Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

この研究は、JSPS KAKENHIグラント番号JP19H03202からA.M.に支援されました。 JP18H05528およびJP17H003636からT.H.、JP17H01444およびJP18H05533からH.Y.L.S.は、ウェルカム・トラスト・ストラテジック・アワード091911および107457/Z/15/Z資金調達のシニアイメージングを認めています。

<ol>
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著者らは開示するものは何もない。

色補正の手順は、精度と労力のトレードオフです。不必要な努力を省くために、あなたの研究に必要な正確さの程度を知る方がよいでしょう。従来の広視野(ライブ)イメージングでは最高の精度が必要ない場合があり、したがって、明視野参照画像は多くの場合、色調シフトを補正するのに十分です。同様に、イメージング条件と環境が一定の場合、生物学的較正を繰り返し使用すると時間を節約できます。一方、高精度な登録が望まれる場合は、高品質のクロストークや生体校正基準画像が必要です。最適なパフォーマンスを得るため、参照画像は、可能な限りターゲットイメージと同様の条件とタイミングで取得する必要があります。参照画像とターゲット画像の両方が同じ顕微鏡で取得されている限り、空間解像度が高いほど補正精度が向上します。参照イメージとターゲット イメージの両方にデコンボリューションが使用可能な場合、修正前にこれを実装すると、補正精度が向上する可能性があります。また、最適なパフォーマンスを得るため、正確なサブピクセル補間を行うため、参照ファイルとターゲットファイルの両方で光(Z)軸のサンプリング定理を満たす必要があります(プロトコルステップ2.1.3)。
色のシフトを修正しないと、誤った結論につながります。さらに、間違ったキャリブレーションを使用すると、クロマティックシフトを補正するのではなく、さらに悪化させる可能性があるため、これを避ける必要があります。失敗の考えられる原因と、その共通の解決策を表 2に要約しました。故障の原因を調べるには、まず、基準画像の色ずれが正確に補正されているかを視覚的に確認する必要がある(プロトコルステップ3.12)。ほとんどの障害は、参照イメージの品質によるものであり、表 2の説明に従って簡単に改善できます。参照画像の品質に関しては、全体の視野がサンプルで満たされていない場合、グローバル配置の精度が低下することに注意することが重要です (図7、表2)。図7Aに示す良い例と比較すると、図7Bに示されている悪い例は左上領域に3つの核エンベロープしか含まれず、クロマニョンはこの画像の一部を整列させることができませんでした。これは、クロマニョンのグローバルアライメント方法が、高い精度で回転と倍率の差を測定するために視野を4つの領域(図7C)に分割するためである。この方法は、正しく動作すれば、対数極変換やシンプレックス法3などの他の線形法よりも1つの順序で正確である。4つの領域のいずれかが利用できない場合、クロマニョンは効果の低い線形法に切り替えます。したがって、最適なパフォーマンスを得るため、図7Bおよび図 7Cに示す例は望ましくありません。ユーザーは、ログファイル(「Chromagnon.log」;プロトコルステップ3.10を参照)を見て、視野の二次領域が測定に利用できないかどうかを確認できます。幸いにも、この問題は、複数の生物学的較正画像を平均化するか、クロストークまたは明視野参照画像に局所的なアライメントを使用することによって簡単に克服できる(表2)。参照画像の修正に失敗した場合とは対照的に、ターゲット画像の修正に失敗すると識別が困難になります。このような障害は、ファイル形式、画像化条件、イメージングのタイミング、参照画像とターゲット画像のイメージング/アライメント方法の違いにより生じるため(表2)、ターゲット画像とは異なる条件/タイミングで取得した参照画像を使用する場合は常に注意が必要です。いくつかの例の画像は、良い例と悪い例のイメージの具体的なアイデアを得るために<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)</a>テストのために利用可能です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>問題</td>
			<td>原因</td>
			<td>ソリューション</td>
		</tr>
<tr>
<td>参照イメージを修正できませんでした</td>
			<td>低コントラスト</td>
			<td>可能であれば、より高いコントラスト画像を取得します。明視野参照画像を使用する場合は、水ベースの溶液で画像を再取得し、セルのコントラストを高くします。あるいは、計算ノイズリダクション(ガウスフィルタリングなど)を適用してみてください。ノイズに対する感度が高いローカルアライメントをオフにします。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>無関係画像の汚染</td>
			<td>可能な場合は、サンプル内の無関係の画像のソースを削除します。クロストーク参照画像の場合、ターゲット画像に使用される染料の励起スペクトルを確認します。クロストーク画像の取得中に色素が励起される場合(例えば、Alexa Fluor 568または594)、他の色素(例えばAlexa Fluor 555)を検討してください。カメラチップのほこりが明らかなチャネルの違いを生み出す場合は、カメラチップをクリーニングするか、計算的なフラットフィールディング方法を使用します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>宇宙線で作られた非常に明るいスポット</td>
			<td>可能であれば、画像を再度取得します。あるいは、計算ノイズリダクション(例えば、中央値またはガウスフィルタリング)を適用してみてください。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>デコンボリューションアーティファクト(軸辺と横辺の人工信号)</td>
			<td>デコンボルション後にエッジピクセルまたはZセクションをトリムします。一方の側をトリムする場合は、もう一方の側もトリミングしてイメージの中心を維持する必要があります。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Z ステップ サイズがまばらすぎる</td>
			<td>Z スタックは、プロトコル 2.1.3 に記述されているようにナイキスト基準を満たすために取得する必要があります。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>光学収差</td>
			<td>球面収差は、ユーザーによって引き起こされる主要な収差です。サンプルに適した対物レンズを選択し、カバースリップ厚さ170μmを使用します。対物レンズに補正リングが付いている場合は、焦点から蛍光数が最も高い位置を見つけるために調整します。補正リングのない油浸性目的の場合、焦点で蛍光数を増加させる浸漬油の屈折率を調整します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>視野が未入力(図7)</td>
			<td>生物学的較正基準画像の場合、多くの画像を平均する。クロストークまたは明視野参照画像の場合は、ローカルアライメントを使用します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ソフトウェアの未確認バグ</td>
			<td>GitHub を通じて問題を報告する (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ターゲット イメージを修正できませんでした</td>
			<td>イメージ ファイルのメタデータが失われる</td>
			<td>完全なメタデータを含むオリジナルの顕微鏡ファイル形式を使用し、処理前にマルチページのtiffファイルに変換しないようにしてください。プロトコル 3.3 で書かれているチャネルの順序と同じ順序を使用します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>与えられた顕微鏡のための間違ったアライメント方法</td>
			<td>生体キャリブレーション基準画像からターゲット画像まで測定する場合は、局所アライメント法を適用しないでください。広視野顕微鏡以外のクロストーク参照画像は使用しないでください。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>イメージング条件の違い</td>
			<td>プロトコル 2.3.3 に記述されているように、参照イメージとターゲット イメージの間で一定のイメージング条件を維持します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>サンプルの違い (カバースリップを含む)</td>
			<td>常に同じ取り付け媒体、カバースリップ(例えばNo.1.5H)および同様の焦点深度を使用してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>キャリブレーションが最後に行われたので顕微鏡のドリフト</td>
			<td>2週間ごとにキャリブレーションを行います。温度を一定に保ち、浮動テーブルを使用して、顕微鏡のハードウェアドリフトを避けます。</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:色補正のトラブルシューティング
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> 図7:参照画像の例核分裂酵母細胞にGFPとmCherryで標識された核エンベロープ。従来の広視野顕微鏡で画像を取得した。クロマティックシフトは、画像自体を基準画像として使用して、局所的な位置合わせなしにクロマニョンを使用して補正しました。その後、画像をデコンボルブして詳細を表示しました。(A) 視野に多数のオブジェクトがある良い例。(B) オブジェクトが左上隅にある場合にだけ、不適切な例です。イメージの特定の領域では、ずさみが明らかです。(C) 四重節の 1 つ (点線で区切られた) が空の望ましくない例。パネルAのスケールバーは、全視野ビューでは5μm、拡大表示では1.25μmと示し、すべてのパネルに適用可能です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このプロトコルでは、3 つの異なる参照タイプについて説明しました (表 1)。その中で、クロストークリファレンス画像と生物学的較正基準画像は、さらに慎重な議論が必要です。クロストーク基準画像の場合、サンプルはDAPIまたはHoechst 33342で染色され、グリセロールまたは市販の取り付け媒体に取り付けられ、ブルー、グリーン、および赤色のチャネルを整列させるために効率的に使用できます。同様に、アレクサのフルーラ 488 は、緑と赤のチャンネルを整列するために使用できます。しかし、DAPIとHoechstを除く多くの青色染料は、ほとんどの緑と赤の染料よりも薄暗く、腐敗するので、クロストーク蛍光を得ることはしばしば困難です。さらに、現代の色素の発光スペクトルは狭く、この方法によって3チャンネル以上のアライメントが困難になります。また、青色の色素からコントラストの高いクロストーク画像を得ることを防ぐ紫色光で励起できる一般的な赤色色素(例えば、Alexa Flour 568と594、Alexa Fluor 555ではない)にも注意が払われるべきです。もう一つの欠点は、この方法が励起に単一の励起波長しか使用されていないので、多色励起における励起光経路の色収差を測定できないことである(表1)。最も高度な顕微鏡は、変更された照明光学を使用するので、この方法の適用は限られている。それでも、その高い補正精度は、このプロトコルに記載されるには十分に有利である。一般に、クロストーク画像は、漂白や光毒性の影響を防ぐために、ターゲット画像の後に撮影する必要があります。広視野モードで観察されたSMLMの場合、蛍光色素がイメージング中に漂白することができるので、ターゲット画像を取得する前に基準画像を取得する必要があります。
生物学的キャリブレーション基準画像により、ユーザーは追加サンプル調製のコストで任意の数のチャネルを容易に整列させることができます。生物学的較正基準画像のもう1つの利点は、すべての視野を埋めるのに役立つ複数の参照を「平均」する可能性です。この方法は、キャリブレーションサンプルが別のスライドで調製された場合、イメージング条件の違いに苦しむ可能性があります。この問題のほとんどは、市販のチャンバーカバーグラス(表1)を使用して同じスライド上にターゲットと参照の両方を準備し、他のイメージング条件がプロトコルステップ2.3.3のように一定に保たれている場合に解決できます。この場合、クロストーク参照画像と同様の補正精度が期待できる3.ここに示すようにファロイジンを使用するプロトコルは、複数の色で単一の細胞構造を染色する最も簡単な方法の一つです。生物学的較正サンプルを準備するシナリオは数多くあります。免疫染色の場合、サンプルは単一の一次抗体で標識され、その後に複数色の二次抗体で染色することができます。このようにして、1 つのターゲット構造に複数の色でラベルを付けることができます。あるいは、5-エチニル-2'-デオキシウリジンは、高密度で複数色で新たに合成されたDNAを「クリック」化学ラベルで検出し、詳細に前述した8。生細胞の場合、GFPまたはmCherryに融合した遺伝子の2つのコピーを含むトランスジェニック株を調製して、同じ構造を2色でラベル付けすることが有用である。膜タンパク質に対してしばしば観察されるほど、遺伝子のコピー数が重要である場合、遺伝子の単一のコピーをGFPとmCherryとタンデム的に融合させることができる(図7)。mEOS218のような光変換可能な蛍光タンパク質は、適度なレベルの紫色光を照明することによって使用して、光変換の有無にかかわらず両方のタンパク質種を得ることができる。低酸素条件下では、GFPは、緑から赤19、20,20までの光変換可能なタンパク質としても使用できます。適切なキャリブレーションサンプルを選択すると、実験がより堅牢になります。

多色イメージングは、生物学的蛍光顕微鏡の基本的な側面の1つであり、異なる分子または構造の空間的関係が大きな関心事である場合です。色収差は、分散によって引き起こされる多色光の光学収差であり、対象とする着色物の見かけの位置を変化させる。同様に、各色の獲得に専念する複数のカメラを搭載した顕微鏡は、光学要素の違いとチャンネル間の不完全なアライメントにより、より複雑な色調シフトを有する。したがって、このような色の変化は、ユーザーによって明示的に修正されない限り、誤った結論につながる可能性があります。顕微鏡の解像度が古典的な解像度限界によって制限されている限り、色彩学的変化は大きな問題とはならなかったが、近年の超解像顕微鏡1の開発は、色素シフトのより正確な補正の必要性を促している。
多色ビーズキャリブレーションスライド2を用いて顕微鏡システムの色調シフトを測定することは一般的な習慣でした。ビーズベースのキャリブレーション方法は、顕微鏡の光学系全体からカバースリップ2の表面に向かって色分けシフトを測定するのに適しています。しかし、この方法は、対象となる生物学的サンプルの色の変化を測定することができない。多くの生物学的サンプルは3次元(3D)であり、そのようなサンプルの色調シフトはカバースリップの表面のものとは異なることを注意することが重要です。さらに、光の変化は、画像化条件22,33と共に変化する。我々は、3D生物学的サンプルにおける色調変化を測定し、色度シフトの不確実性が古典的な多色ビーズ較正方法3によって350nmと多いことがわかった。したがって、色相シフトは、対象深度および使用されているイメージング条件下で生物学的サンプルで測定する必要があります。
ここでは、生物学的サンプルの色の変化を測定し、当社のソフトウェア、クロマニョン3を使用してこれらのシフトを修正する手順を説明します。生物学的サンプルの色素シフトを測定するために、我々の方法は「ターゲット」画像と「参照」画像の2種類のデータセットを使用します。「標的」画像は、目的とする多色画像であり、例えば、DNA、核エンベロープ、および微小管について染色された画像である。このような画像の色の変化を測定することはしばしば不可能です。したがって、サンプルの色の変化を測定するために専用の「参照」画像が必要です。「参照」画像の唯一の定義は、同じオブジェクトの多色画像です。この意味で、多色ビーズ画像は参照画像の一種でもある。ここでは、生体サンプルにおける色の変化を測定するために使用される3種類の参照画像について、「クロストーク参照画像」、「明視野参照画像」、「生物学的較正参照画像」について説明します。参照画像の種類は、使用されている顕微鏡の種類や、表1に要約した補正精度によって異なります。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>クロストーク</td>
			<td>明視野</td>
			<td>生物学的キャリブレーション(別のスライド上)</td>
			<td>生物学的キャリブレーション(同じスライド上)</td>
		</tr>
<tr>
<td>精度a
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>シンプル さ</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>適用可能な顕微鏡</td>
			<td>広視野</td>
			<td>広視野</td>
			<td>すべての</td>
			<td>すべての</td>
		</tr>
<tr>
<td>ローカルアライメントの可用性</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: 「+」の数は、評価の増加を示します。シングルプラスは約50nm、3プラスは3Dで約15nmである。 b: 精度は、可変イメージング条件をどの程度一定に保つのかによって異なります。 c:多色ビーズサンプルで測定されたローカルキャリブレーションは、プロトコルセクション4で説明されているように組み合わせることができる。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:参照画像のタイプを選択する際のパラメータ
「クロストーク参照画像」は、補正精度が最も高く3、3,4(4表1)を達成するのは比較的簡単です。欠点は、励起経路の色の変化を測定する能力がないため、顕微鏡アプリケーションの制限です。また、このような画像を得るためには、顕微鏡には、マルチバンドの二色性ミラー、および励起フィルタまたは光源から独立して制御される発光フィルタを装備する必要があります。適切な顕微鏡検査には、従来の広視野顕微鏡、光活性化局在化顕微鏡/確率的光学再構成顕微鏡(PALM/STORM)5、6、広視野顕微鏡検査で観察された拡張顕微鏡7などの一分子局在顕微鏡5,6(SMLM)が含まれる。クロストーク参照画像は、ターゲットサンプル自体から取得されます。必要なすべてのチャネルで得られた色素のクロストーク(ブリードスルー)蛍光の画像です。蛍光発光は常に長波長に向かって膨張するため、最短の発光波長を有する色素は、より長い波長のチャネルでクロストーク蛍光を得るために励起される。例えば、試料が青、緑、赤で染色されると、青染料だけが励起され、発光灯は青、緑、赤の各チャンネルで得られます。このプロトコルでは、4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)で染色されたDNAを使用して、蛍光クロストークを得た。
「明視野参照画像」は、「クロストークリファレンス画像」に代わる、より簡単で光毒性の低い画像ですが、最も正確でない3(表1)です。これらはターゲットサンプルの明るいフィールド画像であり、ターゲット画像で使用されるすべてのカラーチャンネルで取得される。
「生物学的較正基準画像」は、励起および放出経路3の両方で色分けシフトを測定する能力のために顕微鏡の任意のタイプに適用可能であるという利点を有する3、8(8表1)。適切な顕微鏡検査には、広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、光シート顕微鏡、刺激放出破壊(STED)9、構造化照明顕微鏡(SIM)10、Airyscan/SORA1011、12、SMLMが11,12全内部反射蛍光(TIRF)モード、オリンパス超分解能(OSR)13、および第2回を含む。13生物学的較正基準画像は、ターゲットサンプルと同様に調製されたキャリブレーションサンプルから取得されますが、複数の色を持つ単一の構造を染色します。補正精度は、ほとんどの超解像度顕微鏡の分解能に優れ、生物学的較正サンプルの調製は比較的簡単です。もう 1 つの利点は、複数の参照イメージを「平均」する可用性です。したがって、個々の画像にクロマティックシフトの測定に関する情報が乏しくても、複数の画像を平均化することで情報内容を増やすことができます。精度は、イメージング条件を一定に保つ量によって異なります。この点で、ターゲットサンプルとリファレンスサンプルの両方が同じスライド上にある場合、例えば8ウェルチャンバーカバーグラス(表1、右)を使用すると、最良の性能が得られる。このプロトコルでは、3色のファロイドンで染色されたアクチンを生体較正として用いた。
参照画像が得られたら、クロマチックシフトを測定し、当社のソフトウェアクロマニョンによって補正されます。クロマニョンがクロマチックシフトを測定して修正できるチャンネル、Zセクション、タイムフレームの数に制限はありません。クロマニョンは2段階でクロマチックシフトを測定します。最初のステップでは、X、Y、Z 軸、X、Y、Z 軸に沿った拡大、Z 軸の周りの回転における平行移動の「グローバル」または「アフィン」の位置合わせパラメータを取得します。グローバルアライメントの計算精度は、3Dで~16 nm、2Dで約8 nmです。2 番目のステップは、高い精度を得るために投影された画像に対するオプションの 2D 反復「ローカルアライメント」です。局所アライメントプロセスでは、画像は複数の領域に細分化され、これらの局所領域の色調シフトが測定されます。その後、領域がさらに分割され、サブ領域の色調シフトは、領域内のピクセル数が最小ピクセル数(通常は 60 x 60 ピクセル)に達するまで反復的に測定されます。結果として得られるローカル位置合わせマップは、グローバル位置合わせパラメータと結合され、弾性変換によってターゲット イメージに適用されます。このステップに続いて、計算精度は3Dで~14nm、2Dでは~6nmに改善される。局所的な位置合わせは、参照中の生物学的構造が標的の構造と異なるため、生体較正基準画像には適さない(表1)。したがって、生物学的較正参照画像にはグローバルアライメントのみが使用されます。
局所的な色の変化は2つのソースから始まる。顕微鏡器械のローカルな歪みおよび生物学的構造の不均一性。顕微鏡器用局所歪みは一定であるため、多色ビーズの基準試料から測定し、固定パラメータとして補正することができます。クロマニョンは、顕微鏡器による局所歪みマップと、生物学的較正からグローバルアライメントパラメータを組み合わせることができる(表1)。この方法を用いることで、生物学的較正の平均精度が1~2nm向上することが期待されます。
ここでは、最も簡単なローエンドから最高精度まで、当社のソフトウェアクロマニョンを用いて3D蛍光画像の色調シフトを補正するプロトコルについて説明します。HeLa細胞の免疫染色を例に挙げ、3次元広視野顕微鏡と3D-SIMを用いて観察します。第1のセクションでは、標的サンプルと生物学的較正サンプルの調製方法について説明する。プロトコルのこの部分は、研究の特定のターゲットに合わせて最適化する必要があります。第2部では、顕微鏡による3種類の参照画像の取得方法について述べています。想定は青、緑、赤のチャネルを取得することであったが、チャネルの組成は、研究の特定のターゲットと顕微鏡のセットアップによって変更する必要があります。顕微鏡が単一のカメラまたは複数のカメラを搭載しているかどうかは関係ありません。第3節では、当社のソフトウェアを使用して、参照画像を使用してターゲット画像の色調シフトを測定し、修正する方法について説明します。最後に、第4のセクションでは、顕微鏡の器械ローカル較正を用いて生体較正基準画像を補う方法について述べている。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

定量的多色蛍光顕微鏡は、異なる波長で獲得したカラーチャンネルの慎重な空間マッチングに依存しています。色収差とカメラの不完全な位置合わせにより、各チャンネルで取得した画像がシフトされ、拡大され、3次元のいずれかで互いに回転する可能性があります。従来のキャリブレーション法では、色のずれはカバースリップの表面に取り付けられた多色ビーズによって測定され、そのようなキャリブレーションサンプルからの色の変化を測定するためのソフトウェアが多数用意されています。しかし、色収差は深度によって変化し、観察条件によって変化し、生物学的サンプル自体によって誘導され、したがって、目的のサンプルおよび体積にわたって、真の量の色分けの決定を妨げる。色調シフトを高精度に補正することは、微少な色のシフトだけが定量的な分析に影響を与え、多色画像の解釈を変える超解像顕微鏡に特に関連しています。我々は、オープンソースソフトウェアクロマニョンと生物学的サンプルの3D色の変化を測定し、修正するためのそれに付随する方法を開発しました。ここでは、目的の生物学的サンプルの色素シフトを測定するためのサンプル調製、データ取得、およびソフトウェア処理のための特別な要件を含む詳細なアプリケーションプロトコルを提供します。

クロストーク参照画像を用いた色度シフト補正の例を図5に示す。画像は、単一のカメラを搭載した広視野顕微鏡で得られた。DAPIからの蛍光発光を基準として使用し、青色、緑、および赤色のチャネルを補正します(図5A,B)を参照しました。画像は60 Zスライスの3チャンネルで構成され、それぞれ256 x 256ピクセルで構成されています。画像は、色の変化を測定する前にデコンボルブされました。クロマニョンを使用してローカルの色のシフトを測定すると、Intel Core i7(クアッドコア、8スレッド、2.7 GHz)、16 GB RAM、1 TBフラッシュストレージを搭載したMacで51秒を取りました。アライメント パラメータは、参照画像とまったく同じ数のボクセルを持つターゲットイメージ (図 5C,D)に適用されました。整列ファイルの準備には 3 s が必要でした。配置プロセス中にエッジピクセルをトリミングした結果 (図 1Cのトリミングマージンチェックボックス)、位置合わせ後にボクセルの数が減少しました (図 5B、51Z スライス、252 x 251 ピクセル)。アナフェーズブリッジ内のDNA(矢印で示される)は、アライメントの前に核エンベロープの外で誤って見られます(図5C、XZビューを示す下のパネルでは明らかです)。しかし、アライメント後にエンベロープ内で期待通り(図5D)。
生体較正基準画像を用いた色度シフト補正の例を図6に示す。画像は3台のカメラを搭載したSIM顕微鏡で得られた。青色、緑色、赤色の色素に結合したファロイジンで染色されたHeLa細胞の3つの画像を平均化した(図6A)。参照画像は、76 Zスライスの3チャンネルで構成され、それぞれ1,024 x 1,024ピクセルで構成されています。上述のMacシステム上で194s必要なローカルアライメントなしでクロマニョンを用いてクロマチックシフトを測定する。このパラメータは、それぞれ 1,024 x 1,024 ピクセルで構成される 73 Z スライスの 3 チャンネルからなるターゲット イメージに適用されました。整列ファイルの生成には 25 s がかかった。XZ ビューは、Z 方向に沿ってチャネルの位置が正しくないことを示し、X 方向 (図 6A,C)に沿って少しだけ表示されますが、この誤った登録はアライメント後に修正されました (図 6B,D)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> 図5:クロストーク参照画像によるアライメントの例。HeLa細胞は、DNA(マゼンタで示されている)、核エンベロープのアレクサフルオール488(黄色で示す)、微小管のアレクサフルオール555(青色で示される)でDAPIで染色された。画像は、単一のカメラで3D広視野顕微鏡によって取得され、デコンボルブされました。(A,B)DAPI放出を使用した代表的なクロストーク参照画像で、クロマニョンによるアライメントの前後に.3 つのカラー チャネルがオーバーレイとして表示されます。(C,D)アライメント前後の 3 つのチャネルで 3D スタックの光学部分。矢印が示すアナフェーズブリッジでは、軸色収差が明らかです。パネルAのスケールバーは、すべてのパネルに対して5μmを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> 図6:生物学的キャリブレーション基準画像とのアライメントの例3台のカメラを搭載した3D-SIMで撮影した画像です。(A,B)(A) と (B) の配置の前の 3 つの画像から平均化された参照画像。HeLa細胞をアレクサフルオール405、488または594と共役したファロイジンで染色した。(C,D)(C)の前と後の (D) の配置のターゲット イメージ。HeLa細胞は、DNA(マゼンタで示されている)、核エンベロープのアレクサフルオール488(黄色で示す)、微小管のアレクサフルオール594(青色で示される)のDAPIで染色された。パネルAのスケールバーは、すべてのパネルに対して5μmを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

3次元(3D)多色蛍光顕微鏡画像における色分けの補正は、定量的データ分析において重要です。このプロトコルは、適切な参照画像の取得とオープンソースソフトウェアChromagnonでの処理を通じて、生物学的サンプルの色調変化を測定し、修正するために開発されています。

クロマニョンを用いた超解像生物学的イメージング時代における3次元色素の高精度補正

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

マーシュサンゴ顕微鏡画像は、3次元でクロマティックシフトが含まれています。これは、高解像度画像の共局在化分析を損なう。生体試料自体から生じるクロマティックシフトを除去することは一般に困難であり、我々の方法は、別々に取得した参照画像を用いて生体試料中の色分けを補正することができる。手順を実演するのが、私のグループの技術者である高金仁です。35ミリメートルのガラス底皿に2.5倍の10〜5番目のヒーラー細胞を播種し、二酸化炭素インキュベーターで増殖させることから始めます。24時間のインキュベーションの後、PBSで3.7%ホルムアルデヒドの2ミリリットルで培地を交換し、穏やかに混ぜます。回転プラットフォームで室温で15分間販売を修正します。2ミリリットルのPBSで細胞を5〜10分間洗浄します。2ミリリットルのポイント1%で透過させ、回転しながらPBSで次の100を試し、PBSでの化を繰り返します。次に、テキスト原稿に記載されているように標準抗体染色プロトコルを用いて細胞を染色する。広視野顕微鏡用のクロストーク参照の参照画像を取得するには、DNAに留まるには、1ミリリットルDappyあたり5マイクログラムのポイントを2ミリリットル加えます。回転するプラットフォーム上のセルを30分間放置します。次いで、溶液を100マイクロリットルの取り付け媒体に置き換える コンフォーカルおよび超解像度顕微鏡を含むあらゆる種類の顕微鏡用生物学的較正基準の参照画像を得る。先に述べたように細胞を固定し、1.5ミリリットルのメタノールで蛍光色素共役ファロイジンをストック溶液に調製した。Alexaフロア488用に1から1000、Alexaフロア594用に1〜200の1〜100の希釈でPBSにファロイジンを追加します。溶液を1ミリリットルずつ細胞に加え、回転しながら30分間インキュベートします。2ミリリットルのPBSで細胞を3〜5回洗います。その後、PBSを100マイクロリットルの取り付け媒体に交換します。広視野顕微鏡を用いて蛍光画像を取得するには、画像処理ソフトウェアで顕微鏡上のターゲットサンプルを配置し、設計と実行実験ウィンドウを開き、適切なZステップを設定し、青、緑、赤のチャンネルを選択します。[ファイル名を指定して実行] タブで、イメージ ファイル名を追加し、イメージングを開始します。サンプル内のクロマティックシフトを測定するためのクロストークリファレンス画像を取得するには、Dappyの励起光のみを選択し、ターゲットサンプルとまったく同じステージ位置とZ高さを使用してください。あるいは、広視野顕微鏡上の標的試料への基準場所として明視野画像を用い、青、緑、赤色のチャネルで標的の蛍光像を取得する。その後、まったく同じステージ位置で、同じZ高さを使用して、青、緑、赤のチャンネルでターゲットの明るいフィールド画像を取得します。3D Simなどの超解像度顕微鏡を用いて蛍光画像を取得するには、対象試料を顕微鏡に載せ、青、緑、赤のチャネルでターゲットの蛍光シム画像を取得します。次に、超解決イメージを再構築します。次に、3D SIM顕微鏡上にマルチカラーファロイジンを使用してサンプル染色を配置します。そして、複数の蛍光シム画像をポイントステージ位置で生体較正基準画像として取得し、その後、超解決画像を再構築する。クロマニョンの最新のバイナリリリースをダウンロードするには、Webブラウザを使用してください。プログラムを抽出し、実行可能ファイルを便利な場所に置きます。クロストーク右フィールドまたはリファレンスボックスへの生物学的キャリブレーション参照のいずれかの参照ファイルをドラッグアンドドロップするか、参照ファイルをクリックしてファイルセレクタダイアログを開きます。Java 開発キットのインストールをプログラムから要求された場合は、[はい] を押してダウンロードしたページに移動します。次に、指示に従ってオペレーティングシステム用のJDKをダウンロードしてインストールします。抗体染色のターゲットファイルをターゲットボックスにドラッグアンドドロップします。出力イメージ形式を選択し、出力ファイル名の接尾部を指定します。高信号対ノイズ比のクロストークリファレンス画像用。ローカル位置合わせの選択肢リストから投影を選択し、60の最小ウィンドウサイズを使用します。複数の生物学的キャリブレーション参照画像の場合は、平均参照オプションをチェックし、ローカル位置合わせには[なし]を選択してから、[すべて実行]をクリックして測定を開始します。測定が正しく実行されたことを確認するには、参照画像を参照ボックスとターゲットボックスにドラッグアンドドロップします。次に、プログラムを実行し、画像が完全に重なっていることを確認します。広視野顕微鏡におけるクロマチックシフト補正は、クロストーク基準画像を用いて行うことができる。この画像は、単一のカメラを搭載した広視野顕微鏡で得られた。Dappyからの蛍光発光は、青、緑、赤のチャネルを補正するための基準として使用されました。クロマニョンとの位置合わせ後、クロマチックシフトと基準画像を補正しました。アライメントパラメータがクロマニョンによってターゲット画像に適用されたとき、DNAとアナフェーズブリッジは、エンベロープ内に予想通りに整列する前に、核エンベロープの外側に誤って見られます。3D sim画像のクロマティックシフト補正は、生体キャリブレーション基準画像を用いて行うことができる。青、緑、赤色の染料に結合したファロイジンで染色されたHeLa細胞の3D sim画像を3Dに撮影し、クロマチックシフトをクロマニョンで測定した。整列後、クロマチックシフトと参照画像を修正しました。配置パラメータがターゲットイメージに適用されました。XZ ビューは、Z 方向に沿って、X 方向に沿ってわずかに正しくないチャネル位置を示し、整列後に修正されました。最適なパフォーマンスを得るためには、ターゲットイメージと同じ条件とタイミングで参照画像を取得することが重要です。

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

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