Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

이 연구는 JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP19H03202에 의해 지원되었다. JP18H05528 및 JP17H03636 - T.H., JP17H01444 및 JP18H055333 @ L.Y.L.S.는 옥스포드에서 고급 이미징을 위한 웰컴 트러스트 전략상 091911 및 107457/Z/Z 펀딩의 지원을 인정합니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

색채 보정 절차는 정확성과 노력 사이의 절충입니다. 불필요한 노력을 절약하기 위해 연구에 얼마나 많은 정확도가 필요한지 아는 것이 좋습니다. 기존의 와이드 필드(live) 이미징에는 가장 높은 정확도가 필요하지 않을 수 있으므로 밝은 필드 참조 이미지는 종종 색의 변화를 교정하기에 충분합니다. 마찬가지로, 이미징 상태와 환경이 일정할 때 생물학적 교정을 반복적으로 사용하면 시간을 절약할 수 있습니다. 한편, 매우 정확한 등록이 필요한 경우 고품질의 크로스토크 또는 생물학적 교정 기준 이미지가 필요합니다. 최상의 성능을 위해 참조 이미지는 가능한 한 대상 이미지와 유사한 조건과 타이밍을 가져와야 합니다. 동일한 현미경 검사법에 의해 참조 및 표적 이미지를 모두 획득하는 한, 더 높은 공간 해상도는 보정 정확도를 향상시킵니다. 참조 및 대상 이미지 모두에 대한 deconvolution을 사용할 수 있는 경우 수정 전에 이를 구현하면 보정 정확도가 향상될 수 있습니다. 또한, 최상의 성능을 위해, 광학(Z) 축에 대한 샘플링 정리는 정확한 서브픽셀 보간(프로토콜 단계 2.1.3)을 위한 기준 및 대상 파일 모두에서 이루어져야 한다.
색변화 시프트를 수정하지 못하면 잘못된 결론이 발생합니다. 또한 잘못된 교정을 사용하면 수정보다는 색의 변화가 악화될 수 있으므로 이를 피해야 합니다. 표 2에서실패의 가능한 원인과 공통 해결 방안을 요약했습니다. 실패의 원인을 검사하기 위해, 처음에, 참조 이미지의 색채 변화가 정확하게 수정되었는지 여부를 시각적으로 확인할 필요가 있다(프로토콜 단계 3.12). 대부분의 오류는 참조 이미지의 품질에 기인하며 표 2의설명에 따라 쉽게 해결됩니다. 참조 이미지의 품질에 관해서는 전체 시야가 샘플로 채워지지 않으면 전역 정렬의 정확도가 저하된다는 점에 유의해야합니다(그림 7, 표 2). 도 7A에나타난 좋은 예와 비교하여 도 7B에 표시된 나쁜 예는 왼쪽 위 부위에 3개의 핵 봉투만 포함하고 있으며, 크로마뇽은 이 이미지의 일부를 정렬하지 못했다. 이는 크로마뇽의 글로벌 정렬 방식이 높은 정확도3로회전 및 배율의 차이를 측정하기 위해 시야를 4개 영역(도7C)으로분할하기 때문이다. 이 방법은 올바르게 작동하는 경우 로그 극지 변환 및 심플렉스 메서드3과같은 다른 선형 메서드보다 한 순서더 더 정확합니다. 네 개의 영역 중 어느 것을 사용할 수 없는 경우 Chromagnon은 덜 효과적인 선형 메서드로 전환됩니다. 따라서 최상의 성능을 위해 그림 7B 및 그림 7C에 표시된 예제는 바람직하지 않으며 네 영역은 개체로 채워야 합니다. 사용자는 로그 파일을 보고 측정할 수 없는 시야의 이차 영역이 있는지 확인할 수 있습니다("Chromagnon.log"; 프로토콜 단계 3.10 참조). 다행히도, 이 문제는 다중 생물학적 교정 이미지를 평균화하거나 크로스토크 또는 밝은 필드 참조이미지(표 2)에대한 로컬 정렬을 사용하여 쉽게 극복할 수 있다. 참조 이미지를 수정하지 못하는 경우와 달리 대상 이미지를 수정하지 못하는 경우를 식별하기가 더 어렵습니다. 이러한 오류는 파일 형식, 이미징 조건, 이미징 타이밍, 참조 및 대상 이미지 사이의 이미징/정렬방법(표 2)의차이로 인해 발생하므로 대상 이미지에서 다른 조건/타이밍에서 얻은 참조 이미지를 사용할 때 는 항상 주의해야 합니다. 일부 예제 이미지는 좋은 예 이미지의 구체적인 아이디어를 얻기 위해 테스트<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)에</a>사용할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>문제</td>
			<td>원인</td>
			<td>솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>참조 이미지를 수정하지 못했습니다.</td>
			<td>낮은 대비</td>
			<td>가능하면 더 높은 대비 이미지를 얻습니다. 밝은 필드 참조 이미지를 사용하는 경우 수성 솔루션에서 이미지를 다시 수집하여 셀의 더 높은 대비를 얻습니다. 또는 계산 노이즈 감소(예: 가우시안 필터링)를 적용해 보십시오. 노이즈에 더 민감한 로컬 정렬을 끕니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>관련없는 이미지의 오염</td>
			<td>가능한 경우 샘플에서 관련없는 이미지의 소스를 제거합니다. 크로스토크 참조 이미지의 경우 대상 이미지에 사용되는 염료의 여기 스펙트럼을 확인합니다. 염료가 크로스토크 이미지(예: 알렉사 플루서 568 또는 594)를 획득하는 동안 흥분되는 경우 다른 염료(예: 알렉사 플루어 555)를 고려하십시오. 카메라 칩의 먼지가 명백한 채널 차이를 생성하는 경우 카메라 칩을 청소하거나 계산 플랫 필딩 방법을 사용합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>우주 광선에 의해 만들어진 매우 밝은 자리</td>
			<td>가능하면 이미지를 다시 획득합니다. 또는 계산 노이즈 감소(예: 중앙값 또는 가우시안 필터링)를 적용해 보십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>절충 공유물(축 및 측면 가장자리의 인공 신호)</td>
			<td>감소 후 가장자리 픽셀 또는 Z 섹션을 다듬습니다. 한쪽이 트리밍되면 이미지 중심을 유지하려면 다른 쪽도 트리밍해야 합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Z 스텝 크기도 희소</td>
			<td>Z 스택 프로토콜 2.1.3에 기록 된 나이퀴스트 기준을 충족 하기 위해 취득 해야 합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>광학 수차</td>
			<td>구형 수차는 사용자에 의해 발생 하는 주요 수차. 시료에 적합한 객관적렌즈를 선택하고 170μm의 커버슬립 두께를 사용합니다. 객관적인 렌즈에 보정 링이 장착된 경우, 가장 높은 형광 수가 초점에서 얻어지는 위치를 찾기 위해 조정한다. 보정 링없이 오일 침지 목표의 경우, 초점에 형광 수를 증가 침지 오일의 굴절 지수를 조정합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>시야가 채워지지 않습니다(그림 7)</td>
			<td>생물학적 교정 참조 이미지의 경우, 평균 많은 이미지. 크로스토크 또는 밝은 필드 참조 이미지의 경우 로컬 정렬을 사용합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>확인되지 않은 소프트웨어 버그</td>
			<td>GitHub<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)를</a> 통해 문제를 보고하십시오.
</td>
		</tr>
<tr>
<td>대상 이미지를 수정하지 못했습니다.</td>
			<td>이미지 파일의 메타데이터가 손실되었습니다.</td>
			<td>전체 메타데이터가 포함된 원본 현미경 파일 형식을 사용하고 처리하기 전에 여러 페이지 의 tiff 파일로 변환하지 마십시오. 프로토콜 3.3에 기록된 것과 동일한 채널 순서를 사용합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>주어진 현미경 검사법에 대한 잘못된 정렬 방법</td>
			<td>생물학적 교정 참조 이미지에서 측정할 때 로컬 정렬 방법을 대상으로 하여 적용하지 마십시오. 와이드 필드 현미경 검사법 이외의 크로스토크 참조 이미지를 사용하지 마십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>이미징 조건의 차이</td>
			<td>프로토콜 2.3.3에 기록된 참조와 대상 이미지 사이에 이미징 조건을 일정하게 유지합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>샘플의 차이(커버슬립 포함)</td>
			<td>항상 동일한 장착 매체, 커버슬립(예: 1.5H) 및 유사한 초점 깊이를 사용합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>교정이 마지막으로 만들어진 이후 현미경 드리프트</td>
			<td>2주에 한 번씩 교정을 합니다. 온도를 일정하게 유지하고 부동 테이블을 사용하여 현미경의 하드웨어 드리프트를 방지합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 색조정을 위한 문제 해결.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> 그림 7: 참조 이미지의 예입니다. 핵분열 효모 세포의 핵 봉투는 GFP와 mCherry로 표시되어 있습니다. 이미지는 기존의 광시야 현미경으로 획득되었다. 색칠 변화는 이미지 자체를 참조 이미지로 사용하여 로컬 정렬없이 크로마뇽을 사용하여 수정되었습니다. 그런 다음 이미지가 장식되어 세부 사항을 표시했습니다. (A)시야에 많은 객체가 있는 좋은 예입니다. (B)왼쪽 상단 모서리에만 오브젝트가 있는 나쁜 예입니다. 이미지의 특정 영역에서 정렬 불량이 분명합니다. (C)사분면(점선으로 구분)중 하나가 비어 있는 바람직하지 않은 예. 패널 A의 스케일 바는 전체 시야에 대해 5 μm, 확대된 뷰의 경우 1.25 μm을 나타내며 모든 패널에 적용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 프로토콜에서는 세 가지 다른 참조유형(표 1)을설명했습니다. 그 중, 크로스 토크 참조 이미지와 생물학적 교정 참조 이미지는 더 신중한 논의가 필요합니다. 크로스토크 레퍼런스 이미지의 경우, DAPI 또는 Hoechst 33342로 염색된 샘플과 글리세롤 또는 상업용 마운팅 미디어에 장착된 샘플은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 효율적으로 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 알렉사 플루어(488)는 녹색 및 빨간색 채널을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DAPI와 Hoechst를 제외한 많은 파란색 염료가 대부분의 녹색 과 빨간색 염료보다 더 어둡고 부패하기 때문에 크로스 토크 형광을 얻는 것은 종종 어렵습니다. 또한 현대 염료의 배출 스펙트럼은 좁아이 방법에 의해 세 개 이상의 채널의 정렬을 어렵게 만듭니다. 주의는 또한 몇 가지 일반적인 빨간 염료에 지불 해야 한다 (예를 들어, 알렉사 밀가루 568 그리고 594, 하지만 알렉사 플루머 555) 보라색 빛에 의해 흥분 될 수 있는, 블루 염료에서 고대비 크로스 토크 이미지를 얻기 방지. 또 다른 단점은 이 방법이 다색 여기로 여기광경로의 색수차를 측정할 수 없다는 것이다.Table 1 대부분의 고급 현미경 검사는 변경된 조명 광학을 사용하므로 이 방법의 적용은 제한적입니다. 여전히 보정 정확도가 높을수록 이 프로토콜에 설명될 수 있을 만큼 충분히 유리합니다. 일반적으로, 크로스토크 이미지는 표백 또는 광독성 효과를 방지하기 위해 대상 이미지 후에 취해야 한다. 광시야 모드로 관찰된 SMLM의 경우, 이미징 하는 동안 형광 염료가 표백될 수 있기 때문에 대상 이미지를 획득하기 전에 기준 이미지를 획득해야 합니다.
생물학적 교정 참조 이미지를 통해 사용자는 추가 샘플 준비 비용을 절감하여 원하는 수의 채널을 쉽게 정렬할 수 있습니다. 생물학적 교정 참조 이미지의 또 다른 장점은 모든 시야를 채우는 데 도움이 되는 "평균화" 여러 참조의 가용성입니다. 이 방법은 교정 샘플이 다른 슬라이드에서 제조되는 경우 이미징 조건의 차이로 고통받을 수 있습니다. 이러한 문제의 대부분은 상용 챔버 커버글래스(표1)를사용하여 동일한 슬라이드에서 표적과 참조를 모두 제조하고 다른 이미징 조건이 프로토콜 단계 2.3.3에서와 같이 일정하게 유지되는 경우 해결할 수 있다. 이 경우, 크로스토크 참조 이미지와 유사한 보정 정확도를 기대할 수 있습니다3. 여기에 표시된 것과 같이 phalloidin을 사용하는 프로토콜은 여러 색상으로 단일 셀룰러 구조를 염색하는 가장 쉬운 방법 중 하나입니다. 생물학적 교정 샘플을 준비하는 시나리오는 여러 가지가 있습니다. 면역 염색을 위해, 견본은 다중 색깔의 이차 항체로 염색하는 뒤에 단 1차 항체로 표지될 수 있습니다. 이러한 방식으로 단일 대상 구조에 여러 색상으로 레이블을 지정할 수 있습니다. 대안적으로, 5-에티닐-2'-deoxyuridine, "클릭" 화학 라벨에 의해 검출된 고밀도에서 여러 색으로 DNA를 새로 합성, 자세히 설명 하 여8. 살아있는 세포의 경우, GFP 또는 mCherry에 융합된 유전자의 2개의 사본을 품고 있는 형질균균을 두 가지 색상으로 동일한 구조로 표시하는 것이 유용하다. 유전자의 카피 수가 종종 막 단백질에 대해 관찰되는 것만큼 중요하면, 유전자의 단일 사본은 GFP 및 mCherry(도7)에나란히 융합될 수 있다. mEOS218과같은 광변환형 형광 단백질은 광변환 유무에 관계없이 적당한 수준의 바이올렛 빛을 조명하여 사용할 수 있다. 낮은 산소 조건하에서, GFP는 또한 녹색에서 적색19,,20까지광변환단백질로 사용될 수 있다. 따라서 올바른 교정 샘플을 선택하면 실험이 더욱 견고해집니다.

다색 화상 진찰은 다른 분자 또는 구조물의 공간 관계가 중요한 관심사인 경우에, 생물학 형광 현미경 검사법의 근본적인 양상의 한개입니다. 탈색 수차, 분산으로 인한 다색 광의 광학 수차, 관심있는 색깔의 물체의 명백한 위치를 변경합니다. 마찬가지로, 각 색상을 획득하는 데 전념하는 여러 대의 카메라가 장착된 현미경은 광학 요소의 차이와 채널 간의 불완전한 정렬로 인해 더 복잡한 색채 변화가 있습니다. 따라서, 이러한 색소 변화는 사용자가 명시적으로 수정하지 않는 한 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 현미경 검사법의 해상도가 고전적인 해상도 제한에 의해 제한되는 한 색색 교대는 큰 문제가되지 않았지만, 최근 초해상도 현미경검사법 1의 개발은 색소 교대의 보다 정확한 교정의 필요성을 자극하고있다.
다색 비드 교정 슬라이드2를사용하여 현미경 시스템의 색변화 변화를 측정하는 것이 일반적인 관행이었다. 상기 비드 기반 교정 방법은 현미경의 전체 광학에서 커버슬립2의표면으로의 색색 이동을 측정하는 데 적합하다. 그러나 이 방법은 관심 있는 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정할 수 없습니다. 많은 생물학적 샘플이 3차원(3D)이며, 이러한 샘플의 색채 변화는 커버슬립 의 표면과 다르다는 점에 유의해야 한다. 더욱이, 색채 변화는 이미징 조건2,,3로변화한다. 우리는 3D 생물학적 샘플에서 색채 변화를 측정하고 색채 시프트의 불확실성이 종종 고전적인 멀티 컬러 비드 교정 방법에 의해 350 nm만큼이었다는 것을 발견했다3. 따라서, 색색 교대는 관심의 깊이와 사용되는 이미징 조건하에서 생물학적 샘플에서 측정될 필요가 있다.
여기에서, 우리는 생물학 견본에 있는 색채 교대를 측정하고 우리의 소프트웨어, Chromagnon3를사용하여 이 교대를 정정하는 절차를 기술합니다. 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정하기 위해 당사의 방법은 두 가지 종류의 데이터 세트, "대상" 이미지 및 "참조" 이미지를 사용합니다. "대상" 이미지는 DNA, 핵 봉투 및 마이크로투블러에 얼룩진 이미지와 같은 여러 가지 관심 이미지입니다. 이러한 이미지에서 색채 의 변화를 측정하는 것은 종종 불가능합니다. 따라서 샘플의 색채 변화를 측정하기 위해 전념하는 "참조" 이미지가 필요합니다. "참조" 이미지의 유일한 정의는 동일한 개체의 다중 색상 이미지입니다. 이러한 의미에서 멀티 컬러 비즈 이미지는 참조 이미지의 유형이기도 합니다. 여기서는 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정하는 데 사용되는 세 가지 유형의 참조 이미지를 설명합니다: "크로스토크 참조 이미지", "밝은 필드 참조 이미지" 및 "생물학적 교정 참조 이미지". 참조 이미지의 유형은 사용되는 현미경의 유형 또는 표 1에요약된 데 필요한 보정 정확도에 따라 달라집니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>누화</td>
			<td>밝은 필드</td>
			<td>생물학적 교정(다른 슬라이드에서)</td>
			<td>생물학적 교정(동일한 슬라이드)</td>
		</tr>
<tr>
<td>정확도는
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>단순</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>해당 현미경 검사법</td>
			<td>와이드 필드</td>
			<td>와이드 필드</td>
			<td>모든</td>
			<td>모든</td>
		</tr>
<tr>
<td>로컬 정렬 가용성</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: "+"의 수는 증가 등급을 나타냅니다. 싱글 플러스는 약 50 nm이며 3 플러스는 3D에서 약 15 nm입니다. b: 정확도는 가변 이미징 조건이 일정하게 유지되는 정도에 따라 달라집니다. c: 다색 비드 샘플에 의해 측정된 국소 교정은 프로토콜 섹션 4에 설명된 바와 같이 결합될 수 있다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 참조 이미지 유형을 선택할 때 매개 변수입니다.
"크로스토크 기준 이미지"는 보정 정확도가 가장 높으며3,,4(표 1)를달성하기가 비교적 간단합니다. 단점은 여기 경로에서 색채 변화를 측정할 수 없습니다 인해 현미경 응용 프로그램에서의 한계입니다. 또한, 이러한 이미지를 얻기 위해 현미경에는 다단제 이색 거울, 그리고 흡개 필터 또는 광원으로부터 독립적으로 제어되는 방출 필터가 장착되어있어야 한다. 적합한 현미경 검사법은 광활성 국소 광학 현미경/스토카즘 광학 재건 현미경 검사법(PALM/STORM)5,6 및 확장 현미경 검사법7과 같은 기존의 광야 현미경 검사법, 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)을 포함한다., 크로스토크 참조 이미지는 대상 샘플 자체에서 획득됩니다. 모든 필수 채널에서 얻은 염료의 크로스토크(출혈-스루) 형광의 이미지입니다. 형광 방출은 항상 더 긴 파장을 향해 확장, 따라서 가장 짧은 방출 파장을 가진 염료는 더 긴 파장의 채널에서 크로스 토크 형광을 얻기 위해 흥분된다. 예를 들어, 시료가 파란색, 녹색 및 빨간색으로 염색되면 파란색 염료만 흥분되고 방출 광만 파란색, 녹색 및 빨간색 채널에서 가져옵니다. 이 프로토콜에서, DNA는 4′,6-diamidino-2-페닐린돌 (DAPI)로 염색된 크로스토크 형광을 얻기 위하여 이용되었습니다.
"밝은 필드 참조 이미지"는 "크로스 토크 참조 이미지"에 대한 더 쉽고 적은 광독성 대안이지만 가장 정확한3 (표1)입니다. 대상 이미지에 사용되는 모든 색상 채널에서 획득한 대상 샘플의 밝은 필드 이미지입니다.
"생물학적 교정 기준 이미지"는 각심 및 방출 경로3,,8 (표 1)에서모두 색색 이동을 측정하는 능력으로 인해 모든 유형의 현미경 검사법에 적용될 수 있다는 장점이 있다. 적합한 현미경 검사법은 넓은 필드 현미경 검사법, 공초점 현미경 검사법, 광시트 현미경 검사법, 자극 방출 고갈 (STED)9,구조화 된 조명 현미경 검사법 (SIM)10,Airyscan /SORA11,,12,SMLM이 총 내부 반사 형광 (TIRF) 모드, Olympus 해상도로 관찰된13가지 표면 현미경 검사법을 포함한다. 생물학적 교정 기준 이미지는 표적 샘플로 유사하게 제조된 교정 샘플에서 획득되지만, 여러 색으로 단일 구조의 염색을 한다. 교정 정확도는 대부분의 초해상도 현미경 검사법의 해상도를 우수하며 생물학적 교정 샘플을 준비하는 것은 비교적 간단할 수 있습니다. 또 다른 장점은 여러 참조 이미지를 "평균"으로 사용할 수 있다는 것입니다. 따라서 개별 이미지에 색채 이동 측정에 대한 정보가 불량하더라도 여러 이미지를 평균화하여 정보 콘텐츠를 늘릴 수 있습니다. 정확도는 이미징 조건이 일정하게 유지되는 양에 따라 달라집니다. 이와 관련하여, 대상 및 기준 샘플이 동일한 슬라이드에 있을 때 최상의 성능을 얻을 수 있으며, 예를 들어, 8웰 챔버 커버글래스(표1,오른쪽 대부분)를 사용한다. 이 프로토콜에서, 판로이드의 3색으로 염색된 액틴은 생물학적 교정으로 사용되었다.
참조 이미지를 얻으면 소프트웨어 크로마뇽에의해 색채 이동을 측정하고 수정합니다. 크로마뇽이 색채 이동을 측정하고 수정할 수 있는 채널, Z 섹션 및 시간 프레임의 수에는 제한이 없습니다. 크로마뇽은 두 단계로 색채 의 변화를 측정합니다. 첫 번째 단계는 X, Y, Z 축, X, Y, Z 축을 따라 배율 및 Z 축 주위의 회전에서 번역의 "전역" 또는 "affine" 정렬 매개 변수를 획득합니다. 글로벌 정렬의 계산 정확도는 ~16 nm3D및 ~8nm2D이다. 두 번째 단계는 더 높은 정확도를 얻기 위해 투영 된 이미지에 대한 선택적 2D 반복적 인 "로컬 정렬"입니다. 로컬 정렬 프로세스에서 이미지는 여러 영역으로 세분화되고 이러한 로컬 영역의 색도 변화가 측정됩니다. 이어서, 영역은 더 나누어지고 하위 영역의 색채 이동이 영역의 픽셀 수가 최소 픽셀 수(일반적으로 60 x 60 픽셀)에 도달할 때까지 반복적으로 측정됩니다. 결과 로컬 정렬 맵은 전역 정렬 매개 변수와 결합되며 탄성 변환에 의해 대상 이미지에 적용됩니다. 이 단계에 이어, 계산 정확도는 3D에서 ~14nm, 2D에서 ~6nm로 향상된다. 국소 정렬은 생물학적 교정 기준 이미지에 적합하지 않은데, 이는 기준내의 생물학적 구조가 표적내와 다르기때문이다(표 1). 따라서 생물학적 교정 참조 이미지에는 전역 정렬만 사용됩니다.
로컬 색소 변화는 두 가지 소스에서 비롯됩니다. 현미경 기악국 왜곡 및 생물학적 구조적 불동성. 현미경 기악국 왜곡은 일정하기 때문에, 이것은 다색 구슬 참조 샘플에서 측정하고 고정 파라미터로 수정될 수 있다. 크로마뇽은 생물학적교정(표 1)으로부터현미경 기악국 왜곡 맵 및 글로벌 정렬 파라미터를 결합할 수 있다. 이 방법을 이용하여, 생물학적 교정의 평균 정확도는 추가 1-2 nm에 의해 향상될 것으로 예상된다.
여기서는 가장 쉬운 로우 엔드에서 최고 정확도에 이르기까지 소프트웨어 크로마뇽을사용하여 3D 형광 이미지의 색변화를 수정하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 예를 들어 HeLa 세포의 면역 염색을 사용하고 3D 광필드 현미경 검사법과 3D-SIM을 사용하여 관찰했습니다. 첫 번째 섹션에서는 표적 샘플 및 생물학적 교정 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 이 부분은 연구의 특정 목표에 최적화되어야 합니다. 두 번째 섹션에서는 현미경으로 3가지 종류의 참조 이미지에 대한 획득 방법을 설명합니다. 가정은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 얻는 것이었지만 채널 조성은 연구의 특정 목표와 현미경의 설정에 의해 수정되어야합니다. 현미경에 단일 카메라 또는 여러 카메라가 장착되어 있는지 여부는 중요하지 않습니다. 세 번째 섹션에서는 참조 이미지를 사용하여 대상 이미지의 색색 변화를 측정하고 수정하기 위해 소프트웨어를 사용하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 네 번째 섹션에서는 현미경의 기악국 보정을 사용하여 생물학적 교정 기준 이미지를 보완하는 방법을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

정량적 다색 형광 현미경 검사는 서로 다른 파장에서 획득 한 색상 채널의 신중한 공간 일치에 의존합니다. 색수차와 카메라의 불완전한 정렬로 인해 각 채널에서 획득한 이미지가 이동하고 확대될 수 있을 뿐만 아니라 3차원 중 어느 한 쪽에서 서로 에 대해 회전할 수 있습니다. 고전적인 교정 방법을 사용하면 색소 시프트는 커버슬립 표면에 부착된 다색 구슬에 의해 측정되며, 이러한 교정 샘플에서 색채 의 변화를 측정할 수 있는 다수의 소프트웨어가 사용된다. 그러나, 색수차는 깊이에 따라 다를 수 있고, 관찰 조건에 따라 변화하며 생물학적 샘플 자체에 의해 유도될 수 있으므로, 따라서 관심 있는 시료및 부피 전반에 걸쳐 색채 변동의 실제 양에 대한 결정을 방해할 수 있다. 정확도가 높은 색채 시프트를 교정하는 것은 약간의 색채 시프트만이 정량적 분석에 영향을 미치고 다색 이미지의 해석을 바꿀 수 있는 초해상도 현미경 검사법과 특히 관련이 있습니다. 우리는 생물학적 샘플의 3D 색색 변화를 측정하고 수정하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 크로마뇽및 동반 방법을 개발했습니다. 여기서는 생물학적 시료의 색채 변화를 측정하기 위한 샘플 준비, 데이터 수집 및 소프트웨어 처리를 위한 특별한 요구 사항을 포함하는 상세한 응용 프로토콜을 제공합니다.

크로스토크 참조 이미지를 이용한 색변식 보정의 예가 도 5에도시된다. 이 이미지는 단일 카메라가 장착된 넓은 시야 현미경으로 얻어졌습니다. DAPI로부터의 형광 방출은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 보정하기 위해참조(도 5A,B)로사용되었다. 이미지는 각각 256 x 256 픽셀로 구성된 60 Z 슬라이스의 3 채널로 구성됩니다. 이미지는 색색 시프트를 측정하기 전에 장식되었습니다. 크로마뇽을 사용하여 로컬 색조 변화를 측정하는 것은 인텔 코어 i7 (쿼드 코어, 8 스레드, 2.7 GHz), 16 GB RAM 및 1 TB 플래시 스토리지와 맥에 51 s했다. 정렬 매개 변수는 기준 이미지와 정확히 동일한 수의 복셀을 가지고 있는 대상이미지(도 5C,D)에적용되었다. 정렬된 파일을 준비하는 데 3s가 걸렸습니다. 정렬 프로세스(도 1C의자르기 개수 확인란)에서 가장자리 픽셀을 트리밍한 결과 정렬 후 복셀 수가 감소하였다(그림5B,51 Z 슬라이스, 252 x 251 픽셀). 상반신 교량(화살표헤드로 표시된)의 DNA는 정렬 전 핵 봉투 의 외부에서 잘못 볼 수있지만(그림 5C,XZ 뷰를 나타내는 하단 패널에서 명백함), 그러나 정렬 후 봉투 내부에서 예상되는 바와 같이(도5D).
생물학적 교정 기준 영상을 이용한 색소시 변속 보정의 예가 도 6에도시된다. 이미지는 세 대의 카메라가 장착된 SIM 현미경으로 얻어졌습니다. 파랑, 녹색, 빨간색 염료에 컨쥬게이트된 플라로이드인으로 염색된 HeLa 세포의 3개의 이미지는 평균하였다(그림6A). 참조 이미지는 각각 1,024 x 1,024 픽셀로 구성된 76 Z 슬라이스의 3 채널로 구성됩니다. 로컬 정렬없이 크로마뇽을 사용하여 색조정체를 측정하려면 위에서 설명한 Mac 시스템에서 194s가 필요했습니다. 매개 변수는 각각 1,024 x 1,024 픽셀로 구성된 73 Z 슬라이스의 3 채널로 구성된 대상 이미지에 적용되었습니다. 정렬된 파일의 생성은 25s를 차지했습니다. XZ 뷰는 Z를 따라 잘못된 채널 위치를 나타내고 X방향(그림 6A,C)을약간 따라 표시하지만 이 잘못된 등록은 정렬 후 수정되었습니다(그림6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> 그림 5: 크로스토크 참조 이미지와 정렬의 예입니다. HeLa 세포는 DNA를 위한 DAPI(마젠타에 도시됨), 핵 봉투에 대한 알렉사 플루소 488(노란색으로 표시됨), 미생물에 대한 알렉사 플루어 555(파란색으로 표시됨)로 염색하였다. 이미지는 단일 카메라와 3D 와이드 필드 현미경 검사법에 의해 획득하고 deconvolved. (A,B) 크로마뇽에의한 정렬 전후DAPI 방출을 이용한 대표적인 크로스토크 기준 이미지. 세 가지 색상 채널이 오버레이로 표시됩니다. (C,D) 정렬 전후세 채널에서 3D 스택의 광학 섹션입니다. 축 색 수차는 화살촉에 의해 표시된 무상 다리에서 명백합니다. 패널 A의 배율 막대는 모든 패널에 대해 5 μm을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> 그림 6: 생물학적 교정 기준 이미지와 의 일치의 예 3대의 카메라가 장착된 3D-SIM을 통해 이미지를 획득했습니다. (A,B) 참조 이미지는(A)및 이후(B)정렬 전에 세 가지 이미지에서 평균. HeLa 세포는 알렉사 플루어 405, 488 또는 594와 결합된 판로이드진으로 염색되었다. (C,D) 대상 이미지 전(C)및 이후(D)정렬. HeLa 세포는 DNA를 위한 DAPI(마젠타에 도시됨), 핵 봉투에 대한 알렉사 플루소 488(노란색으로 표시됨), 미생물용 알렉사 플루어 594(파란색으로 표시됨)로 염색하였다. 패널 A의 배율 막대는 모든 패널에 대해 5 μm을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

3차원(3D) 다색 형광 현미경 이미지의 색채 이동 보정은 정량적 데이터 분석에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 적절한 참조 이미지의 획득 및 오픈 소스 소프트웨어, 크로마그논과의처리를 통해 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정하고 교정하기 위해 개발되었습니다.

크로마뇽을 이용한 초분해능 생물학적 이미징 시대의 3D 색채 시프트의 고정밀 교정

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

습지 산호 현미경 이미지는 3 차원의 색채 변화를 포함합니다. 이는 고해상도 이미지의 공동 지역화 분석을 손상시합니다. 생물학적 시료 자체에서 유래한 색채 시프트를 제거하는 것은 일반적으로 어렵고, 우리의 방법은 별도로 획득한 참조 이미지를 사용하여 생물학적 샘플의 색채 변화를 교정할 수 있다.절차를 시연하는 것은 우리 그룹의 기술자 인 다카코 쿠진 (Takako Koujin)이 될 것입니다. 35mm 유리 바닥 접시에 5 번째 치료세포에 2.5배 10번 을 파종하고 이산화탄소 인큐베이터에서 재배하는 것으로 시작합니다. 24시간 동안 배양 한 후 PBS에서 3.7 %의 포름알데히드의 2 밀리리터로 배지를 대체하고 부드럽게 섞습니다.회전 하는 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 판매를 수정 합니다. 5~10분 동안 PBS 2밀리리터로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 2밀리리터 포인트 1%로 페메아빌라이즈를 PBS에서 다음 100을 시도하고 PBS로 세차스를 반복합니다.그런 다음 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 표준 항체 염색 프로토콜을 사용하여 세포를 염색한다. 와이드필드 현미경 검사법에 대한 크로스토크 참조의 기준 이미지를 얻으려면 밀리리터 Dappy당 포인트 5 마이크로그램의 2밀리리터를 추가하여 DNA에 머무르게 됩니다. 셀을 회전 플랫폼에 30분 동안 둡니다.그런 다음 용액을 장착 매체의 100 마이크로리터로 대체하여 공초점 및 초분해능 현미경 검사를 포함한 모든 종류의 현미경 검사법에 대한 생물학적 교정 참조의 기준 영상을 얻을 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 세포를 고정하고, 메타놀의 1.5 밀리리터에서 형광염염모접합판 몰로이드를 스톡 용액을 준비한다. 알렉사 층 405 1 ~ 1000 알렉사 층 488에 대한 1 ~ 1000및 알렉사 층 594에 대한 1 ~ 200의 희석에서 PBS에 팔로이드를 추가합니다.용액 1밀리리터를 세포에 추가하고 회전하는 동안 30분 동안 배양합니다. PBS의 2 밀리리터로 세포를 3~5회 세척합니다. 그런 다음 PBS를 장착 매체의 100 마이크로리터로 교체합니다.와이드필드 현미경을 사용하여 형광 영상을 획득하려면 이미징 소프트웨어의 현미경에 대상 샘플을 배치하고, 설계 및 실행 실험 창을 열고, 적절한 Z 단계를 설정하고 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 선택합니다. 실행 탭에서 이미지 파일 이름을 추가하고 이미징을 시작합니다. 샘플에서 색채 시프트를 측정하기 위한 크로스토크 참조 이미지를 획득하려면 Dappy에 대해서만 여기 광을 선택하고 대상 샘플과 동일한 스테이지 위치와 Z 높이를 사용해야 합니다.대안적으로, 밝은 필드 영상을 넓은 필드 현미경상에 있는 표적 시료에 대한 기준장소로 사용하고, 청색, 녹색 및 빨간색 채널에서 대상의 형광 영상을 획득한다. 그런 다음 대상의 밝은 필드 이미지를 정확히 동일한 스테이지 위치에서 동일한 Z 높이로 사용하여 파란색, 녹색 및 빨간색 채널로 수집합니다. 3D Sim과 같은 초해상도 현미경을 사용하여 형광 영상을 획득하기 위해 표적 샘플을 현미경에 배치하고 대상의 형광 시뮬레이션 이미지를 파란색, 녹색 및 빨간색 채널로 획득한다.그런 다음 슈퍼 해결된 이미지를 재구성합니다. 다음으로 3D sim 현미경에 멀티 컬러 팔로이드를 가진 샘플 얼룩을 놓습니다. 그리고 포인트 스테이지 위치에서 생물학적 교정 기준 이미지로서 다중 형광 시뮬레이션 이미지를 획득한 다음 슈퍼 해결 된 이미지를 재구성합니다.웹 브라우저를 사용하여 Chromagnon의 최신 바이너리 릴리스를 다운로드합니다. 프로그램을 추출하고 실행 파일을 편리한 위치에 넣습니다. 크로스토크 오른쪽 필드 또는 생물학적 교정 참조의 참조 파일을 드래그 앤 드롭하여 참조 상자에 놓거나 참조 파일을 클릭하여 파일 선택자 대화 상자를 엽니다.프로그램이 Java 개발 키트를 설치하도록 요청하는 경우 예(예)를 누르고 다운로드한 페이지로 이동합니다. 그런 다음 지시에 따라 운영 체제에 대한 JDK를 다운로드하여 설치합니다. 대상 상자에 염색하는 항체의 대상 파일을 드래그하고 놓습니다.출력 이미지 형식을 선택하고 출력 파일 이름에 대한 접미사를 지정합니다. 신호 대 노이즈 비율이 높은 크로스토크 참조 이미지의 경우. 로컬 정렬 선택 목록에서 프로젝션을 선택하고 최소 창 크기 60을 사용합니다.여러 생물학적 교정 참조 이미지의 경우 평균 참조 옵션을 확인하고 로컬 정렬을 위해 없음을 선택한 다음 모든 실행을 클릭하여 측정을 시작합니다. 측정이 올바르게 수행되었는지 확인하려면 참조 이미지를 참조 상자 및 대상 상자에 드래그앤드롭합니다. 그런 다음 프로그램을 실행하고 이미지가 완벽하게 겹쳐 있는지 확인합니다.와이드필드 현미경 검사법의 색소시 보정은 크로스토크 참조 영상을 사용하여 수행될 수 있다. 이 이미지는 단일 카메라가 장착된 와이드필드 현미경으로 얻어졌습니다. Dappy에서 형광 방출은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 수정하는 참조로 사용되었습니다.크로마뇽과 정렬한 후 색채 시프트와 참조 이미지가 수정되었습니다. 정렬 파라미터가 크로마그논에 의해 표적 이미지에 적용되었을 때 DNA와 해부학 교량은 응고 내부에 예상대로 나타나기 전에 핵 봉투 외부에서 잘못 볼 수 있다. 3D SIM 이미지의 색채 시프트 보정은 생물학적 교정 참조 영상을 사용하여 수행될 수 있다.파랑, 녹색, 빨간색 염료로 컨쥬게이트된 플라로이드인으로 얼룩진 HeLa 세포의 3D 심 이미지는 수렴되었고 크로마코노논에 의해 크로매틱 시프트를 측정하였다. 정렬 후 색채 시프트와 참조 이미지가 수정되었습니다. 정렬 매개 변수가 대상 이미지에 적용되었습니다.XZ 뷰는 Z를 따라 잘못된 채널 위치를 표시하고 정렬 후 수정된 X 방향을 약간 따라 약간 표시됩니다. 최상의 성능을 위해 동일한 조건과 대상 이미지와 같은 타이밍에서 참조 이미지를 얻는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

연구

생물학

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...