Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل JSPS KAKENHI أرقام المنح JP19H03202 إلى A.M. JP18H05528 وJP17H03636 إلى T.H.، وJP17H01444 وJP18H055533 إلى H.Y. L.S. يعترف بالدعم من قبل جوائز الترحيب الاستئماني الاستراتيجية 091911 و 107457/Z/15/Z تمويل التصوير المتقدم في ميكرون أكسفورد.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

إن إجراء التصحيح اللوني هو مفاضلة بين الدقة والجهد. لتوفير الجهود التي لا داعي لها، من الأفضل أن تعرف مدى الدقة المطلوبة لدراستك. قد لا تكون هناك حاجة إلى أعلى دقة للتصوير التقليدي الواسع المجال (الحي)، وبالتالي، فإن الصور المرجعية الميدانية الساطعة غالباً ما تكون كافية لتصحيح التحول اللوني. وبالمثل، عندما تكون حالة التصوير والبيئة ثابتة، فإن الاستخدام المتكرر للمعايرة البيولوجية سيوفر الوقت. من ناحية أخرى، إذا كان المطلوب تسجيل دقيقة للغاية، وتقاطع عالي الجودة أو الصور المرجعية المعايرة البيولوجية ضرورية. للحصول على أفضل أداء، يجب الحصول على الصور المرجعية مع ظروف وتوقيتات مماثلة مثل الصور المستهدفة قدر الإمكان. طالما يتم الحصول على كل من الصور المرجعية والهدف من قبل نفس المجهر، وارتفاع دقة المكانية تحسين دقة التصحيح. إذا كان deconvolution متاح لكل من الصور المرجعية والهدف، ثم تنفيذ هذا قبل التصحيح قد يحسن دقة التصحيح. أيضا، للحصول على أفضل أداء، ينبغي أن تتحقق نظرية أخذ العينات لمحور (Z) البصرية في كل من الملف المرجعي والمستهدف لالتدبول subpixel دقيقة (البروتوكول الخطوة 2.1.3).
الفشل في تصحيح التحول لوني يؤدي إلى استنتاجات غير صحيحة. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي استخدام المعايرة الخاطئة إلى تفاقم التحولات اللونية بدلاً من تصحيحها، وبالتالي يجب تجنب ذلك. وقد لخصنا الأسباب المحتملة للإخفاقات، وحلولها المشتركة، في الجدول 2. لفحص سبب فشل، في المقام الأول، من الضروري التحقق من صحة إزاحة اللونية في الصورة المرجعية بدقة (الخطوة بروتوكول 3.12). معظم الإخفاقات هي نتيجة لجودة الصور المرجعية ويتم علاجها بسهولة وفقا للأوصاف الواردة في الجدول 2. فيما يتعلق بنوعية الصور المرجعية، من المهم ملاحظة أن دقة المحاذاة العالمية تقل إذا لم يتم ملء مجال الرؤية بأكمله بالعينة(الشكل 7، الجدول 2). بالمقارنة مع المثال الجيد الموضح في الشكل 7A، فإن المثال السيئ الموضح في الشكل 7B يحتوي على ثلاثة مغلفات نووية فقط في المنطقة اليسرى العليا ، وفشل كروماغنون في محاذاة جزء من هذه الصورة. وذلك لأن أسلوب المحاذاة العالمية من Chromagnon يقسم مجال الرؤية إلى أربع مناطق (الشكل 7C) من أجل قياس الاختلافات في التناوب والتكبير مع دقة عالية3. هذه الطريقة، إذا تم تشغيلها بشكل صحيح، هي أمر واحد أكثر دقة من الطرق الخطية الأخرى مثل تحويل السجل القطبي وأساليب بسيطة3. إذا كانت أي من المناطق الأربعة غير متوفرة، ثم سوف Chromagnon التحول إلى أساليب خطية أقل فعالية. لذلك، للحصول على أفضل أداء الأمثلة الموضحة في الشكل 7B الشكل 7C غير مرغوب فيها، ويجب أن تكون المناطق الأربعة مليئة الكائنات. يمكن للمستخدمين التحقق مما إذا كانت أي منطقة تربيعية من حقل الرؤية غير متوفرة للقياس من خلال النظر إلى ملف السجل ("Chromagnon.log"؛ انظر خطوة البروتوكول 3.10). لحسن الحظ، يمكن التغلب على هذه المشكلة بسهولة عن طريق حساب متوسط صور المعايرة البيولوجية متعددة أو باستخدام المحاذاة المحلية لتقاطع أو الصور المرجعية في الميدان الساطع(الجدول 2). على عكس حالة عدم تصحيح الصور المرجعية، يصعب تحديد عدم تصحيح الصور المستهدفة. لأن مثل هذه الإخفاقات تنشأ بسبب الاختلافات في تنسيقات الملفات، وظروف التصوير، وتوقيت التصوير، وأساليب التصوير/المحاذاة بين الصور المرجعية والصور المستهدفة(الجدول 2)،يجب على المستخدمين أن يكونوا حذرين دائمًا عند استخدام الصور المرجعية التي يتم الحصول عليها في ظروف/توقيتات مختلفة من الصور المستهدفة. بعض الصور على سبيل المثال متاحة للاختبار (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>) للحصول على فكرة ملموسة عن الصور الجيدة والسيئة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>المشكله</td>
			<td>يسبب</td>
			<td>حل</td>
		</tr>
<tr>
<td>فشل تصحيح الصورة المرجعية</td>
			<td>تباين منخفض</td>
			<td>الحصول على صورة التباين العالي إذا كان ذلك ممكناً. إذا تم استخدام صورة مرجعية حقل مشرق، إعادة اكتساب الصورة في حل المياه المستندة إلى الحصول على التباين أعلى من الخلية. بدلا من ذلك، حاول تطبيق الحد من الضوضاء الحسابية (على سبيل المثال، تصفية الغاوسيين). إيقاف تشغيل المحاذاة المحلية، والتي هي أكثر حساسية للضوضاء.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>تلوث الصور غير ذات الصلة</td>
			<td>إزالة مصدر الصور غير ذات الصلة في العينة إذا كان ذلك ممكنا. للحصول على الصور المرجعية عبر، تحقق من أطياف الإثارة من الأصباغ المستخدمة للصور الهدف. إذا كانت الأصباغ متحمسة أثناء الحصول على صورة عبر الحديث (مثل أليكسا فلور 568 أو 594) ، ففكر في الأصباغ الأخرى (مثل أليكسا فلور 555). إذا كان الغبار على رقاقة الكاميرا يخلق اختلاف قناة واضحة، تنظيف رقاقة الكاميرا أو استخدام طريقة مسطحة فيلدينغ الحسابية.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>بقعة ساطعة للغاية التي أدلى بها شعاع الكونية</td>
			<td>الحصول على الصورة مرة أخرى إذا كان ذلك ممكنا. بدلاً من ذلك، حاول تطبيق الحد من الضوضاء الحسابية (على سبيل المثال، تصفية الوسيط أو الغاوسي).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>القطع الأثرية للفك (إشارات اصطناعية عند الحواف المحورية والحافات الجانبية)</td>
			<td>تقليم مقاطع بيكسل الحواف أو مقاطع Z بعد إلغاء الفوط. إذا تم تشذيب أحد الجانبين، فيجب أيضًا اقتطاع الجانب الآخر للحفاظ على مركز الصور.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>حجم الخطوة Z متفرق جدا</td>
			<td>يجب الحصول على رصة Z للوفاء بمعيار Nyquist كما هو مكتوب في البروتوكول 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>انحراف بصري</td>
			<td>الانحراف الكروي هو الانحراف الرئيسي الذي يسببه المستخدمون. اختيار عدسة الهدف الصحيح للعينة واستخدام سمك غطاء من 170 ميكرومتر. إذا تم تجهيز العدسة الهدف مع حلقة التصحيح، وضبطها للعثور على الموقف حيث يتم الحصول على أعلى عدد الفلوريسنس من التركيز. في حالة وجود هدف الغمر النفط دون حلقة التصحيح، وضبط معامل الانكسار من زيت الغمر الذي يزيد من العد الفلوريسنس في التركيز.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>مجال الرؤية غير شاغر (الشكل 7)</td>
			<td>في حالة الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية، متوسط العديد من الصور. في حالة من الصور المرجعية أو المجال الساطع، استخدم المحاذاة المحلية.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>خطأ برنامج غير معروف</td>
			<td>الإبلاغ عن المشكلة من خلال GitHub (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>فشل تصحيح الصورة الهدف</td>
			<td>يتم فقدان بيانات التعريف لملف الصورة</td>
			<td>استخدام تنسيق ملف المجهر الأصلي الذي يحتوي على بيانات تعريف كاملة، وتجنب تحويل إلى ملف tiff متعددة الصفحات قبل المعالجة. استخدم نفس ترتيب القنوات كما هو مكتوب في البروتوكول 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>طرق محاذاة خاطئة للمجهر المعطى</td>
			<td>لا تطبق طريقة المحاذاة المحلية عند القياس من الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية إلى الصور المستهدفة. لا تستخدم الصور المرجعية عبر التوك اغير من المجهر واسع المجال.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>الاختلافات في ظروف التصوير</td>
			<td>الاحتفاظ بـ شروط التصوير ثابتة بين المرجع والصور الهدف كما هو مكتوب في البروتوكول 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>الاختلافات في العينة (بما في ذلك غطاء)</td>
			<td>دائما استخدام نفس المتوسطة المتصاعدة، coverlip (على سبيل المثال. 1.5H) وعمق مماثل من التركيز.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>المجهر الانجراف منذ تم إجراء آخر معايرة</td>
			<td>إجراء معايرة في كثير من الأحيان كما كل أسبوعين. الحفاظ على درجة الحرارة ثابتة، واستخدام طاولة عائمة لتجنب الانجراف الأجهزة من المجهر.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: استكشاف الأخطاء وإصلاحها من أجل التصحيح اللوني.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> الشكل 7: أمثلة على الصور المرجعية. المغلف النووي في خلايا الخميرة الانشطار المسمى مع GFP وmcherry. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر التقليدي واسع المجال. تم تصحيح التحولات اللونية باستخدام Chromagnon دون محاذاة محلية باستخدام الصور نفسها كصور مرجعية. ثم تم فك تفكيك الصور لإظهار التفاصيل. (أ) مثال جيد مع العديد من الكائنات في مجال الرؤية. (B) مثال سيئ مع الكائنات فقط في الزاوية العلوية اليسرى. عدم المحاذاة واضح في منطقة معينة من الصورة. (C) مثال غير مرغوب فيه حيث يكون أحد الـ quadrisection (مفصول بخطوط منقطة) فارغًا. يشير شريط المقياس في اللوحة A إلى 5 ميكرومتر للعرض الميداني الكامل و1.25 ميكرومتر للعرض الموسع وينطبق على جميع اللوحات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في هذا البروتوكول، وصفنا ثلاثة أنواع مرجعية مختلفة(الجدول 1). ومن بينها، تحتاج الصور المرجعية عبر الحوار والصور المرجعية للمعايرة البيولوجية إلى مزيد من المناقشة الدقيقة. للصور المرجعية عبر التوك، يمكن استخدام عينات ملطخة DAPI أو Hoechst 33342، وشنت في الجلسرين أو الوسائط التجارية تصاعد بكفاءة لمحاذاة القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. وبالمثل، يمكن استخدام أليكسا فلور 488 لمحاذاة القنوات الخضراء والأحمر. ومع ذلك ، فإن الحصول على الفلورس الحديث المتبادل غالبًا ما يكون صعبًا لأن العديد من الأصباغ الزرقاء باستثناء DAPI و Hoechst باهتة وتسوس أسرع من معظم الأصباغ الخضراء والحمراء. وعلاوة على ذلك، فإن أطياف انبعاث الأصباغ الحديثة أضيق، مما يجعل محاذاة أكثر من ثلاث قنوات بهذه الطريقة صعبة. وينبغي أيضا إيلاء الاهتمام لبعض الأصباغ الحمراء الشائعة (على سبيل المثال، اليكسا دقيق 568 و 594، ولكن ليس اليكسا فلور 555) التي يمكن أن تكون متحمس من قبل الضوء البنفسجي، والتي تمنع الحصول على صور عبر التباين عالية من الأصباغ الزرقاء. عيب آخر هو أن هذه الطريقة لا يمكن قياس انحراف لوني من مسارات الضوء الإثارة في الإثارة متعددة الألوان، لأنه يتم استخدام الطول الموجي واحد فقط الإثارة للإثارة(الجدول 1). كما يستخدم معظم المجهرية المتقدمة البصريات الإضاءة المعدلة، وتطبيق هذه الطريقة محدودة. ومع ذلك، فإن دقة التصحيح الأعلى لها مفيدة بما فيه الكفاية لكي يتم وصفها في هذا البروتوكول. بشكل عام، يجب التقاط صورة عبر الحديث بعد صورة الهدف لمنع التبييض أو الآثار الضوئية. بالنسبة لـ SMLM التي تمت ملاحظتها مع وضع المجال الواسع، يجب الحصول على صورة مرجعية قبل الحصول على صورة مستهدفة حيث يمكن تبييض الأصباغ الفلورية أثناء التصوير.
تسمح الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية للمستخدمين بمحاذاة أي عدد من القنوات المرغوب فيه بسهولة على حساب إعداد عينة إضافية. ومن المزايا الأخرى للصور المرجعية للمعايرة البيولوجية توافر مراجع متعددة "متوسط" تساعد على ملء جميع مجالات الرؤية. قد تعاني هذه الطريقة من الاختلافات في ظروف التصوير إذا تم إعداد عينة المعايرة على شريحة مختلفة. ويمكن حل معظم هذه المشكلة إذا تم إعداد كل من الأهداف والمراجع على نفس الشريحة باستخدام نظارات غطاء تجارية(الجدول 1)،وتبقى ظروف التصوير الأخرى ثابتة كما هو الحال في الخطوة بروتوكول 2.3.3. في هذه الحالة، يمكن توقع دقة تصحيح مشابهة لتلك التي من الصور المرجعية عبر التوك يمكن توقع3. بروتوكول لاستخدام phalloidin كما هو مبين هنا هي واحدة من أسهل الطرق لطخة بنية خلوية واحدة مع ألوان متعددة. هناك العديد من السيناريوهات الممكنة لإعداد عينات المعايرة البيولوجية. بالنسبة للمناعة، يمكن تسمية العينة بواسم مضاد أولي واحد متبوعاً بصبغة مع أجسام مضادة ثانوية ذات ألوان متعددة. بهذه الطريقة، يمكن تسمية بنية هدف واحد بألوان متعددة. بدلا من ذلك، 5-ethynyl-2'-deoxyuridine، التي اكتشفتها "انقر" تسميات الكيمياء توليفها حديثا الحمض النووي في ألوان متعددة في كثافة عالية، كما هو موضح في التفاصيل سابقا8. للخلايا الحية، من المفيد إعداد سلالة محورة وراثيا إيواء نسختين من الجينات التي تنصهر إلى GFP أو mCherry لتسمية نفس الهيكل مع اثنين من الألوان. إذا كان عدد نسخة الجين حرجة كما لوحظ في كثير من الأحيان للبروتينات الغشاء، يمكن أن تكون نسخة واحدة من الجين تنصهر جنبا إلى جنب إلى GFP و mCherry(الشكل 7). ويمكن أيضاً استخدام البروتينات الفلورية القابلة للإضاءة الضوئية، مثل mEOS218،عن طريق إضاءة مستوى معتدل من الضوء البنفسجي للحصول على كل من أنواع البروتينات مع أو بدون تحويل ضوئي. في ظل ظروف منخفضة من الأكسجين، يمكن أيضا أن تستخدم GFP كبروتين تحويل ضوئي من الأخضر إلى الأحمر19،20. وبالتالي فإن اختيار عينة المعايرة الصحيحة سيجعل التجربة أكثر قوة.

التصوير متعدد الألوان هو أحد الجوانب الأساسية للمجهر الفلوري البيولوجي، في الحالات التي تكون فيها العلاقة المكانية بين جزيئات أو هياكل مختلفة ذات أهمية كبيرة. انحراف لوني، انحراف بصري للضوء متعدد الألوان الناجم عن التشتت، يغير الموقف الظاهر للكائنات الملونة ذات الأهمية. وبالمثل، فإن المجاهر المجهزة بكاميرات متعددة مكرسة للحصول على كل لون لها تحولات لوني أكثر تعقيدا بسبب الاختلافات في العناصر البصرية والمحاذاة غير الكاملة بين القنوات. وهكذا، قد تؤدي هذه التحولات اللونية إلى استنتاج كاذب ما لم يصححها المستخدم صراحة. على الرغم من أن التحولات اللونية لم تكن مشكلة رئيسية طالما أن حل المجهر محدود بالحد الكلاسيكي من الدقة ، إلا أن التطور الأخير للمجهر فائق الدقة1 قد دفع إلى الحاجة إلى تصحيح أكثر دقة للتحولات اللونية.
وقد كانت ممارسة شائعة لقياس التحولات لوني من أنظمة المجهر باستخدام شريحة معايرة متعددة الألوان حبة2. طريقة المعايرة القائمة على الخرز مناسبة لقياس التحولات اللونية من بصريات المجهر بأكملها نحو سطح الغطاء2. غير أن هذه الطريقة غير قادرة على قياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية ذات الأهمية. ومن المهم ملاحظة أن العديد من العينات البيولوجية ثلاثية الأبعاد (3D)، وتختلف التحولات اللونية لهذه العينات عن تلك الموجودة على سطح الغطاء. وعلاوة على ذلك، يتغير التحولات اللونية مع ظروف التصوير2،3. لقد قمنا بقياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية ثلاثية الأبعاد ووجدنا أن عدم اليقين في التحولات اللونية كان في كثير من الأحيان 350 نانومتر بواسطة الطريقة الكلاسيكية متعددة الألوان - الخرزة معايرة3. لذلك، يجب قياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية في عمق الفائدة وتحت ظروف التصوير المستخدمة.
هنا، ونحن وصف إجراءات لقياس التحولات لوني في العينات البيولوجية وتصحيح هذه التحولات باستخدام برنامجنا، Chromagnon3. لقياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية، تستخدم طريقتنا نوعين من مجموعات البيانات، صورة "الهدف" وصورة "مرجعية". صورة "الهدف" هي صورة متعددة الألوان ذات أهمية ، على سبيل المثال ، صور ملطخة للحمض النووي ، والمغلف النووي ، والميكروتوبات. غالباً ما يكون من المستحيل قياس التحولات اللونية في مثل هذه الصورة. لذلك، نحن بحاجة إلى صورة "مرجعية" مخصصة لقياس التحولات اللونية في العينة. التعريف الوحيد لصورة "مرجع" هو صورة متعددة الألوان لنفس الكائن. في هذا المعنى ، فإن صورة حبات متعددة الألوان هي أيضًا نوع من الصور المرجعية. هنا، نحن وصف ثلاثة أنواع مختلفة من الصورة المرجعية التي تستخدم لقياس التحولات لوني في العينات البيولوجية: "الصور المرجعية عبر" و "الصور المرجعية مشرق المجال" و "الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية". يعتمد نوع الصورة المرجعية على نوع المجهر المستخدم أو دقة التصحيح المطلوبة كما هو ملخص في الجدول 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>عبر الحديث</td>
			<td>حقل مشرق</td>
			<td>المعايرة البيولوجية (على شريحة مختلفة)</td>
			<td>المعايرة البيولوجية (على الشريحة نفسها)</td>
		</tr>
<tr>
<td>دقةa
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++ب
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>البساطه</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>المجهر القابل للتطبيق</td>
			<td>مجال واسع</td>
			<td>مجال واسع</td>
			<td>جميع</td>
			<td>جميع</td>
		</tr>
<tr>
<td>توفر المحاذاة المحلية</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-ج
</td>
			<td>-ج
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a:عدد "+" يشير إلى زيادة التصنيف. زائد واحد حوالي 50 نانومتر وثلاثة زائد حوالي 15 نانومتر في 3D. ب: تعتمد الدقة على مدى ثبات ظروف التصوير المتغيرة. ج:يمكن الجمع بين المعايرة المحلية التي تقاس من عينات حبة متعددة الألوان كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: المعلمات عند اختيار نوع الصور المرجعية.
"الصور المرجعية عبر الحوار" لديها أعلى دقة التصحيح وبسيطة نسبيا لإنجاز3،4 (الجدول 1). العيب هو الحد من تطبيقات المجهر بسبب عدم قدرتهم على قياس التحولات اللونية في مسارات الإثارة. أيضا، للحصول على مثل هذه الصور، ينبغي أن تكون مجهزة المجهر مع مرايا متعددة النطاقات dichroic، ومرشحات الانبعاثات التي يتم التحكم فيها بشكل مستقل من مرشحات الإثارة أو مصادر الضوء. يتضمن المجهر المناسب المجهر التقليدي واسع المجال ، والمجهر توطين جزيء واحد (SMLM) مثل المجهر التعريب تنشيط الصور / العشوائية المجهرية إعادة الإعمار البصرية (بالم / STORM)5،6 والمجهر التوسع7 لوحظ مع المجهر واسعة المجال. يتم الحصول على صورة مرجعية عبرية من العينة الهدف نفسه. بل هو صورة من crosstalk (من خلال نزيف) التألق من صبغة تم الحصول عليها في جميع القنوات المطلوبة. الانبعاثات Fluorescence دائماً يتوسع نحو أطوال موجية أطول، وبالتالي الأصباغ مع أقصر طول موجة الانبعاثات متحمسون للحصول على الفلورين ة عبر الTalk في قنوات أطول أطوال موجية. على سبيل المثال، عندما تكون العينة ملطخة باللون الأزرق والأخضر والأحمر، فإن الصبغة الزرقاء فقط هي المُتحمسة، ويتم الحصول على ضوء الانبعاثات في القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. في هذا البروتوكول، الحمض النووي ملطخة 4′، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) تم استخدامها للحصول على التألق عبر.
"مشرق الميدان المرجعي الصور" هي أسهل وأقل phototoxic بديل "عبر الحديث عن الصور المرجعية" ولكن هي أقل دقيقة3 (الجدول 1). هذه هي صور حقل مشرق من العينة المستهدفة، المكتسبة في جميع قنوات اللون المستخدمة في الصورة المستهدفة.
"الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية" لها ميزة كونها قابلة للتطبيق على أي نوع من المجهر نظرا لقدرتها على قياس التحولات اللونية سواء في الإثارة ومسارات الانبعاثات3،8 (الجدول 1). المجهر مناسبة تشمل المجهر واسعة المجال، المجهري confocal، المجهر ورقة ضوء، حفز استنفاد الانبعاثات (STED)9، هيكل المجهر الإضاءة (SIM)10، Airyscan / SORA11،12، SMLM لاحظت مع الانعكاس الداخلي الكلي الفلورية (TIRF) الوضع ، أوليمبوس فائقة القرار (OSR)13، وهكذا دواليك. يتم الحصول على صورة مرجعية للمعايرة البيولوجية من عينة معايرة أعدت بنفسها كعينة الهدف، ولكن مع تلطيخ هيكل واحد مع ألوان متعددة. دقة التصحيح تتفوق على قرار معظم المجهر فائقة الدقة وإعداد عينة المعايرة البيولوجية يمكن أن تكون بسيطة نسبيا. ميزة أخرى هي توافر "متوسط" الصور المرجعية المتعددة. ولذلك، على الرغم من أن الصور الفردية تحتوي على معلومات رديئة لقياس التحولات اللونية، يمكن زيادة محتوى المعلومات عن طريق حساب متوسط صور متعددة. تعتمد الدقة على مدى ثبات ظروف التصوير. وفي هذا الصدد، يتم الحصول على أفضل أداء عندما تكون العينات المستهدفة والمرجعية على نفس الشريحة، باستخدام، على سبيل المثال، نظارات غطاء ذات 8 غرف جيدة(الجدول 1، أكثر اليمين). في هذا البروتوكول، actin ملطخة بثلاثة ألوان من phalloidin كان يستخدم كمعايرة بيولوجية.
مرة واحدة يتم الحصول على صورة مرجعية، ثم يتم قياس التحول اللوني وتصحيحها من قبل برنامجنا Chromagnon. لا يوجد أي قيود على عدد القنوات، أقسام Z والأطر الزمنية التي يمكن قياس Chromagnon وتصحيح التحولات لوني ل. يقيس Chromagnon التحولات اللونية في خطوتين. تكتسب الخطوة الأولى معلمات المحاذاة "العمومية" أو "affine" للترجمة في محاور X و Y و Z والتكبير على طول محاور X و Y و Z و الدوران حول محور Z. دقة الحساب من المحاذاة العالمية هو ~ 16 نانومتر في 3D و ~ 8 نانومتر في 2D. الخطوة الثانية هي "محاذاة محلية" اختيارية 2D التكرارية على الصور المتوقعة للحصول على دقة أعلى. في عملية المحاذاة المحلية، يتم تقسيم الصور إلى مناطق متعددة ويتم قياس التحولات اللونية في هذه المناطق المحلية. وبعد ذلك، تُقسَّم المناطق بشكل أكبر وتُقاس التحولات اللونية في المناطق دون الإقليمية بشكل متكرر إلى أن يصل عدد البيكسلات في المنطقة إلى الحد الأدنى لعدد البيكسلات (عادة 60 x 60 بكسل). يتم دمج خريطة المحاذاة المحلية الناتجة مع معلمة المحاذاة العمومية ويتم تطبيقها على الصورة المستهدفة بواسطة تحويل مرن. بعد هذه الخطوة، يتم تحسين دقة الحساب إلى ~ 14 نانومتر في 3D و 6 نانومتر في 2D. لا يناسب المحاذاة المحلية لصور المراجع البيولوجية لأن البنية البيولوجية في المرجع تختلف عن البنية في الهدف(الجدول 1). ولذلك، يتم استخدام المحاذاة العالمية فقط لصور مرجعية المعايرة البيولوجية.
تنشأ التحولات اللونية المحلية من مصدرين؛ مجهر التشويه المحلي مفيدة و عدم فهم البنية البيولوجية. لأن المجهر التشويه المحلي مفيدة ثابت، وهذا يمكن قياسه من عينة مرجعية الخرز متعدد الألوان وتصحيحها كمعلمة ثابتة. يمكن أن يجمع كروماغنون خريطة التشويه المحلية المجهرية والمعلمات المحاذاة العالمية من المعايرات البيولوجية(الجدول 1). وباستخدام هذه الطريقة، من المتوقع أن يتم تحسين متوسط دقة المعايرة البيولوجية بمقدار 1-2 نانومتر إضافي.
هنا، ونحن وصف بروتوكول لتصحيح التحولات لوني من الصور الفلورية 3D باستخدام برنامجنا Chromagnon، من أسهل نهاية منخفضة إلى أعلى دقة. نستخدم الكبت المناعي لخلايا HeLa كمثال على ذلك ولاحظناها باستخدام المجهر ثلاثي الأبعاد الواسع و3D-SIM. في القسم الأول، نحن وصف كيفية إعداد العينات المستهدفة وعينات المعايرة البيولوجية. وينبغي تحسين هذا الجزء من البروتوكول من أجل الأهداف المحددة للبحوث. في القسم الثاني، نحن وصف طرق اقتناء لثلاثة أنواع من الصور المرجعية عن طريق المجاهر. كان الافتراض هو الحصول على قنوات زرقاء وخضراء وحمراء ولكن يجب تعديل تكوين القناة من خلال أهداف محددة للبحث وبإعدادات المجهر. لا يهم إذا كان المجهر مجهزا بكاميرا واحدة أو كاميرات متعددة. في القسم الثالث، نحن وصف كيف يمكن للمرء استخدام برنامجنا لقياس وتصحيح التحولات لوني من الصورة المستهدفة باستخدام الصور المرجعية. وأخيراً، في القسم الرابع، نحن نُصف طريقة لاستكمال الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية باستخدام المعايرة المحلية الفعالة للمجهر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

يعتمد المجهر الفلوري الكمي متعدد الألوان على المطابقة المكانية الدقيقة للقنوات اللونية التي تم الحصول عليها في أطوال موجية مختلفة. بسبب الانحراف لوني والمحاذاة غير الكاملة للكاميرات، قد يتم نقل الصور المكتسبة في كل قناة، وتضخيمها، وكذلك استدارة بالنسبة لبعضها البعض في أي من الأبعاد الثلاثة. مع طريقة المعايرة الكلاسيكية، يتم قياس التحولات اللونية بواسطة الخرز متعدد الألوان المرفقة على سطح غطاء، وعدد من البرامج المتاحة لقياس التحولات لوني من هذه العينات المعايرة. ومع ذلك، يمكن أن يختلف الانحراف اللوني باختلاف العمق، وأن يتغير مع ظروف المراقبة، وأن يستحثه العينة البيولوجية نفسها، مما يعوق تحديد المقدار الحقيقي للتحول اللوني في عينة الاهتمام وعبر الحجم. تصحيح التحولات اللونية بدقة أعلى وثيق الصلة بشكل خاص بالمجهر فائق الدقة حيث قد تؤثر التحولات اللونية الطفيفة فقط على التحليلات الكمية وتغيير تفسير الصور متعددة الألوان. لقد قمنا بتطوير برنامج مفتوح المصدر Chromagnon والطرق المصاحبة لقياس وتصحيح التحولات اللونية ثلاثية الأبعاد في العينات البيولوجية. هنا نقدم بروتوكول تطبيق مفصل يتضمن متطلبات خاصة لإعداد العينات، وحيازة البيانات، ومعالجة البرمجيات لقياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية ذات الاهتمام.

مثال على تصحيح التحول اللوني باستخدام صورة مرجعية عبر التوك معًا موضحًا في الشكل 5. تم الحصول على الصورة مع مجهر حقل واسع مجهز بكاميرا واحدة. تم استخدام انبعاثات الفلوريسنس من DAPI كمرجع(الشكل 5A, B) لتصحيح القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. الصورة تضم 3 قنوات من 60 شرائح Z، كل تتألف من 256 × 256 بكسل. تم تفكيك الصور قبل قياس التحولات اللونية. استغرق قياس التحولات اللونية المحلية باستخدام Chromagnon 51 s على جهاز Mac مع Intel Core i7 (رباعية النواة ، 8 - threads ، 2.7 GHz) ، 16 GB RAM و 1 TB تخزين فلاش. تم تطبيق المعلمة المحاذاة على الصورة المستهدفة (الشكل 5C، D)،الذي يحتوي على نفس العدد من voxels تماماً كصورة مرجعية. استغرق إعداد الملف المحاذى 3 s. نتيجة لتشذيب بيكسلات الحافة أثناء عملية المحاذاة (مربع اختيارهوامش المحاصيل في الشكل 1C)،تم تقليل عدد voxels بعد المحاذاة(الشكل 5B، 51 شرائح Z ، 252 × 251 بكسل). الحمض النووي في جسر anaphase (المشار إليها من قبل رؤوس الأسهم) وينظر بشكل غير صحيح خارج المغلف النووي قبل المحاذاة (الشكل 5C، واضح في لوحة أسفل تظهر عرض XZ)، ولكن كما هو متوقع داخل المغلف بعد المحاذاة (الشكل 5D).
مثال على تصحيح التحول لوني باستخدام صورة مرجعية معايرة البيولوجية هو مبين في الشكل 6. تم الحصول على الصور مع مجهر SIM مجهزة بثلاث كاميرات. تم متوسط ثلاث صور لخلايا HeLa الملطخة بالثوان phalloidins المترافقة إلى الأصباغ الزرقاء والأخضر والأحمر (الشكل 6A). تتألف الصورة المرجعية من 3 قنوات من شرائح 76 Z، تتكون كل منها من 1024 × 1024 بكسل. قياس التحولات اللونية باستخدام Chromagnon دون محاذاة المحلية المطلوبة 194 ق على نظام ماك المذكورة أعلاه. تم تطبيق المعلمة على صورة مستهدفة تتكون من 3 قنوات من شرائح 73 Z، كل منها يتكون من 1024 × 1024 بكسل. استغرق إنشاء ملف محاذاة 25 s. عرض XZ يظهر مواقف قناة غير صحيحة على طول Z، وقليلا على طول الاتجاهات X (الشكل 6A, C) ولكن تم تصحيح هذا التسجيل الخاطئ بعد المحاذاة ( الشكل6B, D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> الشكل 5: مثال على المحاذاة مع صورة مرجعية عبر. كانت خلايا HeLa ملطخة بDAPI للحمض النووي (يظهر باللون الأرجواني) ، وأليكسا فلور 488 (يظهر باللون الأصفر) للمغلف النووي ، وأليكسا فلور 555 (يظهر باللون الأزرق) للخيومات الصغيرة. تم الحصول على الصور عن طريق 3D مجهرية واسعة النطاق مع كاميرا واحدة وdeonvolved. (أ، ب) ممثلة عبر ة إشارة صورة باستخدام DAPI الانبعاثات، قبل وبعد المحاذاة من قبل Chromagnon. وتظهر ثلاث قنوات ملونة على أنها متراكبة. (C, D) مقطع بصري من المكدس ثلاثي الأبعاد في ثلاث قنوات قبل المحاذاة وبعدها. الانحراف اللوني المحوري واضح عند جسر الphase الذي يظهره رؤوس الأسهم. شريط مقياس في اللوحة A يشير إلى 5 ميكرومتر لجميع اللوحات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> الشكل 6: مثال على المحاذاة مع صورة مرجعية للمعايرة البيولوجية تم الحصول على الصور مع 3D-SIM مجهزة بثلاث كاميرات. (أ، ب) متوسط صورة مرجعية من ثلاث صور قبل (A) وبعد (B)المحاذاة. كانت خلايا HeLa ملطخة بالفالويدين المترافقة مع أليكسا فلور 405 أو 488 أو 594. (C, D) الصورة الهدف قبل (C) وبعد (D) المحاذاة. كانت خلايا HeLa ملطخة بDAPI للحمض النووي (يظهر باللون الأرجواني) ، وأليكسا فلور 488 (يظهر باللون الأصفر) للمغلف النووي ، وأليكسا فلور 594 (يظهر باللون الأزرق) للصغرى. شريط مقياس في اللوحة A يشير إلى 5 ميكرومتر لجميع اللوحات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

تصحيح التحولات اللونية في صور المجهر الفلورية متعددة الأبعاد (3D) ثلاثية الأبعاد أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات الكمية. تم تطوير هذا البروتوكول لقياس وتصحيح التحولات اللونية في العينات البيولوجية من خلال الحصول على الصور المرجعية المناسبة وتجهيزها مع البرمجيات مفتوحة المصدر ، Chromagnon.

تصحيح عالي الدقة لتحولات لونية ثلاثية الأبعاد في عصر التصوير البيولوجي فائق الدقة باستخدام Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

تحتوي صور المجهر المرجاني في الأهوار على التحول اللوني في ثلاثة أبعاد. وهذا يضعف تحليل الكولوكية للصور عالية الدقة. من الصعب عموما لإزالة التحول اللوني نشأت من عينة بيولوجية نفسها، ويمكن أن أسلوبنا تصحيح التحول لوني في عينة بيولوجية باستخدام الصور المرجعية المكتسبة بشكل منفصل.إثبات الإجراء سيكون تاكاكو كوجين فني من مجموعتي. تبدأ بذر 2.5 مرات 10 إلى الخلايا المعالج الخامس على طبق قاع الزجاج 35 ملليمتر ونمائها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة من الحضانة استبدال المتوسطة مع مليلتر اثنين من 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني ومزيج بلطف.قم بإصلاح المبيعات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة دوارة. اغسل الخلايا ثلاث مرات بمليلترين من برنامج تلفزيوني لمدة خمس إلى عشر دقائق. Permeabilize لهم مع مليلترين من نقطة 1٪ محاولة 100 المقبل في برنامج تلفزيوني أثناء تدوير وتكرار يغسل مع برنامج تلفزيوني.ثم وصمة عار الخلايا باستخدام جسم مضاد قياسي تلطيخ بروتوكول كما هو موضح في مخطوطة النص. للحصول على صورة مرجعية من مرجع التوك المتبادل للمجهر widefield، إضافة ملليلتر اثنين من نقطة خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر Dappy للبقاء في الحمض النووي. اترك الخلايا على المنصة الدوارة لمدة 30 دقيقة.ثم استبدال الحل مع 100 ميكرولترات من تركيب المتوسطة للحصول على صورة مرجعية من مرجع المعايرة البيولوجية لأي نوع من المجهر، بما في ذلك المجهر confocal وميكروفون فائقة. إصلاح الخلايا كما هو موضح سابقا، وإعداد حل الأسهم صبغة الفلورسنت phalloidin مترافق في 1.5 ملليلتر من الميثانول. إضافة phalloidin في برنامج تلفزيوني في تخفيف من واحد إلى 100 لطابق اليكسا 405 واحد إلى 1000 للطابق اليكسا 488 وواحد إلى 200 للطابق اليكسا 594.إضافة ملليلتر واحد من الحل للخلايا واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة أثناء الدورية. اغسل الخلايا ثلاث إلى خمس مرات بمليلترين من برنامج تلفزيوني. ثم استبدال برنامج تلفزيوني مع 100 ميكرولترات من المتوسط المتصاعدة.للحصول على صور الفلوريسنس باستخدام المجهر widefield مكان العينة المستهدفة على المجهر في برنامج التصوير، وفتح تصميم وتشغيل نافذة التجربة، وتعيين الخطوة Z المناسبة واختيار القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. في علامة التبويب تشغيل، أضف اسم ملف الصورة وابدأ التصوير. للحصول على الصور المرجعية عبر التوك من أجل قياس التحولات اللونية في العينة حدد ضوء الإثارة فقط لDappy وتأكد من استخدام نفس الموضع المرحلة بالضبط وارتفاع Z كما بالنسبة للعينة المستهدفة.بدلا من ذلك، لاستخدام صورة حقل مشرق كمكان مرجعي للعينة المستهدفة على المجهر الميداني واسعة والحصول على صورة الفلورانس من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر. ثم الحصول على صور حقل مشرق من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر في موقف المرحلة نفسها بالضبط واستخدام نفس الارتفاع Z. للحصول على صور الفلوريسنس باستخدام المجهر فائق الدقة، مثل 3D Sim وضع العينة المستهدفة على المجهر والحصول على صورة sim الفلوريسنس من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر.ثم إعادة بناء الصورة السوبر حلها. في المكان التالي بقعة عينة مع phalloidin متعددة الألوان على مجهر سيم 3D. والحصول على صور متعددة sim fluorescence كما الصور المرجعية المعايرة البيولوجية في مواقف مرحلة نقطة، ثم إعادة بناء الصور السوبر حلها.استخدام متصفح الويب لتحميل أحدث إصدار ثنائي من Chromagnon. استخراج البرنامج ووضع الملف القابل للتنفيذ في مكان مناسب. سحب وإسقاط الملفات المرجعية إما من تقاطع حقل الحق أو مراجع المعايرة البيولوجية إلى مربع مرجع أو انقر فوق ملفات مرجعية لفتح مربع محدد ملف الحوار.إذا طلب البرنامج تثبيت مجموعة أدوات تطوير Java، اضغط على نعم، وانتقل إلى الصفحة التي تم تنزيلها. ثم قم بتنزيل وتثبيت JDK لنظام التشغيل حسب التعليمات. سحب وإسقاط الملفات الهدف من تلطيخ الأجسام المضادة في المربع المستهدف.اختر تنسيق صورة إخراج وحدد لاحقة اسم ملف الإخراج. بالنسبة للصور المرجعية عبر التوك مع نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء. اختر الإسقاط من قائمة الاختيار من محاذاة المحلية واستخدام الحد الأدنى لحجم النافذة 60.للحصول على عدة صور مرجعية للمعايرة البيولوجية تحقق من خيار متوسط المراجع واختر لا شيء للمحاذاة المحلية ، ثم انقر فوق تشغيل الكل لبدء القياسات. للتأكد من أن القياس تم تنفيذه بشكل صحيح، اسحب الصور المرجعية وإفلاتها في المربع المرجعي ومربع الهدف. ثم قم بتشغيل البرنامج وتحقق من أن الصور متراكبة تماما.يمكن إجراء تصحيح التحول اللوني في المجهر العريض باستخدام صورة مرجعية عبر التوك. تم الحصول على هذه الصورة مع مجهر widefield مجهزة كاميرا واحدة. واستُخدمت انبعاثات الفلوريسنس من Dappy كمرجع لتصحيح القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر.بعد المحاذاة مع Chromagnon تم تصحيح التحول اللوني والصورة المرجعية. عندما تم تطبيق معلمة المحاذاة على الصورة الهدف بواسطة Chromagnon الحمض النووي وجسر الphase، الذي ينظر إليه بشكل غير صحيح خارج المغلف النووي قبل أن تظهر المحاذاة كما هو متوقع داخل المغلف. يمكن إجراء تصحيح إزاحة لونية لصورة sim ثلاثية الأبعاد باستخدام صورة مرجعية للمعايرة البيولوجية.ثلاث صور سيم 3D من خلايا هيلا ملطخة phalloidins مترافق إلى الأصباغ الزرقاء والخضراء والأحمر كانت averged وتم قياس التحول اللوني من قبل Chromagnon. بعد المحاذاة تم تصحيح التحول اللوني والصورة المرجعية. تم تطبيق معلمة المحاذاة على صورة الهدف.تعرض طريقة العرض XZ موضع قناة غير صحيح على طول Z و قليلاً على طول الاتجاهات X، والتي تم تصحيحها بعد المحاذاة. للحصول على أفضل أداء من المهم الحصول على الصور المرجعية تحت نفس الظروف والتوقيت كصور الهدف.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

دراسة السن التي تعتمد على عدم الاستقرار الجيني باستخدام س. خميرة يفسبن الزمني النموذجي

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...