Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP19H03202 עד הבוקר, JP18H05528 ו JP17H03636 ל T.H., ו JP17H01444 ו JP18H05533 ל ח. י. L.S. מכיר את התמיכה על ידי ברוכים השבים פרסים אסטרטגיים 091911 ו-107457/Z/15/Z מימון הדמיה מתקדמת ב מיקרון אוקספורד.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

ההליך של תיקון כרומטי הוא סחר-off בין דיוק ומאמץ. כדי לחסוך במאמצים מיותר, עדיף לדעת כמה דיוק נדרש עבור המחקר שלך. הדיוק הגבוה ביותר יכול להיות לא נדרש עבור הדמיה רגילה של השדה (חי), ולכן, התייחסות שדה בהיר תמונות מספיקות לעתים קרובות כדי לתקן את המשמרת כרומטית. באופן דומה, כאשר מצב הדימות והסביבה הוא קבוע, שימוש חוזר ונשנה של כיול ביולוגי יחסוך זמן. מצד שני, אם דרושה רישום מדויק במיוחד, יש צורך בתמונות הצלבות באיכות גבוהה או באמצעות כיול ביולוגי. לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש לקבל תמונות התייחסות בתנאים ובתזמונים דומים כתמונות היעד ככל האפשר. כל עוד התייחסות ותמונות יעד מתקבלים על ידי מיקרוסקופ זהה, רזולוציה גבוהה יותר מרחבית תשפר את דיוק התיקון. אם האפשרות ' פירוק ' זמינה עבור תמונות הפניה והיעד, לאחר מכן יישום זה לפני תיקון עשוי לשפר את דיוק התיקון. כמו כן, עבור הביצועים הטובים ביותר, משפט הדגימה לציר האופטי (Z) צריך להיות מתגשם הן בקובץ הייחוס והן ב-היעד לאינטרפולציה מדויקת של פיקסלים משניים (בשלב 2.1.3 פרוטוקול).
אי תיקון שינוי כרומטי מוביל למסקנות שגויות. יתרה מזאת, שימוש בכיול הלא נכון עלול אף להחמיר את המשמרות הכרומטית במקום לתקן אותם, ולכן יש להימנע מכך. סיכלנו את הגורמים האפשריים לכשלים, ואת הפתרונות המשותפים שלהם, בטבלה 2. כדי לבדוק את הסיבה לכישלון, במקום הראשון, יש לבדוק חזותית אם השינוי הכרומטי בתמונת הייחוס מתוקן במדויק (פרוטוקול שלב 3.12). רוב הכשלים הם בשל איכות תמונות הייחוס ניתן לתקן בקלות לפי התיאורים בטבלה 2. בנוגע לאיכות של תמונות ייחוס, חשוב לציין שרמת הדיוק של היישור הכללי יורדת אם השדה המלא של התצוגה אינו מלא במדגם (איור 7, טבלה 2). בהשוואה לדוגמה הטובה המוצגת באיור 7A, הדוגמה הרעה המוצגת באיור 7a מכילה רק שלוש מעטפות גרעיניות באזור השמאלי העליון, וכרומעגנון לא מיישר חלק מתמונה זו. זאת משום ששיטת היישור הגלובלית של כרומעגנון מפצלת את שדה התצוגה לארבעה אזורים (איור 7c) כדי למדוד את ההבדלים בסיבוב ובהגדלה בדיוק גבוה3. שיטה זו, אם היא מופעלת כראוי, היא הזמנה אחת מדויקת יותר מאשר שיטות לינאריות אחרות, כגון שיטות השינוי הקוטביות ושיטת השירות3. אם אחד מארבעת האזורים לא זמין, אז כרומעגנון עובר לשיטות לינאריות פחות אפקטיביות. לכן, עבור הביצועים הטובים ביותר, הדוגמאות המוצגות באיור 7B ואיור 7b אינן רצויות, וארבעת האזורים צריכים להתמלא בעצמים. משתמשים יכולים לבדוק אם כל אזור ריבועי של שדה התצוגה אינו זמין למדידה על-ידי התבוננות בקובץ יומן הרישום ("כרומעגנון. log"; ראה פרוטוקול שלב 3.10). למרבה המזל, ניתן להתגבר על בעיה זו על-ידי חישוב ממוצע של תמונות כיול ביולוגיות מרובות או שימוש ביישור מקומי עבור הצלבות או תמונות התייחסות בשדה בהיר (טבלה 2). בניגוד למקרה של כשל בתמונות התייחסות, אי התיקון של תמונות היעד קשה יותר לזיהוי. מכיוון שכשלים כאלה נובעים עקב הבדלים בתבניות קובץ, בתנאי הדמיה, בתזמונים להדמיה, בשיטות הדמיה/יישור בין תמונות ההפניה והיעד (טבלה 2), משתמשים צריכים תמיד להיות זהירים בעת שימוש בתמונות ייחוס המתקבלות בתנאים שונים/תזמונים מתמונות היעד. תמונות מסוימות לדוגמה זמינות לבדיקה (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>) כדי לקבל רעיון בטון של תמונות הדוגמה הטובות והגרועות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>עיה</td>
			<td>כי</td>
			<td>פתרון</td>
		</tr>
<tr>
<td>תיקון תמונת הייחוס נכשל</td>
			<td>ניגודיות נמוכה</td>
			<td>במידת האפשר, השג תמונת ניגודיות גבוהה יותר. אם נעשה שימוש בתמונת הפניה בשדה בהיר, השג מחדש את התמונה בפתרון מבוסס-מים כדי לקבל ניגודיות גבוהה יותר מהתא. לחילופין, נסה להחיל הפחתת רעש חישובית (לדוגמה, סינון גאוסיאני). בטל את היישור המקומי, שהוא רגיש יותר לרעש.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>זיהום של תמונות לא קשורות</td>
			<td>הסר את המקור של התמונות שאינן קשורות במדגם במידת האפשר. לתמונות התייחסות מוצלב, בדוק את ספקטרום העירור של הצבעים המשמשים את תמונות היעד. אם הצבעים מתרגשים במהלך הרכישה של דימוי מוצלב (למשל אלקסה פלואו 568 או 594), שקול צבעים אחרים (למשל אלקסה פלואור 555). אם מדובר בשבב המצלמה יוצר הבדל ערוץ ברור, נקה את שבב המצלמה או השתמש בשיטה חישובית שטוחה.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>נקודה בהירה מאוד שנעשתה ע י קרן קוסמית</td>
			<td>לרכוש את התמונה שוב אם ניתן. לחלופין, נסה להחיל הפחתת רעש חישובית (לדוגמה, סינון חציון או גאוס).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>מוצרים לפירוק (אותות מלאכותיים על הציר והקצוות הצדדיים)</td>
			<td>חתוך את המקטעים ' פיקסלים בקצוות ' או ' Z ' לאחר הפירוק. אם מגזוז צד אחד, יש לגזוז את הצד השני כדי לשמור על מרכז התמונה.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>גודל הצעד של Z דליל מדי</td>
			<td>יש לרכוש מחסנית Z כדי למלא את קריטריון נייקוויסט כפי שכתוב בפרוטוקול 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>סטייה אופטית</td>
			<td>סטייה כדורית היא הסטייה העיקרית הנגרמת על ידי משתמשים. בחר את העדשה המטרה הנכונה עבור המדגם ולהשתמש בעובי coverslip של 170 μm. אם העדשה אובייקטיבי מצויד בטבעת תיקון, להתאים אותו כדי למצוא את המיקום שבו ספירת הזריחה הגבוהה ביותר מתקבל מהמוקד. במקרה של מטרה טבילה בשמן ללא טבעת תיקון, להתאים את מדד השבירה של שמן טבילה המגביר את לספור את הזריחה בפוקוס.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>שדה הראיה ללא מילוי (איור 7)</td>
			<td>במקרה של כיול ביולוגי תמונות התייחסות, ממוצע תמונות רבות. במקרה של הצלבות או תמונות התייחסות בשדה בהיר, השתמש ביישור מקומי.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>באג תוכנה לא מזוהה</td>
			<td>דווח על הנושא באמצעות GitHub (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>תיקון תמונת היעד נכשל</td>
			<td>מטה-נתונים של קובץ התמונה אובדים</td>
			<td>השתמש בתבנית קובץ המיקרוסקופ המקורי אשר מכיל מטה-נתונים מלאים, ולהימנע מהמרה לקובץ tiff מרובה עמודים לפני העיבוד. השתמש באותה הזמנת ערוצים כפי שכתוב בפרוטוקול 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>שיטות יישור שגויות עבור המיקרוסקופיה הנתונה</td>
			<td>אין להחיל את שיטת היישור המקומית בשעת מדידת תמונות של הפניית כיול ביולוגית לתמונות יעד. אין להשתמש בתמונות התייחסות לטבלת הצלבות מלבד מיקרוסקופ שדות רחב.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>הבדלים בתנאי הדמיה</td>
			<td>שמור על תנאי הדימות באופן קבוע בין ההפניה לבין תמונות היעד כפי שכתוב בפרוטוקול 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>הבדלים במדגם (כולל coverslip)</td>
			<td>תמיד להשתמש באותו מדיום הרכבה, coverslip (למשל No. 1.5 H) ועומק דומה של מיקוד.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>מיקרוסקופ להיסחף מאז הכיול האחרון נעשה</td>
			<td>הפוך כיול לעתים קרובות כמו כל שבועיים. שמרו על הטמפרטורה קבועה, והשתמשו בטבלה צפה כדי למנוע סחף חומרה של המיקרוסקופ.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: פתרון בעיות עבור תיקון כרומטי.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> איור 7: דוגמאות לתמונות ייחוס. מעטפת גרעינית בתאים שמרים ביקוע המסומנים באמצעות GFP ו-mCherry. התמונות נרכשו עם המיקרוסקופיה המקובלת בשדה הרחב. שינויים כרומטית תוקנו באמצעות כרומעגנון ללא יישור מקומי באמצעות התמונות עצמן כתמונות ייחוס. לאחר מכן, התמונות לאחר מכן הראו את הפרטים. (א) דוגמה טובה לאובייקטים רבים בתחום התצוגה. (ב) דוגמה רעה לאובייקטים בפינה השמאלית העליונה בלבד. חוסר יישור ברור באזור מסוים של התמונה. (ג) דוגמה בלתי רצויה שבה אחד מחלק הארבע (מופרד באמצעות קווים מנוקדים) ריק. סרגל קנה מידה בלוח A מציין 5 יקרומטר עבור תצוגת השדה המלא ו-1.25 יקרומטר עבור התצוגה המורחב וישימה לכל החלוניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בפרוטוקול זה, תיארנו שלושה סוגי ייחוס שונים (טבלה 1). בין היתר, תמונות התייחסות מוצלב ותמונות התייחסות לכיול הביולוגי זקוקות לדיון זהיר נוסף. לתמונות התייחסות מוצלב, דגימות מוכתמות באמצעות DAPI או הואכסט 33342, ורכוב בגליצרול או במדיית הרכבה מסחרית ניתן להשתמש ביעילות כדי ליישר את הערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים. באופן דומה, אלקסה Fluor 488 ניתן להשתמש כדי ליישר את הערוצים הירוקים והאדומים. עם זאת, השגת פלואורסצנטית הצלבות היא לעתים קרובות קשה מאז צבעים כחולים רבים מלבד DAPI ו Hoechst הם עמעם וריקבון מהר יותר מאשר צבעים ירוק ואדום ביותר. יתר על כן, ספקטרום הפליטה של צבעים מודרניים הם צרים יותר, מה שהופך את היישור של יותר משלושה ערוצים על ידי שיטה זו מאתגרת. תשומת לב צריך גם להיות משולם כמה צבעים אדומים נפוצים (למשל, אלקסה קמח 568 ו 594, אבל לא אלקסה Fluor 555) כי יכול להיות נרגש על ידי אור סגול, אשר מונעים קבלת תמונות בחדות גבוהה הוצלב של צבעים כחולים. חיסרון נוסף הוא ששיטה זו אינה יכולה למדוד את הסטייה הכרומטית של שבילי אור עירור בעירור רב-הצבעים, מכיוון שאורך גל אחד בלבד משמש לעירור (טבלה 1). כמו רוב המיקרוסקופיה המתקדמת ביותר משתמשת באופטיקה תאורה שונה, היישום של שיטה זו הוא מוגבל. ובכל זאת, דיוק התיקון הגבוה יותר הוא יתרון מספיק כדי שהוא יתואר בפרוטוקול זה. באופן כללי, תמונת הצלבות צריכה להילקח לאחר תמונת יעד כדי למנוע הלבנת או אפקטי פוטורעילים. עבור SMLM נצפתה עם מצב השדה הרחב, יש לרכוש תמונת ייחוס לפני רכישת תמונת יעד כאשר ניתן להבחין בצבעים של קרינה בזמן הדמיה.
תמונות התייחסות לכיול הביולוגי מאפשרות למשתמשים ליישר בקלות כל מספר רצוי של ערוצים בעלות הכנה לדוגמה נוספת. יתרון נוסף של תמונות התייחסות לכיול ביולוגי הוא הזמינות של "חישוב ממוצע" של הפניות מרובות המסייע למלא את כל שדות התצוגה. שיטה זו עשויה להיפגע מהבדלים בתנאי הדמיה אם דגימת הכיול מוכנה בשקופית אחרת. רוב בעיה זו ניתן לפתור אם הן מטרות והפניות מוכנים באותה שקופית באמצעות שימוש מסחרי שמיכות (טבלה 1), ותנאי דימות אחרים נשמרים קבוע כמו בשלב הפרוטוקול 2.3.3. במקרה זה, ניתן לצפות בדיוק תיקון דומה לזה של תמונות התייחסות מוצלב3. הפרוטוקול להשתמש phalloidin כפי שמוצג כאן היא אחת הדרכים הקלות ביותר להכתים מבנה סלולרי יחיד עם מספר צבעים. קיימים תרחישים אפשריים רבים להכנת דגימות כיול ביולוגיות. עבור כתמים חיסוני, מדגם ניתן לתייג עם נוגדן ראשוני אחד ואחריו כתמים עם נוגדנים משניים של צבעים מרובים. בדרך זו, ניתן לתייג מבנה יעד בודד עם צבעים מרובים. לחילופין, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, זוהה על ידי "לחץ" מדבקות כימיה DNA חדש מסונתז בצבעים מרובים בצפיפות גבוהה, כמתואר בפירוט בעבר8. עבור תאים חיים, זה שימושי כדי להכין זן טרנסגניים מחסה שני עותקים של הגן כי הם התמזגו GFP או mCherry לסמן את אותו מבנה עם שני צבעים. אם מספר העותק של הגן הוא קריטי כפי שנצפה לעתים קרובות עבור חלבונים ממברנה, עותק אחד של הגן יכול להיות tandemly התמזגו כדי GFP ו-mCherry (איור 7). להמרה חלבונים פלורסנט, כגון mEOS218, יכול לשמש גם על ידי הארת רמה מתונה של אור סגול כדי להשיג שני מינים חלבון עם או בלי photoconvertible. בתנאי חמצן נמוך, gfp יכול לשמש גם חלבון פוטוהמרה מירוק לאדום19,20. בחירת דוגמת הכיול הנכונה תגרום לניסוי להיות חזק יותר.

הדמיה מרובת צבעים היא אחד ההיבטים הבסיסיים של מיקרוסקופ פלואורסצנטית ביולוגי, במקרים שבהם הקשר המרחבי של מולקולות או מבנים שונים הוא עניין רציני. סטייה כרומטית, סטייה אופטית של אור צבעוני הנגרמת על ידי פיזור, משנה את המיקום לכאורה של אובייקטים צבעוניים של עניין. באופן דומה, מיקרוסקופים מצויד מצלמות מרובות המוקדש לרכישת כל צבע יש משמרות כרומטית מורכבות יותר עקב הבדלים אלמנטים אופטיים יישור לא מושלם בין הערוצים. כך, שינויים כרומטית כאלה עלול להוביל למסקנה כוזבת אלא אם תוקנה במפורש על ידי המשתמש. למרות משמרות כרומטית לא היה בעיה גדולה כל עוד הרזולוציה של מיקרוסקופ מוגבל על ידי מגבלת הרזולוציה הקלאסית, הפיתוח האחרון של מיקרוסקופ סופר ברזולוציה1 התבקש את הצורך תיקון מדויק יותר של משמרות כרומטית.
זה היה מנהג נפוץ למדוד שינויים כרומטית של מערכות מיקרוסקופ באמצעות כיול מרובת צבעים מחליק שקופית2. מבוסס חרוז שיטת כיול מתאים למדידת משמרות כרומטית מן האופטיקה כולו של המיקרוסקופ לכיוון פני השטח של coverslip2. עם זאת, שיטה זו אינה יכולה למדוד משמרות כרומטית בדגימות העניין הביולוגי. חשוב לציין כי דגימות ביולוגיות רבות הן תלת ממדיות (3D), ואת השינויים כרומטית של דגימות כאלה שונים מאלה על פני השטח של הcoverslip. יתר על כן, שינויים כרומטית2שינוי עם תנאיהדמיה 2,3. יש לנו למדוד את המשמרות כרומטית בדגימות ביולוגיות 3D ומצא כי חוסר ודאות של שינויים כרומטית היה לעתים קרובות כמו 350 ננומטר על ידי השיטה הקלאסית multicolor-חרוז כיול3. לכן, יש למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות בעומק העניין ומתחת לתנאי הדימות שבשימוש.
כאן, אנו מתארים הליכים למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות לתקן את המשמרות האלה באמצעות התוכנה שלנו, כרומעגנון3. כדי למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות, השיטה שלנו משתמשת בשני סוגים של ערכות נתונים, תמונת "יעד" ותמונה "הפניה". התמונה "המטרה" היא תמונה מרובת צבעים של עניין, למשל, תמונות מוכתם DNA, מעטפת גרעינית, ו microtubules. לעתים קרובות אי אפשר למדוד שינויים כרומטית בתמונה כזו. לכן, אנחנו צריכים תמונה "התייחסות" כי הוא מוקדש למדוד את המשמרות כרומטית במדגם. ההגדרה היחידה של תמונת "הפניה" היא תמונה מרובת צבעים של אותו אובייקט. במובן זה, תמונת חרוזים עם ריבוי צבעים היא גם סוג של תמונת ייחוס. כאן, אנו מתארים שלושה סוגים שונים של תמונת ייחוס המשמשים למדידת שינויים כרומטית בדגימות הביולוגי: "תמונות התייחסות מוצלב", "תמונות התייחסות לשדה בהיר" ו "כיול ביולוגי תמונות התייחסות". סוג תמונת הייחוס תלוי בסוג המיקרוסקופ הנמצא בשימוש או שדיוק התיקון הדרוש כמסוכם בטבלה 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Crosstalk</td>
			<td>שדה בהיר</td>
			<td>כיול ביולוגי (בשקופית אחרת)</td>
			<td>כיול ביולוגי (באותה שקופית)</td>
		</tr>
<tr>
<td>דיוקa
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>+ +b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>פשטות</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיקרוסקופ ישים</td>
			<td>שדה רחב</td>
			<td>שדה רחב</td>
			<td>כל</td>
			<td>כל</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמינות של יישור מקומי</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: מספר "+" מציין דירוג הולך וגובר. יחיד פלוס הוא כ 50 ננומטר ושלושה פלוס הוא כ 15 ננומטר ב 3D. b: הדיוק תלוי בכמות תנאי הדימות המשתנים שנשמרו באופן קבוע. ג: כיול מקומי הנמדד על ידי דגימות חרוזים מרובת צבעים ניתן לשלב כמתואר בפרוטוקול סעיף 4.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פרמטרים בעת בחירת סוג תמונות הייחוס.
"תמונות התייחסות מוצלב" הן בדיוק התיקון הגבוה ביותר והן פשוטות יחסית לביצוע3,4 (טבלה 1). החיסרון הוא המגבלה שלהם ביישומים מיקרוסקופית עקב חוסר יכולתו של מדידת שינויים כרומטית בנתיבי עירור. כמו כן, כדי להשיג תמונות כאלה, המיקרוסקופ צריך להיות מצויד עם מראות דיקרואיק multiband, ומסנני פליטה כי הם בשליטה עצמאית ממסנני עירור או מקורות אור. מיקרוסקופ מתאים כולל מיקרוסקופ רגיל בתחום הרחב, מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת (smlm) כגון צילום המופעל לוקליזציה מיקרוסקופ/סטוכסטי שחזור אופטי (פאלם/סטורם)5,6 ו מיקרוסקופ הרחבה7 נצפתה עם מיקרוסקופ שטח רחב. תמונת הפניה מוצלב נרכשת מדגימת היעד עצמה. זוהי תמונה של מוצלב (בליד) הפלואורסצנטית של צבע שהושג בכל הערוצים הדרושים. פליטת פלואורסצנטית תמיד מתרחב לעבר אורכי גל ארוכים יותר, ולכן הצבעים עם אורך הגל הקצר ביותר הם נרגשים להשיג פלואורסצנטית הוצלב בערוצים של אורכי גל ארוכים יותר. לדוגמה, כאשר המדגם מוכתם בכחול, ירוק ואדום, רק הצבע הכחול מתרגש, ואור הפליטה מתקבל בערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים. בפרוטוקול זה, דנ א ויטראז עם 4 ′, 6-diamidino-2-פניילינדול (DAPI) שימש לקבלת פלואורסצנטית הוצלב.
"תמונות התייחסות בשדה בהיר" הם חלופה קלה יותר ופחות פוטוטוקסיל "תמונות התייחסות הצלבות" אבל הם הפחות מדויקים3 (טבלה 1). אלה הם תמונות שדה בהיר של דגימת היעד, שנרכשו בכל ערוצי הצבע המשמשים בתמונת היעד.
"כיול ביולוגי תמונות התייחסות" יש את היתרון של להיות רלוונטי לכל סוג של מיקרוסקופ בשל יכולתם למדוד את המשמרות כרומטית הן בנתיבי עירור ופליטה3,8 (טבלה 1). מיקרוסקופ מתאים כולל המיקרוסקופיה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופ גיליונות אור, המחסור בפליטה מאולצת (היסטד)9, מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM)10, airyscan/סורא11,12, smlm התבונן במצב הכולל של השתקפות פנימית מלאה (tirf),רזולוציה של האולימפוס (osr) תמונה של כיול ביולוגי נרכשה מדוגמת כיול שהוכנה באופן דומה כדוגמת היעד, אך עם כתמים של מבנה אחד עם צבעים מרובים. דיוק התיקון מצטיין ברזולוציה של רוב מיקרוסקופ סופר ברזולוציה והכנת דגימת כיול ביולוגית יכולה להיות פשוטה יחסית. יתרון נוסף הוא הזמינות של "ממוצע" תמונות התייחסות מרובות. לכן, למרות שהתמונות הבודדות מכילות מידע מסכן למדידת משמרות כרומטית, ניתן להגדיל את תוכן המידע באמצעות חישוב ממוצע של תמונות מרובות. הדיוק תלוי בכמה תנאי הדימות נשמרים קבועים. בהקשר זה, הביצועים הטובים ביותר מתקבלים כאשר דגימות היעד וההתייחסות הן על אותה שקופית, שימוש, למשל, 8-היטב שמיכותשולחן (טבלה 1, מימין לרוב). בפרוטוקול זה, אקטין ויטראז ' עם שלושה צבעים של phalloidin שימש כיול ביולוגי.
לאחר השגת תמונת ייחוס, אזי התזוזה הכרומטית נמדדת ותוקנה על-ידי התוכנה כרומעגנון. אין הגבלה על מספר הערוצים, Z סעיפים ומסגרות זמן כי Chromagnon יכול למדוד ולתקן את המשמרות כרומטית. כרומעגנון מודד משמרות כרומטית בשני צעדים. הצעד הראשון משיג את הפרמטרים "הגלובליים" או "affine" של התרגום בצירי X, Y, Z, הגדלה לאורך ציר X, Y, Z וסיבוב מסביב לצירי Z. דיוק החישוב של היישור הגלובלי הוא ~ 16 ננומטר ב 3D ו ~ 8 ננומטר ב 2D. השלב השני הוא ' יישור מקומי ' איטרטיבי דו-ממדי אופציונלי בתמונות מתוכננות כדי להשיג דיוק גבוה יותר. בתהליך היישור המקומי, התמונות מחולקת לאזורים מרובים ושינויים כרומטית באזורים מקומיים אלה נמדדים. לאחר מכן, האזורים מחולקים ושינויים כרומטית באזורי המשנה נמדדים בצורה מינימלית עד שמספר הפיקסלים באזור יגיע למספר המינימלי של הפיקסלים (בדרך כלל 60 x 60 פיקסלים). מפת היישור המקומית שתיווצר משולבת עם פרמטר היישור הכללי ומוחלת על תמונת היעד באמצעות טרנספורמציה גמישה. בעקבות שלב זה, דיוק החישוב משופר ל ~ 14 ננומטר ב 3D ו ~ 6 nm ב-2D. היישור המקומי אינו מתאים לתמונות של הפניית כיול ביולוגית מכיוון שהמבנה הביולוגי בהפניה שונה מזה שביעד (טבלה 1). לכן, רק יישור כללי משמש לתמונות של הפניית כיול ביולוגית.
המשמרות הכרומטית המקומיות מקורם בשני מקורות; מיקרוסקופ אינסטרומנטלי עיוות מקומי וחוסר הומוגניות מבנית ביולוגית. מאחר שמיקרוסקופ אינסטרומנטלי עיוות מקומי הוא קבוע, זה יכול להיות נמדד מתוך מדגם ססגוניות ההפניה מתקן מתוקן כפרמטר קבוע. כרומעגנון יכול לשלב את המיקרוסקופ האינסטרומנטלי מפת העיוות המקומי ואת פרמטרי היישור הגלובלי מכיול הביולוגי (שולחן 1). בשיטה זו, צפוי כי הדיוק הממוצע של הכיול הביולוגי ישתפר על-ידי משתמש נוסף של 1-2 ננומטר.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לתקן את המשמרות כרומטית של תמונות פלואורסצנטית 3D באמצעות כרומעגנוןהתוכנה שלנו, מן הקצה הנמוך הקלה ביותר בדיוק הגבוה ביותר. אנו משתמשים בנוגדנים של תאי הלה כדוגמה ונצפו אותם באמצעות תלת-ממד מיקרוסקופ שדה רחב 3D-SIM. בחלק הראשון אנו מתארים כיצד להכין דגימות יעד ודגימות כיול ביולוגיות. חלק זה של הפרוטוקול צריך להיות מותאם עבור המטרות הספציפיות של המחקר. בחלק השני, אנו מתארים את שיטות הרכישה עבור שלושה סוגים של תמונות התייחסות על ידי מיקרוסקופים. ההנחה הייתה להשיג ערוצי כחול, ירוק ואדום, אבל הרכב ערוץ צריך להיות שונה על ידי מטרות ספציפיות של המחקר ועל ידי כיוונונים של המיקרוסקופ. זה לא משנה אם המיקרוסקופ מצויד מצלמה אחת או מצלמות מרובות. בחלק השלישי, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בתוכנה שלנו כדי למדוד ולתקן שינויים כרומטית של תמונת היעד באמצעות תמונות התייחסות. לבסוף, בחלק הרביעי, אנו מתארים שיטה כדי להשלים את התמונות התייחסות כיול ביולוגי באמצעות כיול מקומי אינסטרומנטלי של המיקרוסקופ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

מיקרוסקופ קרינה מרובת צבעים כמותיים מסתמך על התאמה מרחבית זהירה של ערוצי צבע הנרכשים באורכי גל שונים. בשל סטייה כרומטית ויישור לא מושלם של מצלמות, תמונות שנרכשו בכל ערוץ יכול להיות הוזז, מוגדל, כמו גם מסובב ביחס זה לזה בכל אחד מתוך שלושת הממדים. עם שיטת כיול קלאסית, שינויים כרומטית נמדדים על ידי חרוזים ססגוניות מוצמד למשטח של שמיכות, ומספר תוכנות זמינים כדי למדוד את המשמרות כרומטית מדגימות כיול כגון. עם זאת, סטייה כרומטית יכולה להשתנות עם עומק, לשנות עם תנאי תצפית ולהיגרם על ידי המדגם הביולוגי עצמו, ובכך לקבוע את ההגדרה של כמות אמיתית של משמרת כרומטית במדגם של עניין ומעבר לנפח. תיקון משמרות כרומטית בדיוק גבוה רלוונטי במיוחד עבור מיקרוסקופ סופר ברזולוציה שבו רק שינויים כרומטית קלים יכול להשפיע על ניתוחים כמותיים ולשנות את הפרשנות של תמונות צבעוניות. פיתחנו תוכנת קוד פתוח כרומעגנון וליווי שיטות למדוד ולתקן משמרות כרומטית תלת-ממדית בדגימות ביולוגיות. כאן אנו מספקים פרוטוקול יישום מפורט הכולל דרישות מיוחדות עבור הכנה לדוגמה, רכישת נתונים, ועיבוד תוכנה כדי למדוד שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות של עניין.

דוגמה לתיקון שינוי כרומטי באמצעות תמונת התייחסות מוצלב מוצגת באיור 5. התמונה הושגה עם מיקרוסקופ שדה רחב מצויד במצלמה אחת. פליטת פלואורסצנטית מ-DAPI שימש כהפניה (איור 5א, ב) כדי לתקן את הערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים. התמונה כוללת 3 ערוצים של 60 Z פרוסות, כל אחד מהם מורכב 256 x 256 פיקסלים. התמונות היו לפני מדידת משמרות כרומטית. מדידת המשמרות כרומטית המקומי באמצעות כרומעגנון לקח 51 s ב-Mac עם i7 Core של אינטל (ליבות, 8-האשכולות, 2.7 GHz), 16 GB זיכרון RAM ו 1 TB אחסון flash. פרמטר היישור הוחל על תמונת היעד (איור 5C, D), אשר מכיל בדיוק את אותו מספר של voxels כתמונת הייחוס. הכנת הקובץ המיושר לקחת 3 s. כתוצאה מגזיזת הפיקסלים בקצוות במהלך תהליך היישור (תיבת הסימוןשולי חיתוך באיור 1c), מספר הvoxels הופחת לאחר יישור (איור 5b, 51 Z פרוסות, 252 x 251 פיקסלים). ה-DNA בגשר אנאפה (המצוין על ידי ראשי חץ) נתפסת באופן שגוי מחוץ למעטפה גרעינית לפני יישור (איור 5C, ברור בפאנל התחתון מראה את התצוגה xz), אבל כצפוי בתוך המעטפה לאחר יישור (איור 5c).
דוגמה לתיקון shift כרומטי באמצעות תמונת הפניה לכיול ביולוגית מוצגת באיור 6. התמונות הושגו עם מיקרוסקופ ה-SIM מצויד עם שלוש מצלמות. שלוש תמונות של תאי הלה ויטראז ' עם הפאלואידינים מצובענים לכחול, ירוק, צבע אדום היו ממוצעים (איור 6A). תמונת הייחוס כוללת 3 ערוצים של 76 Z פרוסות, כל אחד מהם מורכב 1,024 x 1,024 פיקסלים. מדידת שינויים כרומטית באמצעות כרומעגנון ללא יישור מקומי נדרש 194 s על מערכת Mac שתוארה לעיל. הפרמטר הוחל על תמונת יעד המורכבת מ -3 ערוצים של 73 Z, כל אחד מהם מורכב מ-1,024 x 1,024 פיקסלים. הדור של הקובץ המיושר לקח 25 ס. התצוגה XZ מציגה עמדות ערוץ שגויות לאורך Z, ומעט לאורך כיווני X (איור 6א, ג) אך הרישום השגוי הזה תוקן לאחר היישור (איור 6B, D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> איור 5: דוגמה ליישור עם תמונת הפניה מוצלב. תאי הלה היו מוכתמים ב-DAPI עבור DNA (המוצג בארגמן), אלקסה Fluor 488 (מוצג בצהוב) עבור מעטפת גרעינית, ו אלקסה Fluor 555 (המוצג בכחול) עבור microtubules. התמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופ שדה רחב 3D עם מצלמה אחת לפירוק. (א, ב) נציג מוצלב של תמונת ייחוס באמצעות פליטת DAPI, לפני ואחרי יישור של כרומעגנון. שלושה ערוצי צבע מוצגים כשכבות. (ג, ד) מקטע אופטי של המחסנית התלת-ממדית בשלושה ערוצים לפני ואחרי יישור. סטייה כרומטית צירית ברורה בגשר האנאפה המוצג על ידי ראשי חץ. סרגל קנה מידה בלוח A מציין 5 יקרומטר עבור כל החלוניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> איור 6: דוגמה ליישור עם תמונת התייחסות ביולוגית לכיול התמונות נרכשו עם 3D-SIM מצויד עם שלוש מצלמות. (א, ב) תמונת הפניה מממוצע משלוש תמונות לפני (A) ואחרי (ב) יישור. תאי הלה היו מוכתמים ב phalloidin מצומנת עם אלקסה Fluor 405, 488 או 594. (ג, ד) תמונת היעד לפני (C) ואחרי (ד) יישור. תאי הלה היו מוכתמים ב-DAPI עבור DNA (המוצג בארגמן), אלקסה Fluor 488 (מוצג בצהוב) עבור מעטפת גרעינית, ו אלקסה Fluor 594 (המוצג בכחול) עבור microtubules. סרגל קנה מידה בלוח A מציין 5 יקרומטר עבור כל החלוניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

תיקון של שינויים כרומטית בתלת מימדי (3D) תמונות מיקרוסקופית קרינה פלואורסצנטית חיוני עבור ניתוח נתונים כמותיים. פרוטוקול זה פותח כדי למדוד ולתקן שינויים כרומטית בדגימות ביולוגיות באמצעות רכישת תמונות התייחסות מתאים ועיבוד עם תוכנת קוד פתוח, כרומעגנון.

תיקון דיוק גבוה של שינויים כרומטית תלת-ממדיים בגיל הדמיה ביולוגית סופר ברזולוציה באמצעות כרומעגנון

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

תמונות מיקרוסקופיות אלמוגים מארש מכילות שינוי כרומטי בשלושה ממדים. זה פוגע בניתוח קולוקליזציה של תמונות ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל קשה להסיר משמרת כרומטית שמקורה מדגם ביולוגי עצמו, השיטה שלנו יכולה לתקן שינוי כרומטי מדגם ביולוגי באמצעות תמונות התייחסות שנרכשו בנפרד.הדגמת ההליך תהיה טקאקו קוג'ין טכנאי מהקבוצה שלי. התחל על ידי זריעת 2.5 פעמים 10 לתאי המרפא החמישי על צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר וגדל אותם באינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות של דגירה להחליף את המדיום עם שני מיליליטר של 3.7% פורמלדהיד ב PBS ומערבבים בעדינות.תקן את המכירות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בפלטפורמה מסתובבת. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS במשך חמש עד 10 דקות. Permeabilize אותם עם שני מיליליטר של נקודה 1%לנסות את הבא 100 ב PBS תוך סיבוב ולחזור על לשטוף עם PBS.ואז להכתים את התאים באמצעות פרוטוקול הכתמת נוגדנים סטנדרטי כמתואר בכתב היד טקסט. כדי לקבל תמונת ייחוס של התייחסות crosstalk עבור מיקרוסקופיה שדה רחב, להוסיף שני מיליליטר של נקודה חמש מיקרוגרם למיליליטר דאפי להישאר ב- DNA. השאר את התאים על הפלטפורמה המסתובבת למשך 30 דקות.לאחר מכן החלף את הפתרון ב-100 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה כדי לקבל תמונת ייחוס של התייחסות לכיול ביולוגי עבור כל סוג של מיקרוסקופיה, כולל מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר רזולוציה. לתקן את התאים כפי שתואר קודם לכן, ולהכין את פתרון המניות פלואורסצנטי צבע נדן פאלודין ב 1.5 מיליליטר של מתנול. הוסף פאלודין לתוך PBS בדילול של אחד עד 100 עבור רצפת Alexa 405 אחד עד 1000 עבור אלכסה קומה 488 ואחד עד 200 עבור קומת אלקסה 594.מוסיפים מיליליטר אחד של הפתרון לתאים ו דגירה אותם במשך 30 דקות תוך כדי סיבוב. לשטוף את התאים שלוש עד חמש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לאחר מכן החלף את ה- PBS ב- 100 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה.כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב למקם את דגימת היעד על המיקרוסקופ בתוכנת ההדמיה, לפתוח את העיצוב ולהפעיל חלון ניסוי, להגדיר את שלב Z המתאים ולבחור את הערוצים הכחולים, הירוקים והארדומים. בכרטיסיה הפעלה, הוסף את שם קובץ התמונה והתחל בהדמיה. כדי להשיג תמונות התייחסות crosstalk למדידת משמרות כרומטיות בדגימה בחר את אור העירור רק עבור Dappy וודא להשתמש בדיוק באותו מיקום שלב וגובה Z כמו עבור דגימת היעד.לחלופין, כדי להשתמש בתדמית שדה בהיר כמקום התייחסות לדגימה היעד במיקרוסקופ השדה הרחב ולרכוש תמונה פלואורסצנטית של המטרה בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים. לאחר מכן לרכוש תמונות שדה בהיר של היעד בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים באותו מיקום שלב בדיוק באמצעות אותו גובה Z. כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כגון 3D Sim למקם את דגימת היעד על המיקרוסקופ ולרכוש תמונת סים פלואורסצנטי של היעד בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים.לאחר מכן שחזר את התמונה הסופר-פתורה. לאחר מכן במקום הכתם מדגם עם פאלואין צבעוני על מיקרוסקופ sim 3D. ולרכוש תמונות סים פלואורסצנטיות מרובות כתמונות התייחסות כיול ביולוגי במיקומים בשלב נקודה, ולאחר מכן לשחזר את התמונות סופר פתור.השתמש בדפדפן אינטרנט כדי להוריד את הפרסום הבינארי החדש ביותר של Chromagnon. לחלץ את התוכנית ולשים את קובץ ההפעלה במיקום נוח. גרור ושחרר את קבצי ההפניה של הפניות לשדה ימני של crosstalk או להפניות כיול ביולוגי לתיבת ההפניה או לחץ על קבצי הפניה כדי לפתוח תיבת דו-שיח של בורר קבצים.אם התוכנית מבקשת להתקין ערכת פיתוח Java, לחץ על כן ונווט אל הדף שהורד. לאחר מכן הורד והתקן את JDK עבור מערכת ההפעלה בהתאם להנחיות. גרור ושחרר את קבצי היעד של כתמי נוגדנים בתיבת היעד.בחרו תבנית תמונת פלט וציינו את הסיומת של שם קובץ הפלט. לתמונות ייחוס Crosstalk עם יחס אות לרעש גבוה. בחר הקרנה מרשימת הבחירה של יישור מקומי ולהשתמש בגודל חלון מינימלי של 60.לקבלת מספר תמונות הפניה לכיול ביולוגי, בדקו את אפשרות ההפניות הממוצעות ובחרו באפשרות 'ללא' ליישור מקומי, ולחצו על 'הפעל הכל' כדי להתחיל במדידות. כדי לוודא שהמידה בוצעה כראוי, גרור ושחרר את תמונות הייחוס בתיבת ההפניה ובתיבת היעד. לאחר מכן הפעל את התוכנית וודא שהתמונות חופפות באופן מושלם.תיקון הזזה כרומטי במיקרוסקופיה שדה רחב יכול להתבצע באמצעות תמונת ייחוס crosstalk. תמונה זו הושגה עם מיקרוסקופ שדה רחב מצויד במצלמה אחת. פליטת פלואורסצנטיות מ- Dappy שימשה כהפניה לתיקון הערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים.לאחר היישור עם הכרומגנון תוקנה ההפניה הכרומטית ותדמית הייחוס. כאשר פרמטר היישור הוחל על תמונת היעד על ידי כרומגנון ה- DNA וגשר האנפאזה, אשר נראה באופן שגוי מחוץ למעטפה הגרעינית לפני היישור מופיע כצפוי בתוך המעטפה. ניתן לבצע תיקון הזזה כרומטי של תמונת SIM תלת-מימדית באמצעות תמונת ייחוס לכיול ביולוגי.שלוש תמונות SIM תלת-מימדיות של תאי הלה מוכתמים בפאלואידינים מצומדים לצבעים כחולים, ירוקים ואדומים היו משועבדים והמשמרת הכרומטית נמדדה על ידי כרומגנון. לאחר היישור תוקנה ההפניה הכרומטית ותדמית ההפניה. פרמטר היישור הוחל על תמונת יעד.תצוגת XZ מציגה מיקום ערוץ שגוי לאורך ה- Z ומעט לאורך הוראות ה- X, ותוקנה לאחר היישור. לקבלת הביצועים הטובים ביותר חשוב להשיג תמונות ייחוס באותם תנאים ואת התזמון כמו תמונות יעד.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...