Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
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इस अध्ययन को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबरजे19H03202 से पूर्वाह्न तक समर्थित किया गया था, JP18H05528 और JP17H03636 T.H., और JP17H01444 और JP18H05533 H.Y. एल.एस. द्वारा समर्थन को स्वीकार करता है वेलकम ट्रस्ट स्ट्रैटेजिक अवार्ड्स ०९१९११ और 107457/Z/15/Z फंडिंग माइक्रोन ऑक्सफोर्ड में उन्नत इमेजिंग ।

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

मात्रात्मक मल्टीकलर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विभिन्न तरंगदैर्ध्य पर अधिग्रहीत रंग चैनलों के सावधान स्थानिक मिलान पर निर्भर करता है। रंगीन विचलन और कैमरों के अपूर्ण संरेखण के कारण, प्रत्येक चैनल में अधिग्रहीत छवियों को स्थानांतरित किया जा सकता है, और बढ़ाया जा सकता है, साथ ही तीन आयामों में से किसी में एक दूसरे के सापेक्ष घुमाया जा सकता है। शास्त्रीय अंशांकन विधि के साथ, रंगीन बदलाव ों को कवरस्लिप की सतह से जुड़े बहुरंगी मोतियों द्वारा मापा जाता है, और इस तरह के अंशांकन नमूनों से रंगीन बदलावों को मापने के लिए कई सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं। हालांकि, रंगीन विपथन गहराई के साथ भिन्न हो सकता है, अवलोकन स्थितियों के साथ बदल सकता है और जैविक नमूने द्वारा ही प्रेरित किया जा सकता है, इस प्रकार ब्याज के नमूने में और मात्रा में रंगीन बदलाव की सही मात्रा के निर्धारण में बाधा डालता है। उच्च सटीकता पर रंगीन बदलाव को ठीक करना सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जहां केवल मामूली रंगीन बदलाव मात्रात्मक विश्लेषणों को प्रभावित कर सकते हैं और बहुरंगी छवियों की व्याख्या को बदल सकते हैं। हमने जैविक नमूनों में 3डी रंगीन बदलावों को मापने और सही करने के लिए एक ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर क्रोमाग्नोन और साथ के तरीके विकसित किए हैं। यहां हम एक विस्तृत आवेदन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसमें ब्याज के जैविक नमूनों में रंगीन बदलाव को मापने के लिए नमूना तैयार करने, डेटा अधिग्रहण और सॉफ्टवेयर प्रसंस्करण के लिए विशेष आवश्यकताएं शामिल हैं।

क्रॉसटॉक संदर्भ छवि का उपयोग करके रंगीन बदलाव सुधार का एक उदाहरण चित्र 5में दिखाया गया है। छवि एक एकल कैमरे से लैस एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था । DAPI से फ्लोरेसेंस उत्सर्जन नीले, हरे और लाल चैनलों को सही करने के लिए एक संदर्भ(चित्रा 5ए, बी)के रूप में इस्तेमाल किया गया था। छवि में 60 जेड स्लाइस के 3 चैनल शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक 256 x 256 पिक्सल से बना है। रंगीन बदलावों को मापने से पहले छवियों को विघटित किया गया था। क्रोमाग्नन का उपयोग करके स्थानीय रंगीन बदलावों को मापने के लिए इंटेल कोर i7 (क्वाड कोर, 8-थ्रेड्स, 2.7 गीगाहर्ट्ज), 16 जीबी रैम और 1 टीबी फ्लैश स्टोरेज के साथ मैक पर 51 एस लिया गया। संरेखण पैरामीटर को लक्ष्य छवि(चित्रा 5सी, डी)पर लागू किया गया था, जिसमें संदर्भ छवि के समान संख्या में स्वर हैं। गठबंधन फाइल तैयार करने में 3 एस लग गए। अलाइनमेंट प्रोसेस (फिगर 1Cमेंक्रॉप मार्जिन चेकबॉक्स) के दौरान एज पिक्सल को ट्रिम करने के परिणामस्वरूप, अलाइनमेंट(चित्रा 5B, 51जेड स्लाइस, 252 x 251 पिक्सल) के बाद वोक्सल की संख्या कम हो गई थी। एनाफेज ब्रिज में डीएनए (एरोहेड द्वारा इंगित) संरेखण से पहले परमाणु लिफाफे के बाहर गलत तरीके सेदेखा जाता है (चित्रा 5C,XZ दृश्य दिखाने वाले नीचे पैनल में स्पष्ट), लेकिन संरेखण के बाद लिफाफे के अंदर की उम्मीद(चित्रा 5D)।
जैविक अंशांकन संदर्भ छवि का उपयोग करके रंगीन बदलाव सुधार का एक उदाहरण चित्र 6में दिखाया गया है । छवियों को तीन कैमरों से लैस एक सिम माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया । हेला कोशिकाओं की तीन छवियों को नीले, हरे और लाल रंगों के लिए संयोजित ल्लोइडिन से सना हुआ औसत(चित्रा 6A)किया गया था। संदर्भ छवि में 76 जेड स्लाइस के 3 चैनल शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक 1,024 x 1,024 पिक्सल से बना है। ऊपर वर्णित मैक सिस्टम पर 1 9 4 एस की आवश्यकता वाले स्थानीय संरेखण के बिना क्रोमाग्नन का उपयोग करके रंगीन बदलावों को मापना। पैरामीटर को 73 जेड स्लाइस के 3 चैनलों से मिलकर एक लक्ष्य छवि पर लागू किया गया था, प्रत्येक 1,024 x 1,024 पिक्सल से बना था। गठबंधन फ़ाइल की पीढ़ी 25 एस लिया । XZ दृश्य जेड के साथ गलत चैनल पदों से पता चलता है, और थोड़ा एक्स दिशाओं के साथ(चित्रा 6A, C)लेकिन इस गलत पंजीकरण संरेखण के बाद सही किया गया था(चित्रा 6बी, डी)।
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> चित्रा 5: क्रॉसटॉक संदर्भ छवि के साथ संरेखण का एक उदाहरण। हेला कोशिकाओं को डीएनए के लिए DAPI से सना हुआ था (मजेंटा में दिखाया गया है), एलेक्सा फ्लोर 488 (पीले रंग में दिखाया गया है) परमाणु लिफाफे के लिए, और एलेक्सा फ्लोर 555 (नीले रंग में दिखाया गया है) माइक्रोट्यूबल्स के लिए। छवियों को एक कैमरे के साथ 3 डी वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत किया गया था और deconvolved । (A,B) क्रोमाग्ननद्वारा संरेखण से पहले और बाद में DAPI उत्सर्जन का उपयोग करके एक प्रतिनिधि क्रॉसटॉक संदर्भ छवि। तीन रंग चैनलों को मढ़ा के रूप में दिखाया गया है। (C,D) संरेखण से पहले और बाद में तीन चैनलों में 3डी स्टैक का एक ऑप्टिकल सेक्शन। अारोहियों द्वारा दिखाए गए एनाफेज पुल पर अक्षीय रंगीन विपथन स्पष्ट है। पैनल ए में स्केल बार सभी पैनलों के लिए 5 माइक्रोन इंगित करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> चित्रा 6: जैविक अंशांकन संदर्भ छवि के साथ संरेखण का एक उदाहरण छवियों को तीन कैमरों से लैस 3डी-सिम के साथ अधिग्रहीत किया गया था । (A,B) एक संदर्भ छवि जो पहले(ए)और बाद(बी)संरेखण से औसतन होती है। हेला कोशिकाओं को एलेक्सा फ्लोर 405, 488 या 594 के साथ संयुग्मित फ्लामोइडिन से सना हुआ था। (C,D) लक्ष्य छवि से पहले(C)और बाद(D)संरेखण । हेला कोशिकाओं को डीएनए के लिए DAPI से सना हुआ था (मजेंटा में दिखाया गया है), एलेक्सा फ्लोर 488 (पीले रंग में दिखाया गया है) परमाणु लिफाफे के लिए, और एलेक्सा फ्लोर 594 (नीले रंग में दिखाया गया है) माइक्रोट्यूबल्स के लिए। पैनल ए में स्केल बार सभी पैनलों के लिए 5 माइक्रोन इंगित करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के लिए त्रि-आयामी (3 डी) बहुरंगी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में रंगीन बदलावों का सुधार महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल उपयुक्त संदर्भ छवियों के अधिग्रहण और ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर, क्रोमाग्ननके साथ प्रसंस्करण के माध्यम से जैविक नमूनों में रंगीन बदलावों को मापने और सही करने के लिए विकसित किया गया है।

क्रोमाग्नोन का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन बायोलॉजिकल इमेजिंग के युग में 3डी रंगीन बदलावों का उच्च सटीकता सुधार

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

मार्श कोरल माइक्रोस्कोपी छवियों में तीन आयामों में रंगीन बदलाव होते हैं। जो उच्च संकल्प छवियों के कोलोकैलाइजेशन विश्लेषण को ख़राब करता है। आम तौर पर जैविक नमूने से उत्पन्न रंगीन बदलाव को हटाना मुश्किल होता है, हमारी विधि अलग-अलग अधिग्रहीत संदर्भ छवियों का उपयोग करके जैविक नमूने में रंगीन बदलाव को सही कर सकती है।प्रक्रिया का प्रदर्शन Takako Koujin मेरे समूह से एक तकनीशियन होगा । एक ३५ मिलीमीटर ग्लास नीचे पकवान पर पांचवें मरहम लगाने वाले कोशिकाओं के लिए २.५ गुना 10 बोने से शुरू करें और उन्हें एक कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में बढ़ रही है । इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद पीबीएस में ३.७% फॉर्मलडिहाइड के दो मिलीलीटर के साथ माध्यम की जगह और धीरे मिश्रण ।एक घूर्णन मंच पर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए बिक्री तय करें। कोशिकाओं को पांच से 10 मिनट के लिए पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। उन्हें बिंदु 1% के दो मिलीलीटर के साथ पार करना पीबीएस में अगले 100 की कोशिश करते हुए घुमाते हैं और पीबीएस के साथ वॉश दोहराते हैं।फिर पाठ पांडुलिपि में वर्णित मानक एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करके कोशिकाओं को दाग दें। वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के लिए क्रॉसटॉक संदर्भ की संदर्भ छवि प्राप्त करने के लिए, डीएनए में रहने के लिए बिंदु पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए घूर्णन मंच पर छोड़ दें।फिर समाधान को बढ़ते माध्यम के 100 माइक्रोलीटर के साथ बदलें, जिसमें कॉन्फोकल और सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी सहित किसी भी प्रकार की माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक अंशांकन संदर्भ की संदर्भ छवि प्राप्त की जा सके। कोशिकाओं को पहले वर्णित के रूप में ठीक करें, और स्टॉक समाधान को 1.5 मिलीलीटर मेथनॉल में फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित फालोइडिन तैयार करें। एलेक्सा फ्लोर 405 से 1000 के लिए एलेक्सा फ्लोर 488 के लिए और एक से 200 के लिए एलेक्सा फ्लोर 594 के लिए एक से 100 के कमजोर पड़ने पर पीबीएस में फालॉइडिन जोड़ें।कोशिकाओं के समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें और घूर्णन करते समय उन्हें 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ तीन से पांच बार धोएं। इसके बाद पीबीएस को माउंटिंग मीडियम के 100 माइक्रोलीटर से बदलें।वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में माइक्रोस्कोप पर लक्ष्य नमूना रखें, डिजाइन खोलें और प्रयोग खिड़की चलाएं, उपयुक्त जेड चरण सेट करें और नीले, हरे और लाल चैनलों का चयन करें। रन टैब में, छवि फ़ाइल नाम जोड़ें और इमेजिंग शुरू करें। नमूने में रंगीन बदलाव को मापने के लिए क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों को प्राप्त करने के लिए केवल डैप्पी के लिए उत्तेजन प्रकाश का चयन करें और लक्ष्य नमूने के लिए सटीक एक ही चरण की स्थिति और जेड ऊंचाई का उपयोग करना सुनिश्चित करें।वैकल्पिक रूप से, व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर लक्ष्य नमूने के संदर्भ स्थान के रूप में एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि का उपयोग करने और नीले, हरे और लाल चैनलों में लक्ष्य की फ्लोरेसेंस छवि प्राप्त करने के लिए। फिर सटीक एक ही चरण की स्थिति में नीले, हरे और लाल चैनलों में लक्ष्य की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को प्राप्त करें और एक ही जेड ऊंचाई का उपयोग करें। सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करने के लिए, जैसे कि 3 डी सिम माइक्रोस्कोप पर लक्ष्य नमूना रखें और नीले, हरे और लाल चैनलों में लक्ष्य की फ्लोरेसेंस सिम छवि प्राप्त करें।फिर सुपर हल छवि का पुनर्निर्माण करें। अगले 3डी सिम माइक्रोस्कोप पर मल्टीकलर फ्लोइडिन के साथ नमूना दाग रखें। और बिंदु चरण की स्थिति में जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों के रूप में कई फ्लोरेसेंस सिम छवियों को प्राप्त करें, फिर सुपर हल छवियों का पुनर्निर्माण करें।क्रोमाग्नोन की नवीनतम बाइनरी रिलीज डाउनलोड करने के लिए वेब ब्राउज़र का उपयोग करें। कार्यक्रम निकालें और एक सुविधाजनक स्थान में निष्पादन योग्य फ़ाइल डाल दिया। फ़ाइल चयनकर्ता संवाद खोलने के लिए संदर्भ बॉक्स या क्लिक संदर्भ फ़ाइलों के संदर्भ संदर्भों को खींचें और छोड़ दें।यदि कार्यक्रम जावा डेवलपमेंट किट स्थापित करने के लिए कहता है, तो हां दबाए और डाउनलोड किए गए पृष्ठ पर नेविगेट करें। फिर निर्देश के अनुसार ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए जेडीके डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें। टारगेट बॉक्स में एंटीबॉडी धुंधला की टारगेट फाइल्स को खींचें और छोड़ दें।आउटपुट इमेज फॉर्मेट चुनें और आउटपुट फाइल नाम के लिए प्रत्यय निर्दिष्ट करें। शोर अनुपात के लिए उच्च संकेत के साथ क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों के लिए। स्थानीय संरेखण की पसंद सूची से प्रक्षेपण चुनें और 60 के न्यूनतम विंडो आकार का उपयोग करें।एक से अधिक जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों के लिए औसत संदर्भ विकल्प की जांच करें और स्थानीय संरेखित करने के लिए कोई भी चुनें, फिर माप शुरू करने के लिए सभी को चलाने पर क्लिक करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माप सही ढंग से किया गया था, संदर्भ छवियों को संदर्भ बॉक्स और लक्ष्य बॉक्स में खींचें और छोड़ दें। फिर कार्यक्रम चलाएं और सत्यापित करें कि छवियां पूरी तरह से छा गई हैं।वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी में रंगीन शिफ्ट सुधार क्रॉसटॉक संदर्भ छवि का उपयोग करके किया जा सकता है। इस छवि को एक एकल कैमरे से लैस एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था। डैपी से फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का उपयोग नीले, हरे और लाल चैनलों को सही करने के संदर्भ के रूप में किया गया था।क्रोमेग्नोन के साथ संरेखण के बाद रंगीन शिफ्ट और संदर्भ छवि को ठीक किया गया था। जब संरेखण पैरामीटर को डीएनए और एनाफेज पुल द्वारा लक्षित छवि पर लागू किया गया था, जो परमाणु लिफाफे के बाहर गलत तरीके से देखा जाता है इससे पहले कि संरेखण लिफाफे के अंदर अपेक्षित दिखाई देता है। 3 डी सिम इमेज का रंगीन शिफ्ट सुधार जैविक अंशांकन संदर्भ छवि का उपयोग करके किया जा सकता है।नीले, हरे और लाल रंगों के लिए संयुग्मित फीलोइडिन के साथ दाग हेला कोशिकाओं के तीन 3 डी सिम छवियों को averged किया गया था और रंगीन बदलाव क्रोमाग्नोन द्वारा मापा गया था । संरेखण के बाद रंगीन बदलाव और संदर्भ छवि को ठीक किया गया था। संरेखण पैरामीटर को लक्षित छवि पर लागू किया गया था।XZ दृश्य जेड के साथ गलत चैनल की स्थिति और एक्स दिशाओं के साथ थोड़ा दिखाता है, जिसे संरेखण के बाद ठीक किया गया था। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए एक ही शर्तों के तहत संदर्भ छवियों और एक लक्ष्य छवियों के रूप में समय प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

एक उपन्यास आरएफपी रिपोर्टर आँखों Imaginal डिस्क के विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता ड्रोसोफिला</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

जैविक चुंबकीय मॉडुलन biosensing प्रणाली का उपयोग Assays रैपिड सजातीय जांच

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

आयु पर निर्भर जीनोमिक अस्थिरता अध्ययन का उपयोग एस. cerevisiae कालानुक्रमिक जीवन मॉडल

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

बैक्टीरियल डिवीजन मशीनरी की सुपर संकल्प इमेजिंग

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

अनुकूलन तूफान सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए परीक्षण के नमूने

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

एकल वीरीय परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

फास्ट 3D-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीवित बैक्टीरिया में Cytokinetic जेड अंगूठी के सुपर संकल्प इमेजिंग (f3D सिम)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग और जीवित मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं में microtubule गतिशीलता की स्वचालित विश्लेषण

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper के साथ सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए ओपन-सोर्स एकल कण विश्लेषण

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में जमीन राज्य घट सुपर संकल्प इमेजिंग

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...