humano fueron descritas originalmente por Takaishi et al.6. Chen y sus colegas identificaron y purificaron en primer lugar los GCSC a partir de tejidos tumorales de adenocarcinoma gástrico humano (GAC)7. Estos hallazgos no sólo proporcionan una oportunidad para estudiar la biología de los GCSC, sino que también proporcionan una gran importancia clínica.
Una característica particular de las CSC es su capacidad para formar una esfera8. Las células individuales se chapan en condiciones no adherentes a baja densidad, y solo las células poseídas con la auto-renovación pueden crecer hasta convertirse en un grupo sólido y esférico llamado esfera. Por lo tanto, el ensayo de formación de la esfera ha sido considerado como el ensayo estándar de oro y ampliamente utilizado para evaluar el potencial de auto-renovación de células madre in vitro.
La interferencia de ARN (ARNi) es una poderosa herramienta de investigación para estudiar la función genética mediante el derribo de un gen específico9. Sin embargo, las tecnologías de derribo de genes estables a largo plazo tienen ciertas limitaciones, como el desafío de explorar la función de un gen que es esencial para la supervivencia celular. Los sistemas de ARNi condicional pueden ser útiles para la regulación descendente de los genes deseados de manera temporal y/o controlada especial por la administración de un agente inductor. Los sistemas inducibles de tetraciclina (Tet) son uno de los sistemas de ARNi condicional más utilizados10. Los sistemas inducibles Tet pueden inducir el silenciamiento del gen diana controlando la expresión de ARNh tras la adición de un inductor exógeno (preferentemente doxiciclina, Dox). Los sistemas inducibles Tet se pueden dividir en dos tipos: sistemas Tet-On o Tet-Off. La expresión de arnesco se puede activar (Tet-On) o desactivarla (Tet-Off) en presencia del inductor. En el sistema Tet-ON sin un inductor, el represor Tet (TetR) expresa constitutivamente se une a la secuencia del elemento sensible al Tet (TRE) que contiene un promotor dependiente de Pol III sensible a Tet para la expresión de ARNH, reprimiendo así la expresión del arnesón. Mientras que después de la adición de Dox, el TetR es secuestrado lejos del promotor dependiente de Pol III con respuesta tet. Esto facilita la expresión del ARNN y conduce a la reducción genética.
El protocolo descrito aquí emplea un sistema funcional de ARNN inducible de tetraciclina y un ensayo de formación de esferas adaptada para estudiar la función de clusterin en GCSC derivados del paciente. Clusterin ha sido identificado como una nueva molécula clave para mantener el tallo y la supervivencia de los GCSC en un estudio anterior11. Utilizamos el protocolo descrito para estudiar los efectos de clusterin en la auto-renovación de GCSC. Esta metodología también es aplicable a otros tipos de células madre cancerosas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2068586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Australia</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiviral vector</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>GV307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Concentrator</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell Culture/Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>171099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper 1.0 (gag/pol component)</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>pHelper 1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper 2.0 (VSVG component)</td>
			<td>GeneChem</td>
			<td>pHelper 2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>11890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Inverted Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined conditional knockdown and adapted sphere formation assay to study a stemness-associated gene of patient-derived gastric cancer stem cells

Las células madre cancerosas (CSC) están implicadas en la iniciación, el desarrollo y la recurrencia de tumores después del tratamiento, y se han convertido en el centro de atención de muchos estudios en las últimas décadas. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos para investigar el papel de los genes clave involucrados en el tallo de las células cancerosas. El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales. Se cree que las células madre del cáncer gástrico (GCSC) son la raíz de la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. Comprender la biología de los GCSC es necesario para avanzar en el desarrollo de terapias dirigidas y eventualmente para reducir la mortalidad entre los pacientes. En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.

Las células madre del cáncer gástrico del adenocarcinoma gástrico humano primario se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero. Después de 6 días, las células se expandieron desde el fenotipo similar a una célula única (Figura 1A) para formar esferas grandes (Figura 1B).
Para evaluar la función de clusterin en GCSC, las...

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Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.

Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Las células madre cancerosas están implicadas en la metástasis recidivante del cáncer en la resistencia a los medicamentos. Este protocolo proporciona un método eficaz para investigar las funciones de los genes clave en las células madre cancerosas. Utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas, este método se adapta fácilmente para estudiar las funciones in vitro e in vivo en genes asociados a la stemness en diferentes tipos de células madre cancerosas.Demostrando el procedimiento, Yuting Li y Xiangyu Tan, asistentes de investigación de mi laboratorio. Para generar partículas de lentivirus, siembra cuatro millones de células de envasado lentiviral 293T en un plato Petri de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS. Incubar las células durante la noche a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono, asegurándose de que las células sean de 50 a 80% confluentes el día de la transfección.Lleve un medio sérico reducido a temperatura ambiente y prepare los tubos A y B de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Añadir el contenido del tubo A al tubo B.Mix bien e incubar el tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente para preparar complejos de lípidos-ADN. Retire cinco mililitros de medio del plato de cultivo celular.Luego agregue cinco mililitros del complejo de lípidos-ADN en el plato de cultivo celular gota sabia y suavemente remolino el plato. Incubar el plato de cultivo durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Después de la incubación, retire cuidadosamente el medio de transfección y reemplácelo con 10 mililitros de DMEM precalentó complementados con 10%FBS.Incubar las células durante otras 24 horas. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, cosechar 10 mililitros de lentivirus que contienen sobrenadantes y filtrarlos con un filtro de vertido de 0,45 micrómetros para eliminar los desechos celulares. Todos los recipientes de cultivo celular, puntas, filtros y jeringas pueden contener lentivirus y deben tratarse con 10% de lejía antes de su eliminación.Transfiera un sobrenadante clarificado a un recipiente estéril. Agregue el concentrador Lenti-X y mezcle con una inversión suave. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, centrifugar la muestra a 1500 veces G durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Retire cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar el pellet en la parte inferior. Re-suspender suavemente el pellet en un mililitro de DMEM complementado con 10%FBS y almacenarlo en menos 80 grados Celsius.Semilla 6 millones de células madre de cáncer gástrico o GCSC en un plato petri de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS. Cultivo de las células durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Cuando las células alcanzan 70 a 80%confluencia, aspirar el medio del plato y añadir las partículas lentivirales concentradas diluidas con cuatro milímetros de medio DMEM completo, que contienen reactivo de polibreno.Devuelva las células a la incubadora durante 18 horas. Polibreno debe ser probado en diferentes condiciones para determinar la concentración efectiva, que generalmente está en el rango de dos a 10 miligramos por mililitro. Después de 18 horas, reemplace el medio con 10 mililitros de DMEM con 10%FBS y devuelva las células a la incubadora durante 24 horas.Luego, aspirar el sobrenadante con los desechos celulares y añadir DMEM fresco complementado con 10%FBS y 2.5 microgramos por mililitro de Puromicina. Incubar las células durante otras 24 horas. Entonces, cambiar el medio de nuevo a DMEM fresco complementado con 10%FBS y cinco microgramos por mililitro Puromicina.Después de otra incubación de 24 horas, enjuague los GCSC adherentes dos veces con cinco mililitros de DPBS sin calcio y magnesio. Disociar las células con un mililitro de solución de disociación celular precalentada e incubarlas durante dos a tres minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue cinco mililitros de medio de cultivo completo GCSC precalentó fresco a la suspensión celular.Dispensar tres mililitros de esta suspensión en un tubo centrífugo de 15 mililitros para criopreservación, y los otros tres mililitros en otro tubo para la inducción con doxiciclina. Centrifugar ambos tubos a 800 veces G durante cinco minutos. A continuación, aspirar el sobrenadante del tubo B y volver a suspender las células en un mililitro de medio de cultivo completo GCSC precalentado fresco.Siembra un número adecuado de células en un nuevo plato petri de 100 milímetros con 10 mililitros de medio de cultivo completo GCSC precalentado fresco y 2,5 microgramos por mililitro de doxiciclina. Luego, incuba el plato durante 48 horas. Utilice un contador de celdas automatizado para determinar la densidad de una muestra de 10 microlitro de células.A continuación, ajuste el volumen con un medio de cultivo completo GCSC precalegado para obtener una concentración de 20.000 células viables por mililitro. Dispensar 100 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de una nueva placa de cultivo de 96 pozos de fijación ultra baja. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.La formación de la esfera debe ocurrir dentro de tres a 10 días. Imagen de la formación de la esfera tumoral cada dos días. Las células madre del cáncer gástrico del adenocarcinoma gástrico humano primario se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero.Después de seis días, las células se expandieron desde el fenotipo similar a una célula hasta las esferas grandes. Para evaluar la función de clusterin en GCSC, se clonaron secuencias cortas de ARN de horquilla contra clusterin en el vector Tet-GV307-RFP-Puro. Las células transfectosas con el vector de expresión fueron tratadas con doxiciclina durante 48 horas.Entonces, la expresión clusterin fue verificada por Western blot y cuantificada por densitometría. La presencia de doxiciclina y la reducción de clusterin en los GCSC inhibió la formación de esferas tumorales. Si bien no se observó inhibición de la formación de esferas tumorales en células transducidas con los controles de ARNH revueltos, lo que indica que la doxiciclina por sí sola no inhibió la formación de esferas tumorales.Estos resultados sugieren que después del silenciamiento de clusterin, los GCSC crecen lentamente y no pueden formar esferas tumorales. Sobre la base de estos datos, clusterin desempeña un papel fundamental en la promoción de la actividad de auto-renovación de los GCSC, lo que indica que podría ser un objetivo prometedor de fármaco para suprimir las células madre cancerosas en pacientes con cáncer gástrico. Las esferas tumorales deben ser estructuras redondas sólidas en células individuales o agregadas, no deben considerarse esferas tumorales.Sin embargo, es posible que algunas células madre cancerosas no formen estructuras típicas de la esfera tumoral. Este procedimiento se puede seguir con otros métodos para examinar las células madre cancerosas en busca de potencial renovable in vitro. Por ejemplo, se puede estudiar la expresión de marcadores relacionados con la stemness.El protocolo se puede ampliar para estudiar las funciones de los genes críticos en las células madre cancerosas como el tallo en la supervivencia.

Research

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