Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 à A.M., JP18H05528 et JP17H03636 à T.H., et JP17H01444 et JP18H05533 à H.Y. L.S. reconnaît le soutien des Welcome Trust Strategic Awards 091911 et 107457/Z/15/Z finance l’imagerie avancée chez Micron Oxford.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La procédure de correction chromatique est un compromis entre l’exactitude et l’effort. Pour économiser les efforts inutiles, il est préférable de savoir combien de précision est nécessaire pour votre étude. La plus grande précision peut ne pas être requise pour l’imagerie conventionnelle à large champ (en direct), et par conséquent, des images de référence de champ lumineux sont souvent suffisantes pour corriger le décalage chromatique. De même, lorsque l’état d’imagerie et l’environnement sont constants, l’utilisation répétée d’un étalonnage biologique permettra de gagner du temps. D’autre part, si un enregistrement très précis est souhaité, des images de référence de haute qualité sont nécessaires. Pour la meilleure performance, les images de référence doivent être obtenues avec des conditions et des timings aussi similaires que possible aux images cibles. Tant que les images de référence et de cible sont obtenues par la même microscopie, une résolution spatiale plus élevée améliorera la précision de correction. Si la déconvolution est disponible pour les images de référence et de cible, l’implémentation de cette méthode avant correction peut améliorer l’exactitude de la correction. En outre, pour la meilleure performance, le théorème d’échantillonnage de l’axe optique (Z) doit être rempli dans le fichier de référence et de cible pour une interpolation sous-pixel précise (étape 2.1.3 du protocole).
Le défaut de corriger le décalage chromatique conduit à des conclusions erronées. En outre, l’utilisation d’un mauvais étalonnage peut même aggraver les changements chromatiques plutôt que de les corriger, et cela doit donc être évité. Nous avons résumé les causes possibles des échecs et leurs solutions communes dans le tableau 2. Pour examiner la cause d’une défaillance, il est d’abord nécessaire de vérifier visuellement si le décalage chromatique de l’image de référence est corrigé avec précision (étape 3.12 du protocole). La plupart des défaillances sont dues à la qualité des images de référence et sont facilement corrigées selon les descriptions du tableau 2. En ce qui concerne la qualité des images de référence, il est important de noter que l’exactitude de l’alignement global diminue si l’ensemble du champ de vision n’est pas rempli de l’échantillon (Figure 7, Tableau 2). Par rapport au bon exemple illustré à la figure 7A, le mauvais exemple illustré à la figure 7B ne contient que trois enveloppes nucléaires dans la région de la gauche supérieure, et Chromagnon n’a pas réussi à aligner une partie de cette image. C’est parce que la méthode d’alignement global de Chromagnon divise le champ de vision en quatre régions (Figure 7C) afin de mesurer les différences de rotation et de grossissement avec une grande précision3. Cette méthode, si elle est correctement exploitée, est un ordre plus précis que d’autres méthodes linéaires telles que la transformation polaire de journal et les méthodes simplex3. Si l’une des quatre régions n’est pas disponible, Chromagnon passera à des méthodes linéaires moins efficaces. Par conséquent, pour la meilleure performance, les exemples présentés à la figure 7B et à la figure 7C ne sont pas souhaitables, et les quatre régions doivent être remplies d’objets. Les utilisateurs peuvent vérifier si une région quadratique du champ de vision n’est pas disponible pour la mesure en regardant le fichier journal (« Chromagnon.log »; voir l’étape 3.10 du protocole). Heureusement, ce problème peut être facilement surmonté en faisant la moyenne de plusieurs images d’étalonnage biologique ou en utilisant l’alignement local pour les images de référence en crosstalk ou bright-field (tableau 2). Contrairement au cas où il n’a pas corrigé les images de référence, il est plus difficile d’identifier l’échec de la correction des images cibles. Étant donné que ces défaillances surviennent en raison de différences dans les formats de fichiers, les conditions d’imagerie, les synchronisations d’imagerie, les méthodes d’imagerie et d’alignement entre les images de référence et les images cibles (tableau 2), les utilisateurs doivent toujours être prudents lorsqu’ils utilisent des images de référence obtenues dans des conditions/timings différents à partir des images cibles. Quelques images d’exemple sont disponibles pour l’essai (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>) pour obtenir une idée concrète des images de bon et mauvais exemple.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problème</td>
			<td>Cause</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
<tr>
<td>Échec de la correction de l’image de référence</td>
			<td>Faible contraste</td>
			<td>Acquérir une image de contraste plus élevé si possible. Si une image de référence de champ lumineux est utilisée, réacquez l’image dans une solution à base d’eau pour obtenir un contraste plus élevé de la cellule. Sinon, essayez d’appliquer la réduction du bruit computationnelle (p. ex. filtrage gaussien). Éteignez l’alignement local, qui est plus sensible au bruit.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Contamination d’images non liées</td>
			<td>Supprimez la source des images non reliées dans l’échantillon si possible. Pour les images de référence croisées, vérifiez les spectres d’excitation des colorants utilisés pour les images cibles. Si les colorants sont excités lors de l’acquisition d’une image à crosstalk (p. ex. Alexa Fluor 568 ou 594), considérez d’autres colorants (p. ex. Alexa Fluor 555). Si les poussières sur la puce de la caméra créent une différence évidente de canal, nettoyez la puce de la caméra ou utilisez une méthode de mise à l’air plat computationnelle.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Un point extrêmement lumineux fait par un rayon cosmique</td>
			<td>Acquérir l’image à nouveau si possible. Sinon, essayez d’appliquer la réduction du bruit computationnelle (p. ex. filtrage médian ou gaussien).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Artefacts de déconvolution (signaux artificiels sur les bords axials et latéraux)</td>
			<td>Coupez les pixels de bord ou les sections Z après la déconvolution. Si un côté est coupé, l’autre côté doit également être coupé pour maintenir le centre d’image.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>La taille de l’étape Z trop clairsemée</td>
			<td>Une pile Z doit être acquise pour satisfaire au critère nyquiste tel qu’il est écrit dans le protocole 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Aberration optique</td>
			<td>L’aberration sphérique est l’aberration majeure causée par les utilisateurs. Choisissez la lentille objective de l’échantillon et utilisez une épaisseur de 170 μm. Si la lentille objective est équipée d’un anneau de correction, réglez-le pour trouver la position où le plus grand nombre de fluorescence est obtenu à partir de la mise au point. Dans le cas d’un objectif d’immersion d’huile sans anneau de correction, ajuster l’indice de réfraction de l’huile d’immersion qui augmente le nombre de fluorescence au point.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Le champ de vision n’est pas rempli (fig. 7)</td>
			<td>Dans le cas des images de référence d’étalonnage biologique, la moyenne de nombreuses images. Dans le cas d’images de référence en crosstalk ou en champ lumineux, utilisez l’alignement local.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Un bug logiciel non identifié</td>
			<td>Signaler le problème par GitHub (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Échec de la correction de l’image cible</td>
			<td>Les métadonnées du fichier image sont perdues</td>
			<td>Utilisez le format de fichier microscope d’origine qui contient des métadonnées complètes et évitez de les convertir en un fichier tiff multipage avant le traitement. Utilisez la même commande de canaux que celle écrite dans le protocole 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Méthodes d’alignement erronées pour la microscopie donnée</td>
			<td>N’appliquez pas la méthode d’alignement locale lors de la mesure des images de référence d’étalonnage biologique aux images cibles. N’utilisez pas d’images de référence croisées autres que la microscopie à large champ.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Différences dans les conditions d’imagerie</td>
			<td>Maintenez les conditions d’imagerie constantes entre la référence et les images cibles telles qu’écrites dans le protocole 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Différences dans l’échantillon (y compris le couvercle)</td>
			<td>Utilisez toujours le même support de montage, le couvercle (p. ex. no 1.5H) et une profondeur de mise au point similaire.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dérive de microscope depuis que l’étalonnage a été fait pour la dernière fois</td>
			<td>Faire un étalonnage aussi souvent que toutes les deux semaines. Maintenez la température constante et utilisez une table flottante pour éviter la dérive matérielle du microscope.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Dépannage pour correction chromatique.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> Figure 7 : Exemples d’images de référence. Enveloppe nucléaire dans les cellules de levure de fission étiquetées avec GFP et mCherry. Les images ont été acquises avec la microscopie conventionnelle de large champ. Les décalages chromatiques ont été corrigés à l’aide de Chromagnon sans alignement local en utilisant les images elles-mêmes comme images de référence. Les images ont ensuite été déconcertantes pour montrer les détails. (A) Un bon exemple avec de nombreux objets dans le champ de vision. (B) Un mauvais exemple avec des objets seulement dans le coin supérieur gauche. Le désalignement est évident dans une certaine région de l’image. (C) Un exemple indésirable où l’une des quadrisection (séparée par des lignes transversales pointillées) est vide. La barre d’échelle du panneau A indique 5 μm pour la vue sur le terrain complète et 1,25 μm pour la vue agrandie et s’applique à tous les panneaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Dans ce protocole, nous avons décrit trois types de référence différents (tableau 1). Parmi eux, les images de référence croisées et les images de référence d’étalonnage biologique nécessitent une discussion plus approfondie. Pour les images de référence croisées, les échantillons tachés de DAPI ou de Hoechst 33342, et montés dans des supports de montage de glycérol ou commerciaux peuvent être utilisés efficacement pour aligner les canaux bleus, verts et rouges. De même, Alexa Fluor 488 peut être utilisé pour aligner les canaux verts et rouges. Cependant, l’obtention de fluorescence de crosstalk est souvent difficile puisque beaucoup de colorants bleus excepté DAPI et Hoechst sont plus faibles et se désintègrent plus rapidement que la plupart des colorants verts et rouges. En outre, les spectres d’émission des colorants modernes sont plus étroits, ce qui rend l’alignement de plus de trois canaux par cette méthode difficile. Il convient également d’accorder une attention particulière à certains colorants rouges courants (p. ex., Alexa Flour 568 et 594, mais pas Alexa Fluor 555) qui peuvent être excités par la lumière violette, qui empêchent d’obtenir des images à haute contraste à partir de colorants bleus. Un autre inconvénient est que cette méthode ne peut pas mesurer l’aberration chromatique des chemins lumineux d’excitation dans l’excitation multicolore, parce qu’une seule longueur d’onde d’excitation est utilisée pour l’excitation (Tableau 1). Comme la plupart des microscopies avancées utilisent des optiques d’éclairage modifiées, l’application de cette méthode est limitée. Néanmoins, sa précision de correction plus élevée est suffisamment avantageuse pour qu’elle soit décrite dans ce protocole. En général, une image crosstalk doit être prise après une image cible pour prévenir le blanchiment ou les effets phototoxiques. Pour smlm observé avec le mode large-champ, une image de référence devrait être acquise avant d’acquérir une image cible car les colorants de fluorescence peuvent être blanchis pendant l’imagerie.
Les images de référence d’étalonnage biologique permettent aux utilisateurs d’aligner facilement le nombre souhaité de canaux au coût de la préparation supplémentaire de l’échantillon. Un autre avantage des images de référence d’étalonnage biologique est la disponibilité de références multiples « moyennes » qui aident à remplir tous les champs de vue. Cette méthode peut souffrir de différences dans les conditions d’imagerie si l’échantillon d’étalonnage est préparé sur une diapositive différente. La plupart de ce problème peut être résolu si les cibles et les références sont préparées sur la même diapositive à l’aide de verres à couverture chambrés commerciaux(tableau 1),et d’autres conditions d’imagerie sont maintenues constantes comme à l’étape 2.3.3. Dans ce cas, on peut s’attendre à une précision de correction similaire à celle des images de référence crosstalk3. Le protocole pour utiliser la phalloïdine comme indiqué ici est l’un des moyens les plus faciles de tacher une structure cellulaire unique avec plusieurs couleurs. Il existe de nombreux scénarios possibles pour préparer des échantillons d’étalonnage biologique. Pour l’immunostaining, un échantillon peut être étiqueté avec un seul anticorps primaire suivi de la coloration avec des anticorps secondaires de plusieurs couleurs. De cette façon, une structure cible unique peut être étiquetée avec plusieurs couleurs. Alternativement, 5-éthylyl-2'-désoxyuridine, détecté par « clic » étiquettes de chimie nouvellement synthétisé l’ADN dans plusieurs couleurs à haute densité, comme décrit en détail précédemment8. Pour les cellules vivantes, il est utile de préparer une souche transgénique abritant deux copies d’un gène qui sont fusionnées à GFP ou mCherry pour étiqueter la même structure avec deux couleurs. Si le numéro de copie du gène est critique comme souvent observé pour les protéines membranaires, une seule copie du gène peut être fusionnée en tandem à GFP et mCherry (Figure 7). Les protéines fluorescentes photoconvertibles, telles que le mEOS218,peuvent également être utilisées en illuminant un niveau modéré de lumière violette pour obtenir les deux espèces protéiques avec ou sans photoconversion. Dans des conditions de faible teneur en oxygène, GFP peut également être utilisé comme une protéine photoconvertible du vert au rouge19,20. Le choix du bon échantillon d’étalonnage rendra ainsi l’expérience plus robuste.

L’imagerie multicolore est l’un des aspects fondamentaux de la microscopie de fluorescence biologique, dans les cas où la relation spatiale de différentes molécules ou structures est d’un intérêt majeur. L’aberration chromatique, une aberration optique de la lumière polychromatique causée par la dispersion, modifie la position apparente des objets colorés d’intérêt. De même, les microscopes équipés de plusieurs caméras consacrées à l’acquisition de chaque couleur ont des changements chromatiques plus complexes en raison des différences dans les éléments optiques et l’alignement imparfait entre les canaux. Ainsi, de tels changements chromatiques peuvent conduire à une fausse conclusion à moins d’être explicitement corrigés par l’utilisateur. Bien que les changements chromatiques n’aient pas été un problème majeur tant que la résolution de la microscopie est limitée par la limite classique de résolution, le développement récent de la microscopiesuper-résolution 1 a incité la nécessité d’une correction plus précise des changements chromatiques.
Il a été une pratique courante de mesurer les changements chromatiques des systèmes de microscope à l’aide d’une diapositive multicolore d’étalonnage des perles2. La méthode d’étalonnage à base de perles est appropriée pour mesurer les déplacements chromatiques de l’ensemble de l’optique du microscope vers la surface du couvercle2. Cette méthode, cependant, est incapable de mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques d’intérêt. Il est important de noter que de nombreux échantillons biologiques sont tridimensionnels (3D), et les déplacements chromatiques de ces échantillons sont différents de ceux à la surface du couvercle. En outre, les changements chromatiques changent avec les conditions d’imagerie2,3. Nous avons mesuré les changements chromatiques dans les échantillons biologiques 3D et constaté que l’incertitude des changements chromatiques était souvent jusqu’à 350 nm par la méthode classique d’étalonnage multicolore-perle3. Par conséquent, les changements chromatiques doivent être mesurés dans des échantillons biologiques à la profondeur d’intérêt et dans les conditions d’imagerie utilisées.
Ici, nous décrivons les procédures pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques et corriger ces changements à l’aide de notre logiciel, Chromagnon3. Pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques, notre méthode utilise deux types d’ensembles de données, une image « cible » et une image « de référence ». L’image « cible » est une image multicolore d’intérêt, par exemple, des images tachées d’ADN, d’enveloppe nucléaire et de microtubules. Il est souvent impossible de mesurer les changements chromatiques dans une telle image. Par conséquent, nous avons besoin d’une image de « référence » qui est dédiée à la mesure des changements chromatiques dans l’échantillon. La seule définition d’une image de « référence » est une image multicolore du même objet. En ce sens, une image multicolore de perles est également un type d’image de référence. Ici, nous décrivons trois types différents d’image de référence qui sont utilisés pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques : « images de référence croisées », « images de référence de champ lumineux » et « images de référence d’étalonnage biologique ». Le type d’image de référence dépend du type de microscope utilisé ou de l’exactitude de correction requise comme résumé dans le tableau 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Crosstalk</td>
			<td>Champ lumineux</td>
			<td>Étalonnage biologique (sur une diapositive différente)</td>
			<td>Étalonnage biologique (sur la même diapositive)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Précisiona
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Simplicité</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microscopie applicable</td>
			<td>Champ large</td>
			<td>Champ large</td>
			<td>Tous</td>
			<td>Tous</td>
		</tr>
<tr>
<td>Disponibilité de l’alignement local</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: Nombre de « » indique une note croissante. Single plus est d’environ 50 nm et trois plus est d’environ 15 nm en 3D. b: La précision dépend de la durée de la constante des conditions d’imagerie. c: L’étalonnage local mesuré par des échantillons de perles multicolores peut être combiné tel que décrit à la section 4 du protocole.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Paramètres lors du choix du type d’images de référence.
Les « images de référence Crosstalk » ont la plus grande précision de correction et sont relativement simples à réaliser3,4 (Tableau 1). L’inconvénient est leur limitation dans les applications de microscopie en raison de leur incapacité à mesurer les changements chromatiques dans les chemins d’excitation. En outre, pour obtenir de telles images, le microscope doit être équipé de miroirs dichroiques multibands, et de filtres d’émission qui sont contrôlés indépendamment des filtres d’excitation ou des sources lumineuses. La microscopie appropriée comprend la microscopie classique à large champ, la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) comme la microscopie de localisation/microscopie de reconstruction optique stochastique (PALM/STORM)5,,6 et la microscopie d’expansion7 observée avec la microscopie à large champ. Une image de référence croisée est acquise à partir de l’échantillon cible lui-même. Il s’agit d’une image de fluorescence croisée (saignement) d’un colorant obtenu dans tous les canaux requis. L’émission de fluorescence se développe toujours vers les longueurs d’onde plus longues, c’est pourquoi les colorants avec la longueur d’onde d’émission la plus courte sont excités d’obtenir la fluorescence croisée dans les canaux de longueurs d’onde plus longues. Par exemple, lorsque l’échantillon est taché de bleu, de vert et de rouge, seul le colorant bleu est excité, et la lumière d’émission est obtenue dans les canaux bleu, vert et rouge. Dans ce protocole, l’ADN taché de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été utilisé pour obtenir la fluorescence de crosstalk.
Les « images de référence de champ lumineux » sont une alternative plus facile et moins phototoxique aux « images de référence croisées » mais sont les3 moins précises (tableau 1). Il s’agit d’images lumineuses de l’échantillon cible, acquises dans tous les canaux de couleur utilisés dans l’image cible.
Les « images de référence d’étalonnage biologique » ont l’avantage de s’appliquer à tout type de microscopie en raison de leur capacité à mesurer les changements chromatiques tant dans les voies d’excitation que dans les voies d’émission3,8 (Tableau 1). La microscopie appropriée comprend la microscopie à large champ, la microscopie confocale, la microscopie de feuille de lumière, l’épuisement stimulé des émissions (STED)9, la microscopie d’éclairage structurée (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM observé avec le mode de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF), super résolution Olympus (OSR)13, et ainsi de suite. Une image de référence d’étalonnage biologique est acquise à partir d’un échantillon d’étalonnage préparé de la même façon que l’échantillon cible, mais avec la coloration d’une seule structure avec plusieurs couleurs. La précision de correction excelle dans la résolution de la plupart des microscopies à super résolution et la préparation d’un échantillon d’étalonnage biologique peut être relativement simple. Un autre avantage est la disponibilité pour « ess » plusieurs images de référence. Par conséquent, même si les images individuelles contiennent de mauvaises informations pour la mesure des changements chromatiques, le contenu de l’information peut être augmenté en moyenne plusieurs images. La précision dépend de la façon dont les conditions d’imagerie sont maintenues constantes. À cet égard, la meilleure performance est obtenue lorsque les échantillons cible et de référence sont sur la même diapositive, en utilisant, par exemple, des verres à couverture à chambre de 8 puits(tableau 1, à droite). Dans ce protocole, l’actine tachée de trois couleurs de phalloïdine a été utilisée comme étalonnage biologique.
Une fois qu’une image de référence est obtenue, le décalage chromatique est mesuré et corrigé par notre logiciel Chromagnon. Il n’y a aucune limitation sur le nombre de canaux, les sections Z et les délais que Chromagnon peut mesurer et corriger les changements chromatiques pour. Chromagnon mesure les changements chromatiques en deux étapes. La première étape acquiert les paramètres d’alignement « global » ou « affine » de la traduction dans les axes X, Y, Z, grossissement le long des axes X, Y, Z et rotation autour de l’axe Z. La précision de calcul de l’alignement global est de ~16 nm en 3D et ~8 nm en 2D. La deuxième étape est un « alignement local » itératif 2D en option sur les images projetées afin d’obtenir une précision plus élevée. Dans le processus d’alignement local, les images sont subdivisées en plusieurs régions et les changements chromatiques dans ces régions locales sont mesurés. Par la suite, les régions sont encore divisées et les changements chromatiques dans les sous-régions sont mesurés itérativement jusqu’à ce que le nombre de pixels dans la région atteigne le nombre minimum de pixels (généralement 60 x 60 pixels). La carte d’alignement locale qui en résulte est combinée avec le paramètre d’alignement global et est appliquée à l’image cible par une transformation élastique. Après cette étape, la précision de calcul est améliorée à ~14 nm en 3D et ~6 nm en 2D. L’alignement local n’est pas adapté aux images de référence d’étalonnage biologique parce que la structure biologique de la référence est différente de celle de la cible (tableau 1). Par conséquent, seul l’alignement global est utilisé pour les images de référence d’étalonnage biologique.
Les changements chromatiques locaux proviennent de deux sources; microscope distorsion locale instrumentale et inhomogeneity structurel biologique. Étant donné que la distorsion locale instrumentale au microscope est constante, elle peut être mesurée à partir de l’échantillon de référence de perles multicolores et corrigée comme paramètre fixe. Chromagnon peut combiner la carte de distorsion locale instrumentale du microscope et les paramètres d’alignement global des étalonnages biologiques (tableau 1). À l’aide de cette méthode, on s’attend à ce que la précision moyenne de l’étalonnage biologique soit améliorée de 1 à 2 nm supplémentaires.
Ici, nous décrivons un protocole pour corriger les décalages chromatiques des images de fluorescence 3D à l’aide de notre logiciel Chromagnon, du bas de gamme le plus facile à la plus haute précision. Nous utilisons l’immunostaining des cellules HeLa comme exemple et les avons observées à l’aide de la microscopie 3D à large champ et de la 3D-SIM. Dans la première section, nous décrivons comment préparer des échantillons cibles et des échantillons d’étalonnage biologique. Cette partie du protocole doit être optimisée pour les cibles spécifiques de la recherche. Dans la deuxième section, nous décrivons les méthodes d’acquisition de trois types d’images de référence au microscope. L’hypothèse était d’obtenir des canaux bleus, verts et rouges, mais la composition des canaux devrait être modifiée par les cibles spécifiques de la recherche et par les configurations du microscope. Peu importe si le microscope est équipé d’une seule caméra ou de plusieurs caméras. Dans la troisième section, nous décrivons comment on peut utiliser notre logiciel pour mesurer et corriger les changements chromatiques de l’image cible en utilisant des images de référence. Enfin, dans la quatrième section, nous décrivons une méthode pour compléter les images de référence d’étalonnage biologique en utilisant l’étalonnage local instrumental d’un microscope.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

La microscopie quantitative de fluorescence multicolore repose sur l’appariement spatial soigneux des canaux de couleur acquis à différentes longueurs d’onde. En raison de l’aberration chromatique et de l’alignement imparfait des caméras, les images acquises dans chaque canal peuvent être déplacées, et magnifiées, ainsi que tournées les unes par rapport aux autres dans l’une des trois dimensions. Avec la méthode classique d’étalonnage, les décalages chromatiques sont mesurés par des perles multicolores attachées à la surface d’un couvercle, et un certain nombre de logiciels sont disponibles pour mesurer les changements chromatiques de ces échantillons d’étalonnage. Cependant, l’aberration chromatique peut varier avec la profondeur, changer avec les conditions d’observation et être induite par l’échantillon biologique lui-même, ce qui entrave la détermination de la quantité réelle de changement chromatique dans l’échantillon d’intérêt et dans le volume. La correction des changements chromatiques à une plus grande précision est particulièrement pertinente pour la microscopie à super résolution où seuls de légers changements chromatiques peuvent affecter les analyses quantitatives et modifier l’interprétation des images multicolores. Nous avons développé un logiciel open-source Chromagnon et des méthodes d’accompagnement pour mesurer et corriger les changements chromatiques 3D dans les échantillons biologiques. Nous fournissons ici un protocole d’application détaillé qui inclut des exigences spéciales pour la préparation des échantillons, l’acquisition de données et le traitement des logiciels pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques d’intérêt.

Un exemple de correction chromatique de décalage à l’aide d’une image de référence crosstalk est illustré à la figure 5. L’image a été obtenue avec un microscope à large champ équipé d’une seule caméra. L’émission de fluorescence du DAPI a été utilisée comme référence (figure 5A,B)pour corriger les canaux bleu, vert et rouge. L’image comprend 3 canaux de 60 tranches Z, chacun composé de 256 x 256 pixels. Les images ont été déconcerles avant de mesurer les changements chromatiques. La mesure des changements chromatiques locaux à l’aide de Chromagnon a pris 51 s sur un Mac avec Intel Core i7 (quad core, 8 threads, 2,7 GHz), 16 Go de RAM et 1 To de stockage flash. Le paramètre d’alignement a été appliqué àl’imagecible ( Figure 5C,D), qui a exactement le même nombre de voxels que l’image de référence. La préparation du fichier aligné a pris 3 s. En raison de la coupe des pixels de bord pendant le processusd’alignement (case à cocher marges de culture dans la figure 1C),le nombre de voxels a été réduit après alignement (figure 5B, 51 tranches Z, 252 x 251 pixels). L’ADN dans le pont anaphase (indiqué par des pointes de flèche) est vu incorrectement à l’extérieur de l’enveloppe nucléaire avantl’alignement ( figure 5C, évident dans le panneau inférieur montrant la vue XZ), mais comme prévu à l’intérieur de l’enveloppe après alignement (figure 5D).
Un exemple de correction chromatique de décalage à l’aide d’une image de référence d’étalonnage biologique est illustré à la figure 6. Les images ont été obtenues avec un microscope SIM équipé de trois caméras. Trois images de cellules HeLa tachées de phalloïdants conjugués à des colorants bleus, verts et rouges ont été calculées en moyenne (Figure 6A). L’image de référence comprend 3 canaux de 76 tranches de Z, chacun composé de 1 024 x 1 024 pixels. La mesure des changements chromatiques à l’aide de Chromagnon sans alignement local a nécessité 194 s sur le système Mac décrit ci-dessus. Le paramètre a été appliqué à une image cible composée de 3 canaux de 73 tranches Z, chacun composé de 1 024 x 1 024 pixels. La génération du fichier aligné a pris 25 s. La vue XZ montre les positions incorrectes du canal le long du Z, et légèrement le long des directions X (Figure 6A,C) mais cette erreur d’enregistrement a été corrigée après alignement (Figure 6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> Figure 5 : Exemple d’alignement avec une image de référence crosstalk. Les cellules HeLa ont été tachées avec DAPI pour l’ADN (montré dans magenta), Alexa Fluor 488 (montré en jaune) pour l’enveloppe nucléaire, et Alexa Fluor 555 (montré en bleu) pour les microtubules. Les images ont été acquises par microscopie 3D à large champ avec une seule caméra et déconcelvées. (A,B) Image de référence croisée représentative utilisant l’émission DAPI, avant et après l’alignement par Chromagnon. Trois canaux de couleur sont affichés comme superposés. (C,D) Une section optique de la pile 3D en trois canaux avant et après l’alignement. L’aberration chromatique axiale est évidente au pont anaphase montré par des pointes de flèche. La barre d’échelle du panneau A indique 5 μm pour tous les panneaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> Figure 6 : Exemple d’alignement avec une image de référence d’étalonnage biologique Des images ont été acquises avec 3D-SIM équipé de trois caméras. (A,B) Une image de référence en moyenne à partir de trois images avant (A) et après (B) alignement. Les cellules hela ont été tachées de phalloïdin conjugué avec Alexa Fluor 405, 488 ou 594. (C,D) Image cible avant (C) et après (D) alignement. Les cellules HeLa ont été tachées avec DAPI pour l’ADN (montré dans magenta), Alexa Fluor 488 (montré en jaune) pour l’enveloppe nucléaire, et Alexa Fluor 594 (montré en bleu) pour les microtubules. La barre d’échelle du panneau A indique 5 μm pour tous les panneaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

La correction des changements chromatiques dans les images de microscopie multicolore en trois dimensions (3D) est cruciale pour l’analyse quantitative des données. Ce protocole est développé pour mesurer et corriger les changements chromatiques dans les échantillons biologiques par l’acquisition d’images de référence appropriées et le traitement avec le logiciel open-source, Chromagnon.

Correction à haute précision des changements chromatiques 3D à l’ère de l’imagerie biologique à haute résolution à l’aide de Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Les images de microscopie des coraux des marais contiennent chromatique shift en trois dimensions. Cela nuit à l’analyse de colocalisation des images haute résolution. Il est généralement difficile d’enlever chromatique décalage provenait d’un échantillon biologique lui-même, notre méthode peut corriger le changement chromatique dans un échantillon biologique en utilisant des images de référence acquises séparément.Takako Koujin, technicien de mon groupe, démontrera la procédure. Commencez par ensemencer 2,5 fois 10 à la cinquième cellule guérisseuse sur un plat de fond en verre de 35 millimètres et de les cultiver dans un incubateur de dioxyde de carbone. Après 24 heures d’incubation, remplacer le milieu par deux millilitres de formaldéhyde de 3,7 % dans le PBS et mélanger délicatement.Fixez les ventes pendant 15 minutes à température ambiante sur une plate-forme rotative. Laver les cellules trois fois avec deux millilitres de PBS pendant cinq à dix minutes. Perméabilizez-les avec deux millilitres de point 1%essayez les 100 prochains en PBS tout en tournant et répéter les lavages avec PBS.Puis tacher les cellules à l’aide d’un protocole standard de coloration des anticorps tel que décrit dans le manuscrit du texte. Pour obtenir une image de référence de référence crosstalk pour la microscopie à champ large, ajouter deux millilitres de point cinq microgrammes par millilitre Dappy pour rester dans l’ADN. Laissez les cellules sur la plate-forme rotative pendant 30 minutes.Remplacez ensuite la solution par 100 microlitres de support de montage Pour obtenir une image de référence de référence d’étalonnage biologique pour tout type de microscopie, y compris la microscopie confoccale et super résolution. Fixer les cellules comme décrit précédemment, et préparer la solution de stock d’un colorant fluorescent conjugué phalloidin en 1,5 millilitres de méthanol. Ajouter la phalloidine dans PBS à une dilution de un à 100 pour alexa étage 405 un à 1000 pour Alexa étage 488 et un à 200 pour Alexa étage 594.Ajouter un millilitre de la solution aux cellules et les incuber pendant 30 minutes pendant la rotation. Lavez les cellules trois à cinq fois avec deux millilitres de PBS. Remplacez ensuite le PBS par 100 microlitres de support de montage.Pour acquérir des images de fluorescence à l’aide d’une microscopie à large champ, placez l’échantillon cible sur le microscope dans le logiciel d’imagerie, ouvrez la fenêtre d’expérience de conception et d’exécuter, définissez l’étape Z appropriée et sélectionnez les canaux bleus, verts et rouges. Dans l’onglet Exécuter, ajouter le nom du fichier d’image et commencer l’imagerie. Pour acquérir des images de référence crosstalk pour mesurer les décalages chromatiques dans l’échantillon sélectionnez la lumière d’excitation uniquement pour Dappy et assurez-vous d’utiliser exactement la même position de scène et la même hauteur Z que pour l’échantillon cible.Alternativement, utiliser une image de champ lumineux comme lieu de référence à l’échantillon cible sur le microscope à champ large et acquérir une image de fluorescence de la cible en canaux bleus, verts et rouges. Puis acquérir des images en champ lumineux de la cible en canaux bleus, verts et rouges à la même position de scène et en utilisant la même hauteur Z. Pour acquérir des images de fluorescence à l’aide d’une microscopie à super résolution, comme sim 3D placez l’échantillon cible sur le microscope et acquérez une image sim de fluorescence de la cible dans des canaux bleus, verts et rouges.Ensuite, reconstruisez l’image super résolue. Placez ensuite la tache d’échantillon avec la phalloidine multicolore sur un microscope sim 3D. Et acquérir plusieurs images sim fluorescence que les images de référence d’étalonnage biologique à des positions de stade point, puis reconstruire les images super résolu.Utilisez un navigateur Web pour télécharger la dernière version binaire de Chromagnon. Extraire le programme et mettre le fichier exécutable dans un endroit pratique. Faites glisser et déposer les fichiers de référence des références de champ droit crosstalk ou biologique à la boîte de référence ou cliquez sur les fichiers de référence pour ouvrir un dialogue de sélecteur de fichiers.Si le programme demande l’installation d’un kit de développement Java, appuyez sur Oui et accédez à la page téléchargée. Téléchargez et installez ensuite le JDK pour le système d’exploitation selon les instructions. Faites glisser et laissez tomber les fichiers cibles des taches d’anticorps dans la boîte cible.Choisissez un format d’image de sortie et spécifiez le suffixe pour le nom du fichier de sortie. Pour les images de référence crosstalk avec un rapport signal/bruit élevé. Choisissez la projection parmi la liste de choix de l’alignement local et utilisez une taille minimale de fenêtre de 60.Pour un étalonnage biologique multiple, les images de référence vérifient l’option références moyennes et n’en choisissent aucune pour l’alignement local, puis cliquez sur exécuter toutes pour commencer les mesures. Pour vous assurer que la mesure a été effectuée correctement, faites glisser et déposez les images de référence dans la boîte de référence et la boîte cible. Exécutez ensuite le programme et vérifiez que les images sont parfaitement superposées.Chromatic Shift Correction en microscopie à champ large peut être effectuée à l’aide d’une image de référence crosstalk. Cette image a été obtenue avec un microscope à champ large équipé d’une seule caméra. L’émission de fluorescence de Dappy a été utilisée comme référence pour corriger les canaux bleus, verts et rouges.Après alignement avec Chromagnon, le décalage chromatique et l’image de référence ont été corrigés. Lorsque le paramètre d’alignement a été appliqué à l’image cible par Chromagnon, l’ADN et le pont d’anaphase, qui sont vus incorrectement à l’extérieur de l’enveloppe nucléaire avant que l’alignement n’apparaisse comme prévu à l’intérieur de l’enveloppe. Chromatic Shift Correction d’une image SIM 3D peut être effectuée à l’aide d’une image de référence d’étalonnage biologique.Trois images sim 3D de cellules HeLa tachées de phalhoïdes conjuguées à des teintures bleues, vertes et rouges ont été averged et le décalage chromatique a été mesuré par Chromagnon. Après alignement, le décalage chromatique et l’image de référence ont été corrigés. Le paramètre d’alignement a été appliqué à une image cible.La vue XZ affiche une position de canal incorrecte le long du Z et légèrement le long des directions X, qui a été corrigée après alignement. Pour de meilleures performances, il est important d’obtenir des images de référence dans les mêmes conditions et le timing qu’une image cible.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

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