Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 tot A.M., JP18H05528 en JP17H03636 naar T.H., en JP17H01444 en JP18H05533 tot H.Y. L.S. erkent de steun van de Welcome Trust Strategic Awards 091911 en 107457/Z/15/Z financiering van geavanceerde beeldvorming bij Micron Oxford.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De procedure voor chromatische correctie is een afweging tussen nauwkeurigheid en inspanning. Om onnodige inspanningen te besparen, is het beter om te weten hoeveel nauwkeurigheid nodig is voor uw studie. De hoogste nauwkeurigheid is mogelijk niet vereist voor conventionele beeldvorming op het brede veld (live), en dus zijn heldere veldreferentiebeelden vaak voldoende om de chromatische verschuiving te corrigeren. Op dezelfde manier, wanneer de beeldvormingstoestand en de omgeving constant zijn, zal herhaald gebruik van een biologische kalibratie tijd besparen. Aan de andere kant, als een zeer nauwkeurige registratie gewenst is, zijn hoogwaardige crosstalk- of biologische kalibratiereferentiebeelden noodzakelijk. Voor de beste prestaties moeten referentiebeelden worden verkregen met vergelijkbare omstandigheden en timings als de doelafbeeldingen mogelijk. Zolang zowel referentie- als doelafbeeldingen door dezelfde microscopie worden verkregen, zal een hogere ruimtelijke resolutie de correctienauwkeurigheid verbeteren. Als deconvolution beschikbaar is voor zowel referentie- als doelafbeeldingen, kan het implementeren van deze vóór correctie de correctiennauwkeurigheid verbeteren. Ook voor de beste prestaties moet de bemonsteringsstelling voor de optische (Z)-as worden vervuld in zowel het referentie- als het doelbestand voor nauwkeurige subpixelinterpolatie (protocolstap 2.1.3).
Het niet corrigeren van chromatische verschuiving leidt tot onjuiste conclusies. Bovendien kan het gebruik van de verkeerde kalibratie zelfs de chromatische verschuivingen verergeren in plaats van ze te corrigeren, en dit moet daarom worden vermeden. We hebben de mogelijke oorzaken van mislukkingen en hun gemeenschappelijke oplossingen samengevat in tabel 2. Om de oorzaak van een fout te onderzoeken, is het in de eerste plaats noodzakelijk om visueel te controleren of de chromatische verschuiving in het referentiebeeld precies is gecorrigeerd (protocolstap 3.12). De meeste storingen zijn te wijten aan de kwaliteit van de referentieafbeeldingen en zijn gemakkelijk te verhelpen volgens de beschrijvingen in tabel 2. Wat de kwaliteit van referentiebeelden betreft, is het belangrijk op te merken dat de nauwkeurigheid van de globale uitlijning afneemt als het hele gezichtsveld niet is gevuld met het voorbeeld(figuur 7, tabel 2). Vergeleken met het goede voorbeeld in figuur 7Abevat het slechte voorbeeld in figuur 7B slechts drie nucleaire enveloppen in de linkerbovenhoek en is Chromagnon er niet in geslaagd een deel van dit beeld uit te lijnen. Dit komt omdat de globale uitlijningsmethode van Chromagnon het gezichtsveld splitst in vier regio's(figuur 7C) om de verschillen in rotatie en vergroting met hoge nauwkeurigheid te meten3. Deze methode, indien correct bediend, is een volgorde nauwkeuriger dan andere lineaire methoden, zoals de log polaire transformatie en simplex methoden3. Als een van de vier regio's niet beschikbaar is, schakelt Chromagnon over op minder effectieve lineaire methoden. Daarom zijn de voorbeelden in figuur 7B en figuur 7C voor de beste prestaties ongewenst en moeten de vier regio's worden gevuld met objecten. Gebruikers kunnen controleren of een kwadrataire regio van het gezichtsveld niet beschikbaar is voor metingen door het logboekbestand te bekijken ("Chromagnon.log"; zie protocolstap 3.10). Gelukkig kan dit probleem gemakkelijk worden opgelost door het gemiddelde van meerdere biologische kalibratiebeelden of het gebruik van lokale uitlijning voor crosstalk- of heldere-veldreferentiebeelden(tabel 2). In tegenstelling tot het geval van het niet corrigeren van referentiebeelden, is het moeilijker om doelbeelden te corrigeren. Omdat dergelijke fouten ontstaan als gevolg van verschillen in bestandsformaten, beeldvormingsomstandigheden, beeldtijds, beeldvorming/uitlijningsmethoden tussen de referentie- en doelafbeeldingen(tabel 2),moeten gebruikers altijd voorzichtig zijn bij het gebruik van referentieafbeeldingen die in verschillende omstandigheden/timings van de doelafbeeldingen worden verkregen. Enkele voorbeeldafbeeldingen zijn beschikbaar voor het testen<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)</a>om een concreet idee te krijgen van de goede en slechte voorbeeldafbeeldingen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Probleem</td>
			<td>Oorzaak</td>
			<td>Oplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kan de referentieafbeelding niet corrigeren</td>
			<td>Laag contrast</td>
			<td>Verkrijg indien mogelijk een afbeelding met een hoger contrast. Als een referentieafbeelding met helder veld wordt gebruikt, moet u de afbeelding opnieuw in een oplossing op waterbasis gebruiken om een hoger contrast van de cel te verkrijgen. U ook proberen computationele ruisonderdrukking toe te passen (bijvoorbeeld Gaussian-filtering). Schakel de lokale uitlijning uit, die gevoeliger is voor ruis.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Verontreiniging van niet-gerelateerde beelden</td>
			<td>Verwijder indien mogelijk de bron van de niet-gerelateerde afbeeldingen in het voorbeeld. Voor crosstalk referentiebeelden, controleer de excitatie spectra van de kleurstoffen die worden gebruikt voor de doelafbeeldingen. Als de kleurstoffen zijn opgewonden tijdens de verwerving van een crosstalk beeld (bijvoorbeeld Alexa Fluor 568 of 594), overweeg dan andere kleurstoffen (bijvoorbeeld Alexa Fluor 555). Als stof op de camerachip een duidelijk kanaalverschil creëert, reinigt u de camerachip of gebruikt u een computationele flat-fieldingmethode.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Een uiterst lichtpuntje gemaakt door een kosmische straal</td>
			<td>Verwerf de afbeelding indien mogelijk opnieuw. U ook proberen computationele ruisonderdrukking toe te passen (bijvoorbeeld Median of Gaussian filtering).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Deconvolution artefacten (kunstmatige signalen aan de axiale en laterale randen)</td>
			<td>Knip de randpixels of Z-secties na deconvolutie bij. Als de ene kant is bijgesneden, moet de andere kant ook worden bijgesneden om het afbeeldingscentrum te behouden.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>De Z stap grootte te schaars</td>
			<td>Een Z-stack moet worden verworven om te voldoen aan het Nyquist-criterium zoals geschreven in protocol 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Optische aberratie</td>
			<td>Sferische aberratie is de belangrijkste aberratie veroorzaakt door gebruikers. Kies de juiste objectieve lens voor het monster en gebruik een coverslip dikte van 170 μm. Als de objectieve lens is uitgerust met een correctiering, pas deze aan om de positie te vinden waar het hoogste fluorescentiegetal wordt verkregen uit de focus. In het geval van een olie-onderdompeling doelstelling zonder een correctie ring, pas de brekingsindex van de onderdompeling olie die de fluorescentie tellen verhoogt op de focus.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gezichtsveld is niet gevuld (fig. 7)</td>
			<td>In het geval van biologische kalibratie referentiebeelden, gemiddeld veel beelden. Gebruik in het geval van crosstalk- of heldere referentieafbeeldingen lokale uitlijning.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Een niet-geïdentificeerde softwarebug</td>
			<td>Meld het probleem via GitHub<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kan de doelafbeelding niet worden gecorrigeerd</td>
			<td>Metagegevens van het afbeeldingsbestand gaan verloren</td>
			<td>Gebruik de oorspronkelijke microscoopbestandsindeling die volledige metagegevens bevat en vermijd het converteren naar een tiff-bestand met meerdere pagina's voordat u wordt verwerkt. Gebruik dezelfde volgorde van kanalen als geschreven in protocol 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Verkeerde uitlijningsmethoden voor de gegeven microscopie</td>
			<td>Pas de lokale uitlijnmethode niet toe bij het meten van biologische kalibratiereferenties op doelafbeeldingen. Gebruik geen kruistalkreferentieafbeeldingen, met uitzondering van microscopie met groot veld.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Verschillen in beeldvormingsvoorwaarden</td>
			<td>Houd de beeldomstandigheden constant tussen de referentie en de doelafbeeldingen zoals geschreven in protocol 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Verschillen in monster (inclusief coverslip)</td>
			<td>Gebruik altijd hetzelfde montagemedium, coverslip (bijv. nr. 1,5H) en een vergelijkbare scherptediepte.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Microscoop drift sinds de kalibratie voor het laatst werd gemaakt</td>
			<td>Maak een kalibratie zo vaak als om de twee weken. Houd de temperatuur constant en gebruik een zwevende tafel om hardwaredrift van de microscoop te voorkomen.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Probleemoplossing voor chromatische correctie.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> Figuur 7: Voorbeelden van referentieafbeeldingen. Nucleaire envelop in splijting gistcellen gelabeld met GFP en mCherry. Beelden werden verworven met conventionele wide-field microscopie. Chromatische verschuivingen werden gecorrigeerd met chromagnon zonder lokale uitlijning met behulp van de beelden zelf als referentiebeelden. Beelden werden vervolgens gedeconvolveerd om de details te tonen. (A) Een goed voorbeeld met veel objecten in het gezichtsveld. (B) Een slecht voorbeeld met objecten alleen in de linkerbovenhoek. Verkeerde uitlijning is duidelijk op een bepaalde regio van het beeld. (C) Een ongewenst voorbeeld waarbij een van de verviervoudiging (gescheiden door stippellijnen) leeg is. Schaalbalk in paneel A geeft 5 μm aan voor de volledige veldweergave en 1,25 μm voor de vergrote weergave en is van toepassing op alle panelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
In dit protocol beschreven we drie verschillende referentietypen(tabel 1). Onder hen, crosstalk referentiebeelden en biologische kalibratie referentiebeelden moeten verdere zorgvuldige discussie. Voor crosstalk referentiebeelden kunnen monsters met DAPI of Hoechst 33342 en gemonteerd in glycerol of commerciële montagemedia efficiënt worden gebruikt om de blauwe, groene en rode kanalen uit te lijnen. Alexa Fluor 488 kan ook worden gebruikt om de groene en rode kanalen uit te lijnen. Echter, het verkrijgen van crosstalk fluorescentie is vaak moeilijk, omdat veel blauwe kleurstoffen, behalve DAPI en Hoechst zijn dimmer en verval sneller dan de meeste groene en rode kleurstoffen. Bovendien zijn de emissiespectra van moderne kleurstoffen smaller, wat de uitlijning van meer dan drie kanalen door deze methode uitdagend maakt. Aandacht moet ook worden besteed aan een aantal gemeenschappelijke rode kleurstoffen (bijvoorbeeld Alexa Flour 568 en 594, maar niet Alexa Fluor 555) die kunnen worden opgewekt door violet licht, die voorkomen dat het verkrijgen van hoog contrast crosstalk beelden van blauwe kleurstoffen. Een ander nadeel is dat deze methode de chromatische aberratie van excitatielichtpaden in veelkleurige excitatie niet kan meten, omdat slechts één excitatiegolflengte wordt gebruikt voor excitatie (Tabel 1). Aangezien de meeste geavanceerde microscopie aangepaste verlichtingsoptica gebruikt, is de toepassing van deze methode beperkt. Toch is de hogere correctienauwkeurigheid voldoende voordelig om het in dit protocol te beschrijven. In het algemeen moet een crosstalk-afbeelding worden genomen na een doelafbeelding om bleken of fototoxische effecten te voorkomen. Voor SMLM waargenomen met de breedveldmodus, moet een referentieafbeelding worden verkregen voordat een doelafbeelding wordt verkregen, omdat fluorescentiekleurstoffen kunnen worden gebleekt tijdens het beeldvorming.
Biologische kalibratiereferentiebeelden stellen gebruikers in staat om eenvoudig een gewenst aantal kanalen uit te lijnen ten koste van de extra monstervoorbereiding. Een ander voordeel van biologische kalibratiereferentiebeelden is de beschikbaarheid van "gemiddelde" meerdere verwijzingen die helpt bij het vullen van alle gezichtsvelden. Deze methode kan last hebben van verschillen in beeldvorming als het kalibratiemonster op een andere dia wordt bereid. Het grootste deel van dit probleem kan worden opgelost als zowel de doelstellingen als de referenties op dezelfde dia worden voorbereid met behulp van commerciële chambered coverglasses(tabel 1),en andere beeldvormingsomstandigheden constant worden gehouden zoals in protocolstap 2.3.3. In dit geval kan een correctienauwkeurigheid worden verwacht die vergelijkbaar is met die van kruistalkreferentieafbeeldingen3. Het protocol om phalloidin te gebruiken zoals hier getoond is een van de gemakkelijkste manieren om een enkele cellulaire structuur met meerdere kleuren vlek. Er zijn tal van mogelijke scenario's om biologische kalibratiemonsters voor te bereiden. Voor immunostaining kan een monster worden gelabeld met een enkel primair antilichaam, gevolgd door vlekken met secundaire antilichamen van meerdere kleuren. Op deze manier kan één doelstructuur worden gelabeld met meerdere kleuren. Als alternatief, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, gedetecteerd door "klik" chemie labels nieuw gesynthetiseerd DNA in meerdere kleuren bij hoge dichtheid, zoals beschreven in detail eerder8. Voor levende cellen is het nuttig om een transgene stam te bereiden die twee kopieën van een gen herbergt dat is gesmolten tot GFP of mCherry om dezelfde structuur met twee kleuren te labelen. Als het kopienummer van het gen zo vaak wordt waargenomen voor membraaneiwitten, kan een enkele kopie van het gen samen worden gesmolten tot GFP en mCherry(figuur 7). Fotoconverteerbare fluorescerende eiwitten, zoals mEOS218,kunnen ook worden gebruikt door het verlichten van een matig niveau van violet licht om zowel eiwitsoorten te verkrijgen met of zonder fotoconversie. Onder lage zuurstofomstandigheden kan GFP ook worden gebruikt als fotoconverteerbaar eiwit van groen tot rood19,20. Het kiezen van het juiste kalibratiemonster maakt het experiment robuuster.

Multicolor imaging is een van de fundamentele aspecten van biologische fluorescentie microscopie, in gevallen waarin de ruimtelijke relatie van verschillende moleculen of structuren is van groot belang. Chromatische aberratie, een optische aberratie van polychromatisch licht veroorzaakt door dispersie, verandert de schijnbare positie van de gekleurde objecten van belang. Op dezelfde manier, microscopen uitgerust met meerdere camera's gewijd aan het verwerven van elke kleur hebben meer complexe chromatische verschuivingen als gevolg van verschillen in optische elementen en onvolmaakte uitlijning tussen de kanalen. Dergelijke chromatische verschuivingen kunnen dus leiden tot een verkeerde conclusie, tenzij de gebruiker dit expliciet heeft gecorrigeerd. Hoewel chromatische verschuivingen geen groot probleem zijn geweest zolang de resolutie van microscopie wordt beperkt door de klassieke resolutielimiet, heeft de recente ontwikkeling van microscopie met superresolutie1 geleid tot de noodzaak van een nauwkeurigere correctie van chromatische verschuivingen.
Het is een gangbare praktijk om chromatische verschuivingen van microscoopsystemen te meten met behulp van een veelkleurige kraalkalibratieglijbaan2. De op kralen gebaseerde kalibratiemethode is geschikt voor het meten van chromatische verschuivingen van de gehele optiek van de microscoop naar het oppervlak van de coverslip2. Deze methode is echter niet in staat chromatische verschuivingen in de biologische monsters van belang te meten. Het is belangrijk op te merken dat veel biologische monsters driedimensionaal (3D) zijn, en de chromatische verschuivingen van dergelijke monsters verschillen van die aan het oppervlak van de coverslip. Bovendien veranderen chromatische verschuivingen met beeldomstandigheden2,3. We hebben de chromatische verschuivingen in 3D biologische monsters gemeten en vastgesteld dat de onzekerheid van chromatische verschuivingen vaak maar liefst 350 nm was door de klassieke multicolor-kraalkalibratie methode3. Daarom moeten chromatische verschuivingen worden gemeten in biologische monsters op de diepte van de belangstelling en onder de imaging omstandigheden die worden gebruikt.
Hier beschrijven we procedures om chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten en deze verschuivingen te corrigeren met behulp van onze software, Chromagnon3. Om chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten, maakt onze methode gebruik van twee soorten gegevenssets, een "doel" afbeelding en een "referentie" afbeelding. De "doel" afbeelding is een veelkleurig beeld van belang, bijvoorbeeld, beelden gekleurd voor DNA, nucleaire envelop, en microtubuli. Het is vaak onmogelijk om chromatische verschuivingen in een dergelijk beeld te meten. Daarom hebben we een "referentie" afbeelding nodig die is gewijd aan het meten van de chromatische verschuivingen in het monster. De enige definitie van een "referentie" afbeelding is een veelkleurige afbeelding van hetzelfde object. In deze zin is een veelkleurige kralenafbeelding ook een type referentieafbeelding. Hier beschrijven we drie verschillende soorten referentiebeeld die worden gebruikt om chromatische verschuivingen in de biologische monsters te meten: "crosstalk referentiebeelden", "bright-field reference images" en "biological calibration reference images". Het type referentieafbeelding is afhankelijk van het type microscoop dat wordt gebruikt of de vereiste correctienauwkeurigheid zoals samengevat in tabel 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Overspraak</td>
			<td>Helder veld</td>
			<td>Biologische kalibratie (op een andere dia)</td>
			<td>Biologische kalibratie (op dezelfde dia)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nauwkeurigheidvan een
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eenvoud</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toepasselijke microscopie</td>
			<td>Breed veld</td>
			<td>Breed veld</td>
			<td>Alle</td>
			<td>Alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beschikbaarheid van lokale uitlijning</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: Aantal "+" geeft een stijgende beoordeling aan. Single plus is ongeveer 50 nm en drie plus is ongeveer 15 nm in 3D. b: De nauwkeurigheid hangt af van de hoogte van de variabele beeldvormingsomstandigheden constant worden gehouden. c: Lokale kalibratie gemeten door veelkleurige kraalmonsters kan worden gecombineerd zoals beschreven in protocol sectie 4.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Parameters bij het kiezen van het type referentieafbeeldingen.
"Crosstalk referentiebeelden" hebben de hoogste correctienauwkeurigheid en zijn relatief eenvoudig te bereiken3,4 (tabel 1). Het nadeel is hun beperking in microscopie toepassingen als gevolg van hun onvermogen van het meten van chromatische verschuivingen in opwinding paden. Ook, om dergelijke beelden te verkrijgen, moet de microscoop worden uitgerust met multiband dichroic spiegels, en emissiefilters die onafhankelijk worden gecontroleerd van de excitatie filters of lichtbronnen. Geschikte microscopie omvat conventionele breedveldmicroscopie, single molecule localisatie microscopie (SMLM) zoals foto-geactiveerde lokalisatie microscopie / stochastische optische reconstructie microscopie (PALM / STORM)5,6 en uitbreiding microscopie7 waargenomen met breedveldmicroscopie. Een kruisspraakreferentieafbeelding wordt verkregen uit het doelsteekproef zelf. Het is een beeld van crosstalk (bleed-through) fluorescentie van een kleurstof verkregen in alle vereiste kanalen. Fluorescentie emissie breidt zich altijd uit naar de langere golflengten, daarom kleurstoffen met de kortste emissie golflengte zijn enthousiast om crosstalk fluorescentie te verkrijgen in kanalen van langere golflengten. Wanneer het monster bijvoorbeeld is gekleurd met blauw, groen en rood, wordt alleen de blauwe kleurstof opgewekt en wordt het emissielampje verkregen in de blauwe, groene en rode kanalen. In dit protocol, DNA gekleurd met 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) werd gebruikt om crosstalk fluorescentie te verkrijgen.
"Bright-field reference images" zijn een gemakkelijker en minder fototoxisch alternatief voor "crosstalk referentiebeelden", maar zijn de minst nauwkeurige3 (tabel 1). Dit zijn heldere veldafbeeldingen van het doelsampproef, verkregen in alle kleurkanalen die in de doelafbeelding worden gebruikt.
"Biologische kalibratiereferentiebeelden" hebben het voordeel dat zij van toepassing zijn op elk type microscopie vanwege hun vermogen om de chromatische verschuivingen te meten, zowel in de excitatie- als in emissiepaden3,8 (tabel 1). Geschikte microscopie omvat breedveldmicroscopie, confocale microscopie, lichtplaatmicroscopie, gestimuleerde emissieuitputting (STED)9, structured illumination microscopy (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM waargenomen met de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) modus, Olympus super resolutie (OSR)13, enzovoort. Een biologische kalibratiereferentieafbeelding wordt verkregen uit een kalibratiemonster dat op dezelfde manier is bereid als het doelmonster, maar met het beitsen van een enkele structuur met meerdere kleuren. De correctie nauwkeurigheid blinkt uit de resolutie van de meeste super-resolutie microscopie en de voorbereiding van een biologische kalibratie monster kan relatief eenvoudig zijn. Een ander voordeel is de beschikbaarheid van "gemiddelde" meerdere referentiebeelden. Daarom, hoewel de afzonderlijke beelden slechte informatie voor de meting van chromatische verschuivingen bevatten, kan de informatieinhoud door het gemiddelde van meerdere beelden worden verhoogd. De nauwkeurigheid hangt af van hoeveel de beeldvorming voorwaarden constant worden gehouden. In dit verband worden de beste prestaties verkregen wanneer zowel doel- als referentiemonsters zich op dezelfde dia bevinden, bijvoorbeeld met 8 goed kamersde afdekglazen(tabel 1, rechts-meest). In dit protocol, actin gekleurd met drie kleuren van phalloidin werd gebruikt als een biologische kalibratie.
Zodra een referentieafbeelding is verkregen, wordt de chromatische verschuiving gemeten en gecorrigeerd door onze software Chromagnon. Er is geen beperking op het aantal kanalen, Z secties en termijnen die Chromagnon kan meten en corrigeren van de chromatische verschuivingen voor. Chromagnon meet chromatische verschuivingen in twee stappen. De eerste stap verwerft de "globale" of "affine" uitlijning parameters van de vertaling in de X, Y, Z assen, vergroting langs de X, Y, Z assen, en rotatie rond de Z-as. De berekening nauwkeurigheid van de globale uitlijning is ~ 16 nm in 3D en ~ 8 nm in 2D. De tweede stap is een optionele 2D iteratieve "lokale uitlijning" op geprojecteerde afbeeldingen om een hogere nauwkeurigheid te verkrijgen. In het lokale uitlijningsproces worden de afbeeldingen onderverdeeld in meerdere regio's en worden chromatische verschuivingen in deze lokale regio's gemeten. Vervolgens worden de regio's verder verdeeld en chromatische verschuivingen in de subregio's worden iteratief gemeten totdat het aantal pixels in de regio het minimumaantal pixels (meestal 60 x 60 pixels) bereikt. De resulterende lokale uitlijningskaart wordt gecombineerd met de parameter globale uitlijning en wordt door een elastische transformatie op de doelafbeelding toegepast. Na deze stap wordt de berekeningsnauwkeurigheid verbeterd tot ~ 14 nm in 3D en ~ 6 nm in 2D. De lokale uitlijning is niet geschikt voor biologische kalibratiereferentiebeelden omdat de biologische structuur in de referentie verschilt van die in het doel(tabel 1). Daarom wordt alleen globale uitlijning gebruikt voor biologische kalibratiereferentiebeelden.
De lokale chromatische verschuivingen zijn afkomstig uit twee bronnen; microscoop instrumentele lokale vervorming en biologische structurele inhomogeniteit. Omdat microscoop instrumentale lokale vervorming constant is, kan dit worden gemeten aan de hand van het veelkleurige kralenreferentiemonster en gecorrigeerd als een vaste parameter. Chromagnon kan de microscoop instrumentale lokale vervormingskaart en de globale uitlijningsparameters van de biologische kalibraties combineren(tabel 1). Met behulp van deze methode wordt verwacht dat de gemiddelde nauwkeurigheid van biologische kalibratie zal worden verbeterd met een extra 1−2 nm.
Hier beschrijven we een protocol om de chromatische verschuivingen van 3D-fluorescentiebeelden te corrigeren met behulp van onze software Chromagnon, van de gemakkelijkste lage kant tot de hoogste nauwkeurigheid. We gebruiken immunostaining van HeLa-cellen als voorbeeld en hebben ze geobserveerd met behulp van 3D-breedveldmicroscopie en 3D-SIM. In het eerste deel beschrijven we hoe we doelmonsters en biologische kalibratiemonsters kunnen voorbereiden. Dit deel van het protocol moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke doelstellingen van het onderzoek. In het tweede deel beschrijven we de acquisitiemethoden voor drie soorten referentiebeelden door microscopen. De veronderstelling was om blauwe, groene en rode kanalen te verkrijgen, maar kanaalsamenstelling moet worden gewijzigd door de specifieke doelen van het onderzoek en door de opstellingen van de microscoop. Het maakt niet uit of de microscoop is uitgerust met een enkele camera of meerdere camera's. In het derde deel beschrijven we hoe men onze software kan gebruiken om chromatische verschuivingen van de doelafbeelding te meten en te corrigeren met behulp van referentiebeelden. Ten slotte beschrijven we in het vierde deel een methode om de biologische kalibratiereferentiebeelden aan te vullen met behulp van de instrumentale lokale kalibratie van een microscoop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

Kwantitatieve multicolor fluorescentie microscopie is gebaseerd op de zorgvuldige ruimtelijke matching van kleur kanalen verworven op verschillende golflengten. Als gevolg van chromatische aberratie en de onvolmaakte uitlijning van camera's, beelden verworven in elk kanaal kan worden verschoven, en vergroot, evenals gedraaid ten opzichte van elkaar in een van de drie dimensies. Met de klassieke kalibratiemethode worden chromatische verschuivingen gemeten door veelkleurige kralen die aan het oppervlak van een coverslip zijn bevestigd, en een aantal software is beschikbaar om de chromatische verschuivingen van dergelijke kalibratiemonsters te meten. Chromatische aberratie kan echter variëren met diepte, veranderen met observatieomstandigheden en worden veroorzaakt door het biologische monster zelf, waardoor de bepaling van de werkelijke hoeveelheid chromatische verschuiving in het monster van belang en over het volume wordt belemmerd. Het corrigeren van chromatische verschuivingen bij hogere nauwkeurigheid is met name relevant voor microscopie met superresolutie, waarbij slechts lichte chromatische verschuivingen kwantitatieve analyses kunnen beïnvloeden en de interpretatie van veelkleurige beelden kunnen veranderen. We hebben een open-source software Chromagnon en bijbehorende methoden ontwikkeld om 3D chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten en te corrigeren. Hier bieden we een gedetailleerd toepassingsprotocol dat speciale vereisten bevat voor monstervoorbereiding, gegevensverwerving en softwareverwerking om chromatische verschuivingen in biologische monsters van belang te meten.

Een voorbeeld van chromatische verschuivingscorrectie met behulp van een kruistalkreferentieafbeelding wordt weergegeven in figuur 5. Het beeld werd verkregen met een breedveldmicroscoop uitgerust met een enkele camera. Fluorescentie-emissie van DAPI werd gebruikt als referentie (Figuur 5A,B) om de blauwe, groene en rode kanalen te corrigeren. Het beeld bestaat uit 3 kanalen van 60 Z segmenten, elk samengesteld uit 256 x 256 pixels. De beelden werden gedeconvolveerd alvorens de chromatische verschuivingen te meten. Het meten van de lokale chromatische verschuivingen met Chromagnon nam 51 s op een Mac met Intel Core i7 (quad core, 8-threads, 2,7 GHz), 16 GB RAM en 1 TB flashopslag. De uitlijnparameter is toegepast op de doelafbeelding(figuur 5C,D),die exact hetzelfde aantal voxels heeft als de referentieafbeelding. Het voorbereiden van het uitgelijnde bestand duurde 3 s. Als gevolg van het bijsnijden van de randpixels tijdens het uitlijningsproces(selectievakje tussen de marges bijsnijden in figuur 1C),werd het aantal voxels verminderd na uitlijning(figuur 5B, 51 Z-segmenten, 252 x 251 pixels). DNA in de anafasebrug (aangegeven door pijlpunten) wordt verkeerd buiten de nucleaire envelop voor uitlijning(Figuur 5C, duidelijk in het onderste paneel met de XZ-weergave), maar zoals verwacht in de envelop na uitlijning(figuur 5D).
Een voorbeeld van chromatische verschuivingscorrectie met behulp van een biologische kalibratiereferentieafbeelding wordt weergegeven in figuur 6. De beelden werden verkregen met een SIM-microscoop uitgerust met drie camera's. Drie beelden van HeLa cellen bevlekt met phalloidins geconjugeerd aan blauw, groen, en rode kleurstoffen werden gemiddeld (Figuur 6A). De referentieafbeelding bestaat uit 3 kanalen van 76 Z-segmenten, elk samengesteld uit 1.024 x 1.024 pixels. Het meten van chromatische verschuivingen met Chromagnon zonder lokale uitlijning vereist 194 s op het Mac-systeem hierboven beschreven. De parameter werd toegepast op een doelafbeelding bestaande uit 3 kanalen van 73 Z-segmenten, elk samengesteld uit 1.024 x 1.024 pixels. Generatie van het uitgelijnde bestand duurde 25 s. De XZ-weergave toont onjuiste kanaalposities langs de Z en iets langs de X-richtingen(figuur 6A,C), maar deze verkeerde registratie werd gecorrigeerd na uitlijning(figuur 6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> Figuur 5: Een voorbeeld van uitlijning met een kruistalkreferentieafbeelding. HeLa cellen werden bevlekt met DAPI voor DNA (weergegeven in magenta), Alexa Fluor 488 (weergegeven in geel) voor nucleaire envelop, en Alexa Fluor 555 (weergegeven in blauw) voor microtubuli. Beelden werden verkregen door 3D wide-field microscopie met een enkele camera en gedeconvolved. (A,B) Een representatieve crosstalk referentieafbeelding met DAPI-emissie, voor en na uitlijning door Chromagnon. Drie kleurkanalen worden weergegeven als bedekt. (C,D) Een optisch gedeelte van de 3D-stack in drie kanalen voor en na uitlijning. Axiale chromatische aberratie is duidelijk bij de anaphasebrug die door pijlpunten wordt getoond. Schaalbalk in paneel A geeft 5 μm aan voor alle panelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> Figuur 6: Een voorbeeld van uitlijning met een biologische kalibratiereferentieafbeelding Beelden werden verkregen met 3D-SIM uitgerust met drie camera's. (A,B) Een referentieafbeelding gemiddeld van drie beelden voor (A) en na (B) uitlijning. HeLa cellen werden bevlekt met phalloidin geconjugeerd met Alexa Fluor 405, 488 of 594. (C,D) De doelafbeelding voor (C) en na (D)uitlijning. HeLa cellen werden bevlekt met DAPI voor DNA (weergegeven in magenta), Alexa Fluor 488 (weergegeven in geel) voor nucleaire envelop, en Alexa Fluor 594 (weergegeven in blauw) voor microtubuli. Schaalbalk in paneel A geeft 5 μm aan voor alle panelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correctie van chromatische verschuivingen in driedimensionale (3D) multicolor fluorescentie microscopie beelden is cruciaal voor kwantitatieve data-analyses. Dit protocol is ontwikkeld om chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten en te corrigeren door het verwerven van geschikte referentiebeelden en verwerking met de open-source software, Chromagnon.

Hoge nauwkeurigheid correctie van 3D Chromatische verschuivingen in het tijdperk van super-resolutie biologische beeldvorming met behulp van Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Marsh koraal microscopie beelden bevatten Chromatic Shift in drie dimensies. Dat schaadt de colocalisatie-analyse van beelden met hoge resolutie. Het is over het algemeen moeilijk om Chromatic Shift afkomstig van een biologisch monster zelf te verwijderen, onze methode kan chromatische verschuiving in een biologisch monster corrigeren met behulp van afzonderlijk verworven referentiebeelden.Het aantonen van de procedure zal Takako Koujin een technicus van mijn groep. Begin met het zaaien van 2,5 keer 10 tot de vijfde genezer cellen op een 35 millimeter glazen bodem schotel en groeien ze in een koolstofdioxide incubator. Na 24 uur incubatie vervang het medium door twee milliliter van 3,7% formaldehyde in PBS en meng zachtjes.Bevestig de verkoop gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een roterend platform. Was de cellen drie keer met twee milliliter PBS gedurende vijf tot tien minuten. Permeabiliseren ze met twee milliliter van punt 1%probeer de volgende 100 in PBS tijdens het draaien en herhaal de wasbeurten met PBS.Bevlek vervolgens de cellen met behulp van een standaard antilichaam kleuring protocol zoals beschreven in de tekst manuscript. Om een referentiebeeld van crosstalk referentie voor widefield microscopie te verkrijgen, voeg twee milliliter van punt vijf microgram per milliliter Dappy om te verblijven in het DNA. Laat de cellen 30 minuten op het roterende platform staan.Vervang vervolgens de oplossing door 100 microliters van montagemedium Om een referentiebeeld te verkrijgen van biologische kalibratiereferentie voor elke vorm van microscopie, inclusief confocale en superresolutie microscopie. Fix de cellen zoals eerder beschreven, en bereid de voorraad oplossing een fluorescerende kleurstof geconjugeerde phalloïdine in 1,5 milliliter methanol. Voeg de phalloidin in PBS bij een verdunning van een tot 100 voor Alexa vloer 405 een tot 1000 voor Alexa vloer 488 en een tot 200 voor Alexa vloer 594.Voeg een milliliter van de oplossing aan de cellen en uitbroed ze gedurende 30 minuten tijdens het draaien. Was de cellen drie tot vijf keer met twee milliliter PBS. Vervang vervolgens de PBS door 100 microliter montagemedium.Om fluorescentiebeelden te verkrijgen met behulp van widefield microscopie plaats het doelmonster op de microscoop in de beeldsoftware, open het ontwerp en voer experiment venster, stel de juiste Z stap en selecteer de blauwe, groene en rode kanalen. Voeg op het tabblad Uitvoeren de naam van het afbeeldingsbestand toe en begin met beeldvorming. Als u kruistalkreferentiebeelden wilt verkrijgen voor het meten van Chromatische verschuivingen in het monster, selecteert u alleen het excitatielicht voor Dappy en gebruikt u exact dezelfde fasepositie en Z-hoogte als voor het doelmonster.U ook een helder veldbeeld gebruiken als referentieplaats naar het doelmonster op de brede veldmicroscoop en een fluorescentiebeeld van het doel in blauwe, groene en rode kanalen verwerven. Verwerf vervolgens heldere veldbeelden van het doel in blauwe, groene en rode kanalen in exact dezelfde fasepositie en met dezelfde Z-hoogte. Om fluorescentiebeelden te verkrijgen met behulp van microscopie met superresolutie, zoals 3D Sim, plaats het doelmonster op de microscoop en krijgt u een fluorescentiesimbeeld van het doel in blauwe, groene en rode kanalen.Reconstrueren vervolgens de super opgeloste afbeelding. Plaats vervolgens het monster vlek met veelkleurige phalloidin op een 3D sim microscoop. En het verwerven van meerdere fluorescentie sim beelden als de biologische kalibratie referentie beelden in punt fase posities, dan reconstrueren de super opgeloste beelden.Gebruik een webbrowser om de nieuwste binaire release van Chromagnon te downloaden. Haal het programma eruit en plaats het uitvoerbare bestand op een handige locatie. Sleep en drop de referentiebestanden van het rechterveld crosstalk of biologische kalibratieverwijzingen naar het referentievak of klik op referentiebestanden om een dialoogvenster voor bestandskiezer te openen.Als het programma vraagt om een Java Development Kit te installeren, drukt u op Ja en navigeert u naar de gedownloade pagina. Download en installeer vervolgens de JDK voor het besturingssysteem zoals geïnstrueerd. Sleep en laat de doelbestanden van antilichaamvlekken in de doeldoos vallen.Kies een uitvoerafbeeldingsindeling en geef het achtervoegsel op voor de uitvoerbestandsnaam. Voor crosstalk referentiebeelden met een hoge signaal-ruisverhouding. Kies projectie uit de keuzelijst van lokaal uitlijnen en gebruik een minimale venstergrootte van 60.Controleer voor een meervoudig biologisch kalibratiereferentieafbeeldingen de optie gemiddelde verwijzingen En kies er geen voor lokaal uitlijnen en klik vervolgens op alles uitvoeren om metingen te starten. Als u ervoor wilt zorgen dat de meting correct is uitgevoerd, sleept en zet u de referentieafbeeldingen in het referentievak en het doelvak. Voer vervolgens het programma uit en controleer of de afbeeldingen perfect overlappen.Chromatische Shift Correctie in widefield microscopie kan worden uitgevoerd met behulp van een crosstalk referentieafbeelding. Dit beeld werd verkregen met een breedveldmicroscoop die met één enkele camera wordt uitgerust. Fluorescentie-emissie van Dappy werd gebruikt als een verwijzing naar de blauwe, groene en rode kanalen te corrigeren.Na uitlijning met Chromagnon werd de Chromatische Verschuiving en het referentiebeeld gecorrigeerd. Wanneer de uitlijningsparameter door Chromagnon op het doelbeeld werd toegepast, worden het DNA en de anafasebrug, die verkeerd buiten de nucleaire envelop wordt gezien voordat de uitlijning in de envelop wordt weergegeven, verkeerd weergegeven. Chromatische Shift Correctie van een 3D sim afbeelding kan worden uitgevoerd met behulp van een biologische kalibratie referentieafbeelding.Drie 3D sim beelden van HeLa cellen bevlekt met phalloidins vervoegd aan blauwe, groene en rode kleurstoffen werden veredolen en de Chromatische Verschuiving werd gemeten door Chromagnon. Na uitlijning werd de Chromatische Shift en de referentieafbeelding gecorrigeerd. De uitlijnparameter is toegepast op een doelafbeelding.De XZ-weergave toont een onjuiste kanaalpositie langs de Z en iets langs de X-richtingen, die na uitlijning zijn gecorrigeerd. Voor de beste prestaties is het belangrijk om referentiebeelden te verkrijgen onder dezelfde omstandigheden en de timing als een doelafbeeldingen.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...