Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 til A.M., JP18H05528 og JP17H03636 til T.H., og JP17H01444 og JP18H05533 til H.Y. L.S. anerkender støtte fra Welcome Trust Strategic Awards 091911 og 107457/Z/15/Z finansiering avanceret billedbehandling på Micron Oxford.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Proceduren for kromatisk korrektion er en afvejelse mellem nøjagtighed og indsats. For at spare unødvendige indsats, er det bedre at vide, hvor meget nøjagtighed der kræves for dit studie. Den højeste nøjagtighed er muligvis ikke nødvendig for konventionel billeddannelse i bred felt (live), og derfor er lyse feltreferencebilleder ofte tilstrækkelige til at korrigere det kromatiske skift. Tilsvarende, når billeddannelse tilstand og miljø er konstant, gentagen brug af en biologisk kalibrering vil spare tid. På den anden side, hvis en meget præcis registrering ønskes, høj kvalitet krydstale eller biologiske kalibrering reference billeder er nødvendige. For at opnå den bedste ydeevne bør referencebilleder opnås med så ensartede betingelser og tidspunkter som målbillederne som muligt. Så længe både reference- og målbilleder opnås ved samme mikroskopi, vil højere rumlig opløsning forbedre korrektionsnøjagtigheden. Hvis deconvolution er tilgængelig for både reference- og målbilleder, kan implementering af dette før korrektion forbedre korrektionens nøjagtighed. For at opnå den bedste ydeevne skal prøvetagningsteoret for den optiske (Z) akse også være opfyldt i både reference- og målfilen for præcis subpixel interpolation (protokoltrin 2.1.3).
Manglende korrektkorakromatisk skift fører til forkerte konklusioner. Desuden kan brugen af forkert kalibrering endda forværre de kromatiske skift i stedet for at korrigere dem, og det skal derfor undgås. Vi har opsummeret de mulige årsager til fejl og deres fælles løsninger i tabel 2. For at undersøge årsagen til en fejl er det for det første nødvendigt visuelt at kontrollere, om det kromatiske skift i referencebilledet er præcist korrigeret (protokoltrin 3.12). De fleste fejl skyldes kvaliteten af referencebillederne og afhjælpes let i henhold til beskrivelserne i tabel 2. Med hensyn til kvaliteten af referencebillederne er det vigtigt at bemærke, at nøjagtigheden af den globale tilpasning mindskes, hvis hele synsfeltet ikke fyldes med stikprøven (figur 7, tabel 2). Sammenlignet med det gode eksempel, der er vist i figur 7A, indeholder det dårlige eksempel i figur 7B kun tre nukleare kuverter i det øverste venstre område, og Chromagnon kunne ikke justere en del af dette billede. Dette skyldes , at Chromagnons globale tilpasningsmetode opdeler synsfeltet i fire regioner (figur 7C) for at måle forskellene i rotation og forstørrelse med høj nøjagtighed3. Denne metode, hvis den betjenes korrekt, er én ordre mere præcis end andre lineære metoder såsom log polar transformation og simplex metoder3. Hvis nogen af de fire regioner ikke er tilgængelige, vil Chromagnon skifte til mindre effektive lineære metoder. For at opnå den bedste ydeevne er de eksempler, der er vist i figur 7B og figur 7C, derfor uønskede, og de fire regioner skal fyldes med objekter. Brugerne kan kontrollere, om et kvadratisk område i synsfeltet ikke er tilgængeligt for måling, ved at se på logfilen ("Chromagnon.log"; se protokoltrin 3.10). Heldigvis kan dette problem let løses ved at beregne flere biologiske kalibreringsbilleder eller ved hjælp af lokal justering for krydstale eller lyse feltreferencebilleder (tabel 2). I modsætning til tilfældet med manglende korrekt korrekte referencebilleder er det vanskeligere at identificere manglende korrektring af målbilleder. Da sådanne fejl opstår på grund af forskelle i filformater, billedbehandlingsforhold, billedbehandlingstider, billeddannelses-/justeringsmetoder mellem reference- og målbillederne (tabel 2), bør brugerne altid være forsigtige, når de bruger referencebilleder, der er opnået under forskellige forhold/tidspunkter fra målbillederne. Nogle eksempler billeder er tilgængelige for test (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>) for at opnå konkret idé om de gode og dårlige eksempel billeder.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problem</td>
			<td>Forårsage</td>
			<td>Løsning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referencebilledet kunne ikke rettes</td>
			<td>Lav kontrast</td>
			<td>Anskaf et billede med højere kontrast, hvis det er muligt. Hvis der bruges et klart feltreferencebillede, skal du hente billedet igen i en vandbaseret løsning for at opnå større kontrast i cellen. Alternativt kan du prøve at anvende beregningsmæssig støjreduktion (f.eks. gaussisk filtrering). Slå lokal justering fra, som er mere støjfølsom.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forurening af uafhængige billeder</td>
			<td>Fjern kilden til de ikke-relaterede billeder i eksemplet, hvis det er muligt. For krydstale reference billeder, kontrollere excitation spektre af farvestoffer, der anvendes til målet billeder. Hvis farvestofferne er ophidsede under erhvervelsen af et krydstalebillede (f.eks. Hvis støv på kamerachippen skaber en tydelig kanalforskel, skal du rengøre kamerachippen eller bruge en beregningsmetode med flad fielding.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Et ekstremt lyspunkt lavet af en kosmisk stråle</td>
			<td>Anskaf billedet igen, hvis det er muligt. Alternativt kan du prøve at anvende beregningsmæssig støjreduktion (f.eks. median- eller gaussisk filtrering).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Deconvolution artefakter (kunstige signaler på den aksiale og laterale kanter)</td>
			<td>Beskære kantpixel eller Z-sektioner efter deconvolution. Hvis den ene side er beskåret, skal den anden side også beskæres for at bevare billedets centrum.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Z-trinstørrelsen er for sparsom</td>
			<td>En Z-stak skal anskaffes for at opfylde Nyquist-kriteriet som skrevet i protokol 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Optisk aberration</td>
			<td>Sfærisk aberration er den største afvigelse forårsaget af brugere. Vælg den rigtige objektive linse til prøven og bruge en coverslip tykkelse på 170 μm. Hvis objektivet linse er udstyret med en korrektion ring, justere den for at finde den position, hvor den højeste fluorescens tæller er opnået fra fokus. I tilfælde af et oliedænsningsmål uden korrektionsring justeres brydningsoliens brydningsindeks, der øger fluorescenstallet i fokus.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Synsfelt er ubesatte (fig. 7)</td>
			<td>I tilfælde af biologiske kalibrering reference billeder, gennemsnit mange billeder. I tilfælde af krydstale eller lyse felt reference billeder, skal du bruge lokale justering.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>En uidentificeret softwarefejl</td>
			<td>Rapportér problemet via GitHub (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Målbilledet kunne ikke rettes</td>
			<td>Metadata for billedfilen går tabt</td>
			<td>Brug det oprindelige mikroskopfilformat, der indeholder komplette metadata, og undgå at konvertere til en flersidet tiff-fil før behandling. Brug samme rækkefølge af kanaler som skrevet i protokol 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forkerte justeringsmetoder for den givne mikroskopi</td>
			<td>Anvend ikke den lokale justeringsmetode, når der måles fra biologiske kalibreringsreferencebilleder til målbilleder. Brug ikke krydstalereferencebilleder, bortset fra bredfeltmikroskopi.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forskelle i billeddannelsesforhold</td>
			<td>Billeddannelsesforholdene holdes konstante mellem reference- og målbillederne som skrevet i protokol 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Forskelle i stikprøve (herunder coverslip)</td>
			<td>Brug altid det samme monteringsmedium, dækslæbe (f.eks. nr. 1,5 H) og en lignende fokusdybde.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Mikroskopafdrift siden kalibreringen sidst blev foretaget</td>
			<td>Lav en kalibrering så ofte som hver anden uge. Hold temperaturen konstant, og bruge en flydende tabel for at undgå hardware drift af mikroskopet.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Fejlfinding i forbindelse med kromatisk korrektion.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> Figur 7: Eksempler på referencebilleder. Nuklear kuvert i fissionsgærceller mærket med GFP og mCherry. Billeder blev erhvervet med konventionel bredfeltmikroskopi. Kromatiske skift blev korrigeret ved hjælp af Chromagnon uden lokal justering ved hjælp af selve billederne som referencebilleder. Billeder blev derefter dekonroveret for at vise detaljerne. (A) Et godt eksempel med mange objekter i synsfeltet. (B) Et dårligt eksempel med objekter kun i øverste venstre hjørne. Forskydning er indlysende på en bestemt region af billedet. (C) Et uønsket eksempel, hvor en af firlsektionen (adskilt af punkterede tværgående linjer) er tom. Vægtlinjen i panel A angiver 5 μm for den fulde feltvisning og 1,25 μm for den udvidede visning og gælder for alle paneler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
I denne protokol beskrev vi tre forskellige referencetyper (tabel 1). Blandt dem, krydstale reference billeder og biologiske kalibrering reference billeder har brug for yderligere omhyggelig diskussion. Til krydstalereferencebilleder kan prøver, der er farves med DAPI eller Hoechst 33342, og som er monteret i glycerol eller kommercielle monteringsmedier, effektivt bruges til at justere de blå, grønne og røde kanaler. På samme måde kan Alexa Fluor 488 bruges til at justere de grønne og røde kanaler. Men at opnå krydstale fluorescens er ofte vanskeligt, da mange blå farvestoffer undtagen DAPI og Hoechst er svagere og henfald hurtigere end de fleste grønne og røde farvestoffer. Desuden er emissionsspektrene af moderne farvestoffer smallere, hvilket gør tilpasningen af mere end tre kanaler ved denne metode udfordrende. Opmærksomheden bør også rettes mod nogle almindelige røde farvestoffer (f.eks. Alexa Flour 568 og 594, men ikke Alexa Fluor 555), der kan ophidses af violet lys, som forhindrer at opnå krydstalebilleder med høj kontrast fra blå farvestoffer. En anden ulempe er, at denne metode ikke kan måle den kromatiske aberration af excitation lysstier i flerfarvet excitation, fordi kun en enkelt excitation bølgelængde bruges til excitation (Tabel 1). Da de fleste avancerede mikroskopi bruger ændret belysning optik, anvendelsen af denne metode er begrænset. Alligevel er dens højere korrektion nøjagtighed tilstrækkeligt fordelagtigt for det at blive beskrevet i denne protokol. Generelt bør en krydstale billede tages efter et mål billede for at forhindre blegning eller fototoksiske effekter. For SMLM, der observeres med wide field-mode, skal der anskaffes et referencebillede, før der erhverves et målbillede, da fluorescensfarvestoffer kan bleges, mens der billeddiagnostiske midler.
Biologiske kalibreringsreferencebilleder giver brugerne mulighed for nemt at justere det ønskede antal kanaler på bekostning af yderligere prøveforberedelse. En anden fordel ved biologiske kalibrering reference billeder er tilgængeligheden af "gennemsnit" flere referencer, der hjælper med at udfylde alle synsfelter. Denne metode kan lide under forskelle i billeddannelsesforhold, hvis kalibreringsprøven fremstilles på et andet dias. Det meste af dette problem kan løses, hvis både mål og referencer fremstilles på samme dias ved hjælp af kommercielle chambered coverglasses (Tabel 1), og andre billeddannelsesforhold holdes konstante som i protokol trin 2.3.3. I dette tilfælde kan der forventes en korrektionsnøjagtighed svarende til krydstalereferencebillederne3. Protokollen til at bruge falloidin som vist her er en af de nemmeste måder at plette en enkelt cellulære struktur med flere farver. Der er mange mulige scenarier for at forberede biologiske kalibreringsprøver. Til immunfarvning kan en prøve mærkes med et enkelt primært antistof efterfulgt af farvning med sekundære antistoffer i flere farver. På denne måde kan en enkelt målstruktur mærkes med flere farver. Alternativt, 5-ethynyl-2'-deoxyuridin, opdaget af "klik" kemi etiketter nyligt syntetiseret DNA i flere farver ved høj tæthed, som beskrevet i detaljer tidligere8. For levende celler er det nyttigt at forberede en transgen stamme, der huser to kopier af et gen, der er smeltet til GFP eller mCherry for at mærke den samme struktur med to farver. Hvis genets kopinummer er kritisk, så ofte observeret for membranproteiner, kan en enkelt kopi af genet sammensmeltet til GFP og mCherry (Figur 7). Fotokonverterbare fluorescerende proteiner, såsom mEOS218, kan også bruges ved at belyse et moderat niveau af violet lys for at opnå både proteinarter med eller uden fotokonversion. Under lave iltforhold kan bruttoinvesteringer også bruges som et fotokonverterbart protein fra grøn til rød19,20. At vælge den rigtige kalibreringsprøve vil således gøre eksperimentet mere robust.

Flerfarvet billeddannelse er et af de grundlæggende aspekter af biologisk fluorescensmikroskopi i tilfælde, hvor det rumlige forhold mellem forskellige molekyler eller strukturer er af stor interesse. Kromatisk aberration, en optisk aberration af polykromatisk lys forårsaget af dispersion, ændrer den tilsyneladende position af de farvede objekter af interesse. Tilsvarende mikroskoper udstyret med flere kameraer, der afsættes til at erhverve hver farve har mere komplekse kromatiske skift på grund af forskelle i optiske elementer og ufuldkommen tilpasning mellem kanalerne. Sådanne kromatiske skift kan således føre til en falsk konklusion, medmindre brugeren udtrykkeligt korrigerer dem. Selv om kromatiske skift ikke har været et stort problem, så længe opløsningen af mikroskopi er begrænset af den klassiske opløsningsgrænse, har den seneste udvikling af superopløsningsmikroskopi1 givet anledning til behovet for en mere præcis korrektion af kromatiske skift.
Det har været almindelig praksis at måle kromatiske forskydninger af mikroskopsystemer ved hjælp af et flerfarvet perlekalibreringsdias2. Den perlebaserede kalibreringsmetode er egnet til måling af kromatiske skift fra mikroskopets samlede optik til overfladen af dækslerne2. Denne metode er imidlertid ikke i stand til at måle kromatiske forskydninger i de biologiske prøver af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at mange biologiske prøver er tredimensionelle (3D), og de kromatiske skift af sådanne prøver er forskellige fra dem på overfladen af dækslerne. Desuden ændres kromatisk skift med billeddannelsesforhold2,3. Vi har målt de kromatiske forskydninger i 3D biologiske prøver og konstateret, at usikkerheden om kromatiske skift ofte var så meget som 350 nm ved den klassiske flerfarve-perle kalibreringsmetode3. Kromatiske skift skal derfor måles i biologiske prøver i den dybde af interesse og under de anvendte billeddannelsesforhold.
Her beskriver vi procedurer til at måle kromatiske skift i biologiske prøver og korrigere disse skift ved hjælp af vores software, Chromagnon3. For at måle kromatiske skift i biologiske prøver bruger vores metode to slags datasæt, et "målbillede" og et "referencebillede". Billedet "target" er et flerfarvet billede af interesse, for eksempel billeder, der er farves til DNA, nuklear konvolut og mikrotubuli. Det er ofte umuligt at måle kromatiske forskydninger i et sådant billede. Derfor har vi brug for en "reference" billede, der er dedikeret til at måle de kromatiske forskydninger i prøven. Den eneste definition af et "referencebillede" er et flerfarvet billede af det samme objekt. I denne forstand er en flerfarvet perler billede også en type reference billede. Her beskriver vi tre forskellige typer referencebillede, der bruges til at måle kromatiske forskydninger i de biologiske prøver: "krydstalereferencebilleder", "bright-field referencebilleder" og "biologiske kalibreringsreferencebilleder". Referencebilledets type afhænger af den anvendte type mikroskop eller den korrektionsnøjagtighed, der kræves som opsummeret i tabel 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Krydstale</td>
			<td>Lyst felt</td>
			<td>Biologisk kalibrering (på et andet dias)</td>
			<td>Biologisk kalibrering (på samme slide)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nøjagtigheden
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enkelhed</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gældende mikroskopi</td>
			<td>Bredt felt</td>
			<td>Bredt felt</td>
			<td>Alle</td>
			<td>Alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tilgængelighed af lokal justering</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: Antallet af "+" angiver en stigende bedømmelse. Enkelt plus er omkring 50 nm og tre plus er omkring 15 nm i 3D. b: Nøjagtigheden afhænger af, hvor meget de variable billeddannelsesforhold holdes konstante. c: Lokal kalibrering målt ved flerfarvede perleprøver kan kombineres som beskrevet i protokolsektion 4.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Parametre, når du vælger typen af referencebilleder.
"Krydstalereferencebilleder" har den højeste korrektionsnøjagtighed og er relativt enkle at opnå3,4 (tabel 1). Ulempen er deres begrænsning i mikroskopi applikationer på grund af deres manglende evne til at måle kromatiske forskydninger i excitation stier. For at opnå sådanne billeder bør mikroskopet også være udstyret med multibånddicespejle og emissionsfiltre, der styres uafhængigt af excitationsfiltrene eller lyskilderne. Egnet mikroskopi omfatter konventionel bredfeltmikroskopi, enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM) såsom fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi/stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (PALM/STORM)5,,6 og udvidelsesmikroskopi7 observeret med bredfeltmikroskopi. Et krydstalereferencebillede er hentet fra selve målprøven. Det er et billede af krydstale (bleed-through) fluorescens af et farvestof opnået i alle nødvendige kanaler. Fluorescensemissionen udvider sig altid mod de længere bølgelængder, og farvestoffer med den korteste emissionsbølgelængde er glade for at opnå krydstalefluorid i kanaler med længere bølgelængder. For eksempel, når prøven er plettet med blå, grøn og rød, er det kun det blå farvestof, der er ophidset, og emissionslyset opnås i de blå, grønne og røde kanaler. I denne protokol, DNA farves med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) blev brugt til at opnå krydstale fluorescens.
"Bright-field reference billeder" er en lettere og mindre fototoksisk alternativ til "krydstale reference billeder", men er de mindst nøjagtige3 (Tabel 1). Disse er lyse feltbilleder af målprøven, der er anskaffet i alle de farvekanaler, der bruges i målbilledet.
"Biologiske kalibreringsreferencebilleder" har den fordel, at de kan anvendes på enhver type mikroskopi på grund af deres evne til at måle de kromatiske forskydninger både i excitations- og emissionsvejene3,8 (tabel 1). Egnet mikroskopi omfatter bredfeltmikroskopi, konfokal mikroskopi, lysarkmikroskopi, stimuleret emissionsudtømning (STED)9, struktureret belysningsmikroskopi (SIM)10, Airyscan/SORA11,,12, SMLM observeret med den samlede interne refleksionfluorescens (TIRF) tilstand, Olympus super opløsning (OSR)13, og så videre. Et biologisk kalibreringsreferencebillede anskaffes fra en kalibreringsprøve, der fremstilles på samme måde som målprøven, men med farvning af en enkelt struktur med flere farver. Korrektionen nøjagtighed excellerer opløsningen af de fleste super-opløsning mikroskopi og forberede en biologisk kalibreringsprøve kan være relativt enkel. En anden fordel er tilgængeligheden til "gennemsnitlige" flere reference billeder. Selvom de enkelte billeder indeholder dårlige oplysninger til måling af kromatiske skift, kan informationsindholdet derfor øges ved at beregne flere billeder. Nøjagtigheden afhænger af, hvor meget billeddannelsesforholdene holdes konstante. I denne forbindelse opnås den bedste ydeevne, når både mål- og referenceprøverne er på samme dias,Table 1f.eks. I denne protokol, actin farves med tre farver falloidin blev brugt som en biologisk kalibrering.
Når en reference billede er opnået, så den kromatiske skift måles og korrigeres af vores software Chromagnon. Der er ingen begrænsning på antallet af kanaler, Z sektioner og tidsrammer, at Chromagnon kan måle og korrigere de kromatiske skift for. Chromagnon måler kromatiske skift i to trin. Det første trin erhverver de "globale" eller "affine" justering parametre for oversættelse i X, Y, Z akser, forstørrelse langs X, Y, Z akser, og rotation omkring Z akse. Beregningsnøjagtigheden af den globale tilpasning er ~ 16 nm i 3D og ~ 8 nm i 2D. Det andet trin er en valgfri 2D iterativ "lokal justering" på projicerede billeder for at opnå en højere nøjagtighed. I den lokale justeringsproces opdeles billederne i flere regioner, og kromatiske skift i disse lokale regioner måles. Derefter fordeles regionerne yderligere, og kromatiske forskydninger i underregionerne måles iterativt, indtil antallet af pixels i regionen når det mindste antal pixel (normalt 60 x 60 pixel). Det resulterende lokaljusteringskort kombineres med den globale justeringsparameter og anvendes på målbilledet ved hjælp af en elastisk transformation. Efter dette trin er beregningsnøjagtigheden forbedret til ~14 nm i 3D og ~6 nm i 2D. Den lokale justering er ikke egnet til biologiske kalibreringsreferencebilleder, fordi den biologiske struktur i referencen er forskellig fra strukturen i målet (tabel 1). Derfor bruges kun global justering til biologiske kalibreringsreferencebilleder.
De lokale kromatiske skift stammer fra to kilder; mikroskop instrumental lokal forvrængning og biologisk strukturel inhomogenitet. Da mikroskopets instrumentale lokale forvrængning er konstant, kan dette måles fra referenceprøven for flerfarvede perler og korrigeres som en fast parameter. Chromagnon kan kombinere mikroskopets instrumentelle lokale forvrængningskort og de globale justeringsparametre fra de biologiske kalibreringer (tabel 1). Ved hjælp af denne metode forventes det, at den gennemsnitlige nøjagtighed af biologisk kalibrering vil blive forbedret med yderligere 1-2 nm.
Her beskriver vi en protokol til at korrigere de kromatiske skift af 3D fluorescens billeder ved hjælp af vores software Chromagnon, fra den nemmeste lave ende til den højeste nøjagtighed. Vi bruger immunstaining af HeLa-celler som et eksempel og observerede dem ved hjælp af 3D wide-field mikroskopi og 3D-SIM. I første afsnit beskriver vi, hvordan du forbereder målprøver og biologiske kalibreringsprøver. Denne del af protokollen bør optimeres til forskningens specifikke mål. I andet afsnit beskriver vi anskaffelsesmetoderne for tre slags referencebilleder med mikroskoper. Antagelsen var at opnå blå, grønne og røde kanaler, men kanalsammensætning bør ændres ved de specifikke mål for forskningen og ved opsætninger af mikroskopet. Det betyder ikke noget, hvis mikroskopet er udstyret med et enkelt kamera eller flere kameraer. I tredje afsnit beskriver vi, hvordan man kan bruge vores software til at måle og korrigere kromatiske skift af målbilledet ved hjælp af referencebilleder. Endelig beskriver vi i fjerde afsnit en metode til at supplere de biologiske kalibreringsreferencebilleder ved hjælp af et mikroskops instrumentale lokale kalibrering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

Kvantitativ flerfarvet fluorescensmikroskopi er afhængig af den omhyggelige rumlige matchning af farvekanaler erhvervet ved forskellige bølgelængder. På grund af kromatisk aberration og den ufuldkomne tilpasning af kameraer, billeder erhvervet i hver kanal kan flyttes, og forstørret, samt roteret i forhold til hinanden i nogen af de tre dimensioner. Med den klassiske kalibreringsmetode måles kromatiske skift med flerfarvede perler fastgjort til overfladen af en dækslip, og der findes en række software til måling af de kromatiske skift fra sådanne kalibreringsprøver. Kromatisk aberration kan dog variere med dybde, ændre sig med observationsbetingelser og fremkaldes af selve den biologiske prøve, hvilket hindrer bestemmelse af den sande mængde kromatisk forskydning i prøven af interesse og på tværs af volumen. Korrektion af kromatiske skift ved højere nøjagtighed er særlig relevant for superopløsningsmikroskopi, hvor kun små kromatiske forskydninger kan påvirke kvantitative analyser og ændre fortolkningen af flerfarvede billeder. Vi har udviklet en open source software Chromagnon og ledsagende metoder til at måle og korrigere 3D kromatiske skift i biologiske prøver. Her leverer vi en detaljeret applikationsprotokol, der indeholder særlige krav til prøveforberedelse, dataindsamling og softwarebehandling til måling af kromatiske skift i biologiske prøver af interesse.

Et eksempel på kromatisk skiftkorrektion ved hjælp af et krydstalereferencebillede vises i figur 5. Billedet blev opnået med et bredt felt mikroskop udstyret med et enkelt kamera. Fluorescensemission fra DAPI blev brugt som reference (figur 5A,B) til at korrigere de blå, grønne og røde kanaler. Billedet består af 3 kanaler med 60 Z-udsnit, der hver består af 256 x 256 pixel. Billederne blev dekonroveret, før de måler de kromatiske skift. Måling af lokale kromatiske skift ved hjælp af Chromagnon tog 51 s på en Mac med Intel Core i7 (quad core, 8-tråde, 2,7 GHz), 16 GB RAM og 1 TB flash opbevaring. Justeringsparameteren blev anvendt på målbilledet (Figur 5C,D), som har nøjagtigt det samme antal voxels som referencebilledet. Forberedelse af den justerede fil tog 3 s. Som et resultat af trimning af kantpixel under justeringsprocessen(afkrydsningsfelt for beskæringsmargener i figur 1C) blev antallet af voxels reduceret efter justering (Figur 5B,51 Z-udsnit, 252 x 251 pixel). DNA i anaphasebroen (angivet med pilespidser) ses forkert uden for den nukleare kuvert før justering (Figur 5C, tydeligt i det nederste panel, der viser XZ-visningen), men som forventet inde i konvolutten efter justering (Figur 5D).
Et eksempel på kromatisk skiftkorrektion ved hjælp af et biologisk kalibreringsreferencebillede er vist i figur 6. Billederne blev opnået med et SIM-mikroskop udstyret med tre kameraer. Tre billeder af HeLa celler farves med falloidiner konjugeret til blå, grønne og røde farvestoffer blev i gennemsnit (Figur 6A). Referencebilledet består af 3 kanaler med 76 Z-udsnit, der hver består af 1.024 x 1.024 pixel. Måling kromatisk skift ved hjælp af Chromagnon uden lokal tilpasning kræves 194 s på Mac-systemet beskrevet ovenfor. Parameteren blev anvendt på et målbillede bestående af 3 kanaler med 73 Z-udsnit, der hver består af 1.024 x 1.024 pixel. Generering af den justerede fil tog 25 s. XZ-visningen viser forkerte kanalpositioner langs Z og lidt langs X-anvisningerne (Figur 6A,C), men denne fejlregistrering blev korrigeret efter justering (Figur 6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> Figur 5: Et eksempel på justering med et krydstalereferencebillede. HeLa celler blev plettet med DAPI for DNA (vist i magenta), Alexa Fluor 488 (vist med gul) for nuklear kuvert, og Alexa Fluor 555 (vist med blå) for mikrotubuli. Billeder blev erhvervet af 3D wide-field mikroskopi med et enkelt kamera og dekoncentraleret. (A,B) Et repræsentativt krydstalereferencebillede ved hjælp af DAPI-emission før og efter justering foretaget af Chromagnon. Tre farvekanaler vises som overlejret. (C,D) En optisk del af 3D-stakken i tre kanaler før og efter justering. Aksial kromatisk aberration er tydelig på anaphasebroen vist med pilespidser. Vægtbjælke i panel A angiver 5 μm for alle paneler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> Figur 6: Et eksempel på tilpasning til et biologisk kalibreringsreferencebillede Billeder blev erhvervet med 3D-SIM udstyret med tre kameraer. (A,B) Et referencebillede gennemsnit fra tre billeder før (A) og efter (B) justering. HeLa celler blev plettet med falloidin konjugeret med Alexa Fluor 405, 488 eller 594. (C,D) Målbilledet før (C) og efter (D) justering. HeLa celler blev plettet med DAPI for DNA (vist i magenta), Alexa Fluor 488 (vist med gul) for nuklear kuvert, og Alexa Fluor 594 (vist med blå) for mikrotubuli. Vægtbjælke i panel A angiver 5 μm for alle paneler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Korrektion af kromatiske forskydninger i tredimensionale (3D) flerfarvede fluorescensmikroskopibilleder er afgørende for kvantitative dataanalyser. Denne protokol er udviklet til at måle og korrigere kromatiske skift i biologiske prøver gennem erhvervelse af egnede referencebilleder og behandling med open source-software, Chromagnon.

Korrektion med høj nøjagtighed af 3D-kromatisk forskydninger i en alder af biologisk billedbehandling i superopløsning ved hjælp af Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Marsh koral mikroskopi billeder indeholder kromatisk Skift i tre dimensioner. Det forringer kolokaliseringsanalysen af billeder i høj opløsning. Det er generelt vanskeligt at fjerne kromatisk Skift stammer fra en biologisk prøve selv, kan vores metode korrigere kromatisk skift i en biologisk prøve ved hjælp af separat erhvervede referencebilleder.Demonstration af proceduren vil være Takako Koujin en tekniker fra min gruppe. Begynd med at så 2,5 gange 10 til den femte healer celler på en 35 millimeter glas bund fad og dyrke dem i en kuldioxid inkubator. Efter 24 timers inkubation erstattes mediet med to milliliter 3,7% formaldehyd i PBS og blandes forsigtigt.Fastgør salget i 15 minutter ved stuetemperatur på en roterende platform. Cellerne vaskes tre gange med to milliliter PBS i fem til 10 minutter. Permeabilize dem med to milliliter punkt 1%prøve de næste 100 i PBS, mens roterende og gentag vasker med PBS.Plette derefter cellerne ved hjælp af en standard antistoffarvningsprotokol som beskrevet i tekstmanuskriptet. For at få et referencebillede af krydstale reference for widefield mikroskopi, tilføje to milliliter punkt fem mikrogram pr. milliliter Dappy at bo i DNA. Lad cellerne være på den roterende platform i 30 minutter.Derefter erstattes opløsningen med 100 mikroliter monteringsmedium For at opnå et referencebillede af biologisk kalibreringsreference for enhver form for mikroskopi, herunder konfokal og superopløsningsmikroskopi. Fix cellerne som tidligere beskrevet, og forberede bestanden opløsning en fluorescerende farvestof konjugeret falloidin i 1,5 milliliter methanol. Tilsæt falloidin i PBS ved en fortynding af en til 100 for Alexa gulv 405 en til 1000 for Alexa gulv 488 og en til 200 for Alexa gulv 594.Tilsæt en milliliter af opløsningen til cellerne og inkuber dem i 30 minutter, mens du roterer. Cellerne vaskes tre til fem gange med to milliliter PBS. Derefter udskiftes PBS med 100 mikroliter monteringsmedium.Hvis du vil anskaffe fluorescensbilleder ved hjælp af widefield-mikroskopi, skal du placere målprøven på mikroskopet i billedbehandlingssoftwaren, åbne design- og eksperimentvinduet, indstille det relevante Z-trin og vælge de blå, grønne og røde kanaler. Tilføj billedfilnavnet under fanen Kør, og begynd billedbehandling. For at få krydstale referencebilleder til måling af kromatiske forskydninger i prøven skal du kun vælge excitationslyset for Dappy og sørg for at bruge nøjagtig samme sceneposition og Z-højde som for målprøven.Alternativt kan du bruge et lyst feltbillede som referencested til målprøven på det brede feltmikroskop og opnå et fluorescensbillede af målet i blå, grønne og røde kanaler. Derefter erhverve lyse felt billeder af målet i blå, grønne og røde kanaler på nøjagtig samme fase position og ved hjælp af samme Z højde. For at erhverve fluorescens billeder ved hjælp af super opløsning mikroskopi, såsom 3D Sim placere målet prøven på mikroskopet og erhverve en fluorescens sim billede af målet i blå, grønne og røde kanaler.Derefter rekonstruere super løst billede. Næste sted prøven pletten med flerfarvet phalloidin på en 3D sim mikroskop. Og erhverve flere fluorescens sim billeder som den biologiske kalibrering reference billeder på punkt fase positioner, derefter rekonstruere super løst billeder.Brug en webbrowser til at hente den nyeste binære udgivelse af Chromagnon. Udtræk programmet, og læg den eksekverbare fil på en bekvem placering. Træk og slip referencefilerne for enten krydstale højre felt eller biologiske kalibreringsreferencer til referencefeltet, eller klik på referencefiler for at åbne en filvælgerdialog.Hvis programmet beder om at installere et Java Development Kit, skal du trykke på Ja og navigere til den hentede side. Derefter downloade og installere JDK for operativsystemet som anvist. Træk og slip målfilerne for antistoffarvning i målboksen.Vælg et outputudsafetformat, og angiv suffikset for outputfilnavnet. Til krydstalereferencebilleder med højt signal-støj-forhold. Vælg projektion på valglisten over lokale juster, og brug en minimumvinduesstørrelse på 60.For en flere biologiske kalibrering reference billeder kontrollere den gennemsnitlige referencer mulighed Og vælg ingen for lokale justere, klik derefter køre alle for at starte målinger. Hvis du vil sikre dig, at målingen er udført korrekt, skal du trække og slippe referencebillederne i referenceboksen og målboksen. Kør derefter programmet og kontrollere, at billederne er perfekt overlappet.Kromatisk shift-korrektion i widefield-mikroskopi kan udføres ved hjælp af et krydstalereferencebillede. Dette billede blev opnået med et widefield mikroskop udstyret med et enkelt kamera. Fluorescensemission fra Dappy blev brugt som reference til at korrigere de blå, grønne og røde kanaler.Efter justering med Chromagnon blev det kromatiske skift og referencebilledet rettet. Når justeringsparameteren blev anvendt på målbilledet af Chromagnon, blev DNA'et og anaphasebroen, som ses forkert uden for den nukleare konvolut, før justeringen vises som forventet inde i konvolutten. Kromatisk skiftkorrektion af et 3D-sim-billede kan udføres ved hjælp af et biologisk kalibreringsreferencebillede.Tre 3D sim billeder af HeLa celler plettet med falloidiner konjugeret til blå, grønne og røde farvestoffer blev averged og kromatisk Skift blev målt af Chromagnon. Efter justering blev det kromatiske skift og referencebilledet rettet. Justeringsparameteren blev anvendt på et målbillede.XZ-visningen viser forkert kanalposition langs Z og lidt langs X-visningerne, som blev rettet efter justering. For at opnå den bedste ydeevne er det vigtigt at få referencebilleder under de samme betingelser og timingen som målbilleder.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-opløsning Imaging af Bakteriel Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Prøverne, til Optimering STORM Super-opløsning Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-opløsning Imaging af Cytokinetic Z Ring i levende bakterier Brug af Fast 3D-strukturerede Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtilstand udtynding super-resolution Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...