Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 a.M., JP18H05528 e JP17H03636 a T.H., e JP17H01444 e JP18H05533 para H.Y. L.S. reconhece o apoio do Welcome Trust Strategic Awards 091911 e 107457/Z/15/Z de financiamento avançado de imagem na Micron Oxford.

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	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O procedimento para correção cromática é uma troca entre precisão e esforço. Para salvar esforços desnecessários, é melhor saber quanta precisão é necessária para o seu estudo. A maior precisão pode não ser necessária para imagens convencionais de campo largo (ao vivo) e, portanto, imagens de referência de campo brilhante são muitas vezes suficientes para corrigir a mudança cromática. Da mesma forma, quando a condição de imagem e o ambiente são constantes, o uso repetido de uma calibração biológica economizará tempo. Por outro lado, se um registro altamente preciso for desejado, imagens de referência de cruzamento de alta qualidade ou de calibração biológica são necessárias. Para o melhor desempenho, as imagens de referência devem ser obtidas com condições e tempos semelhantes quanto possível. Enquanto as imagens de referência e de destino forem obtidas pela mesma microscopia, uma maior resolução espacial melhorará a precisão de correção. Se a desconvolução estiver disponível para imagens de referência e destino, então implementá-lo antes da correção pode melhorar a precisão de correção. Além disso, para o melhor desempenho, o teorema amostral do eixo óptico (Z) deve ser cumprido tanto na referência quanto no arquivo de destino para interpolação de subpixel preciso (etapa de protocolo 2.1.3).
A não correção da mudança cromática leva a conclusões incorretas. Além disso, o uso da calibração errada pode até piorar as mudanças cromáticas em vez de corrigi-las, e isso, portanto, precisa ser evitado. Resumimos as possíveis causas de falhas e suas soluções comuns, na Tabela 2. Para examinar a causa de uma falha, em primeiro lugar, é necessário verificar visualmente se a mudança cromática na imagem de referência está precisamente corrigida (protocolo passo 3.12). A maioria das falhas se deve à qualidade das imagens de referência e são facilmente corrigidas de acordo com as descrições na Tabela 2. Quanto à qualidade das imagens de referência, é importante notar que a precisão do alinhamento global diminui se todo o campo de visão não estiver preenchido com a amostra (Figura 7, Tabela 2). Comparado com o bom exemplo mostrado na Figura 7A,o mau exemplo mostrado na Figura 7B contém apenas três envelopes nucleares na região superior esquerda, e Chromagnon não conseguiu alinhar uma parte desta imagem. Isso porque o método de alinhamento global do Chromagnon divide o campo de visão em quatro regiões (Figura 7C) a fim de medir as diferenças de rotação e ampliação com alta precisão3. Este método, se operado corretamente, é uma ordem mais precisa do que outros métodos lineares, como a transformação polar de tronco e os métodos simplex3. Se alguma das quatro regiões não estiver disponível, então Chromagnon mudará para métodos lineares menos eficazes. Portanto, para o melhor desempenho, os exemplos mostrados na Figura 7B e Figura 7C são indesejáveis, e as quatro regiões devem ser preenchidas com objetos. Os usuários podem verificar se alguma região quadrática do campo de exibição não está disponível para medição olhando para o arquivo de registro ("Chromagnon.log"; veja o protocolo passo 3.10). Felizmente, esse problema pode ser facilmente superado pela média de múltiplas imagens de calibração biológica ou usando alinhamento local para imagens de referência de crosstalk ou campo brilhante(Tabela 2). Ao contrário do caso de falha na correta de imagens de referência, a falha na correção das imagens de destino é mais difícil de identificar. Como tais falhas surgem devido a diferenças nos formatos de arquivo, condições de imagem, tempos de imagem, métodos de imagem/alinhamento entre as imagens de referência e destino(Tabela 2),os usuários devem sempre ter cuidado ao usar imagens de referência obtidas em diferentes condições/tempos das imagens-alvo. Algumas imagens de exemplo estão disponíveis para testes (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>) para obter uma ideia concreta das imagens de bom e mau exemplo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema</td>
			<td>Causa</td>
			<td>Solução</td>
		</tr>
<tr>
<td>Falha ao corrigir a imagem de referência</td>
			<td>Baixo contraste</td>
			<td>Adquira uma imagem de contraste maior, se possível. Se uma imagem de referência de campo brilhante for usada, readquiri a imagem em uma solução baseada em água para obter maior contraste da célula. Alternativamente, tente aplicar redução de ruído computacional (por exemplo, filtragem gaussiana). Desligue o alinhamento local, que é mais sensível ao ruído.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Contaminação de imagens não relacionadas</td>
			<td>Remova a fonte das imagens não relacionadas na amostra, se possível. Para obter imagens de referência de crosstalk, verifique os espectros de excitação dos corantes usados para as imagens-alvo. Se os corantes estiverem animados durante a aquisição de uma imagem crosstalk (por exemplo, Alexa Fluor 568 ou 594), considere outros corantes (por exemplo, Alexa Fluor 555). Se o pó no chip da câmera criar uma diferença óbvia de canal, limpe o chip da câmera ou use um método computacional de campo plano.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Um ponto extremamente brilhante feito por um raio cósmico</td>
			<td>Adquira a imagem novamente, se possível. Alternativamente, tente aplicar redução de ruído computacional (por exemplo, filtragem mediana ou gaussiana).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Artefatos de desconvolução (sinais artificiais nas bordas axial e lateral)</td>
			<td>Corte os pixels de borda ou seções Z após a desconvolução. Se um lado for aparado, o outro lado também deve ser aparado para manter o centro de imagem.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>O tamanho do passo Z muito esparso</td>
			<td>Uma pilha Z deve ser adquirida para cumprir o critério nyquist, conforme escrito no protocolo 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Aberração óptica</td>
			<td>A aberração esférica é a maior aberração causada pelos usuários. Escolha a lente objetiva certa para a amostra e use uma espessura de deslizamento de tampa de 170 μm. Se a lente objetiva estiver equipada com um anel de correção, ajuste-a para encontrar a posição onde a maior contagem de fluorescência é obtida a partir do foco. No caso de um objetivo de imersão em óleo sem um anel de correção, ajuste o índice de refração do óleo de imersão que aumenta a contagem de fluorescência no foco.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>O campo de visão não é preenchido (Fig. 7)</td>
			<td>No caso de imagens de referência de calibração biológica, em média muitas imagens. No caso de imagens de referência de crosstalk ou de campo brilhante, use o alinhamento local.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Um bug de software não identificado</td>
			<td>Informe o problema através do GitHub (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Falha ao corrigir a imagem de destino</td>
			<td>Metadados do arquivo de imagem são perdidos</td>
			<td>Use o formato original do arquivo do microscópio que contém metadados completos e evite converter-se em um arquivo de tiff de várias páginas antes de processar. Use o mesmo pedido de canais escrito no protocolo 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Métodos de alinhamento errados para a microscopia dada</td>
			<td>Não aplique o método de alinhamento local ao medir de imagens de referência de calibração biológica para imagens-alvo. Não use imagens de referência crosstalk além de microscopia de campo largo.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Diferenças nas condições de imagem</td>
			<td>Mantenha as condições de imagem constantes entre a referência e as imagens de destino conforme escrito no protocolo 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Diferenças na amostra (incluindo deslizamento de cobertura)</td>
			<td>Use sempre o mesmo meio de montagem, deslizamento de tampa (por exemplo, nº 1,5H) e uma profundidade de foco semelhante.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Microscópio deriva desde que a calibração foi feita pela última vez</td>
			<td>Faça uma calibração tão frequentemente quanto a cada duas semanas. Mantenha a temperatura constante e use uma mesa flutuante para evitar a deriva do hardware do microscópio.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Solução de problemas para correção cromática.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> Figura 7: Exemplos de imagens de referência. Envelope nuclear em células de levedura de fissão rotuladas com GFP e mCherry. As imagens foram adquiridas com microscopia convencional de campo largo. As mudanças cromáticas foram corrigidas usando Chromagnon sem alinhamento local usando as próprias imagens como imagens de referência. As imagens foram então desconvolved para mostrar os detalhes. (A) Um bom exemplo com muitos objetos no campo de visão. (B) Um mau exemplo com objetos apenas no canto superior esquerdo. O desalinhamento é óbvio em uma determinada região da imagem. (C) Um exemplo indesejável onde uma das quadrisseções (separadas por linhas cruzadas pontilhadas) está vazia. A barra de escala no painel A indica 5 μm para a visão completa do campo e 1,25 μm para a visão ampliada e é aplicável a todos os painéis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Neste protocolo, descrevemos três tipos de referência diferentes(Tabela 1). Entre elas, imagens de referência de crosstalk e imagens de referência de calibração biológica precisam de uma discussão mais cuidadosa. Para imagens de referência de crosstalk, amostras manchadas com DAPI ou Hoechst 33342, e montadas em glicerol ou mídia de montagem comercial podem ser usadas eficientemente para alinhar os canais azul, verde e vermelho. Da mesma forma, o Alexa Fluor 488 pode ser usado para alinhar os canais verde e vermelho. No entanto, obter fluorescência de crosstalk é muitas vezes difícil, uma vez que muitos corantes azuis, exceto DAPI e Hoechst são mais fracos e decadência mais rápido do que a maioria dos corantes verdes e vermelhos. Além disso, os espectros de emissões de corantes modernos são mais estreitos, o que torna o alinhamento de mais de três canais por esse método desafiador. Atenção também deve ser dada a alguns corantes vermelhos comuns (por exemplo, Alexa Flour 568 e 594, mas não Alexa Fluor 555) que podem ser animados pela luz violeta, que impedem a obtenção de imagens de crosstalk de alto contraste de corantes azuis. Outra desvantagem é que este método não pode medir a aberração cromática dos caminhos de luz de excitação na excitação multicolorida, pois apenas um único comprimento de onda de excitação é usado para excitação(Tabela 1). Como a microscopia mais avançada usa óptica de iluminação alterada, a aplicação deste método é limitada. Ainda assim, sua maior precisão de correção é suficientemente vantajosa para que seja descrita neste protocolo. Em geral, uma imagem de crosstalk deve ser tirada após uma imagem de destino para evitar efeitos branqueamento ou fototóxicos. Para o SMLM observado com o modo de campo largo, uma imagem de referência deve ser adquirida antes de adquirir uma imagem alvo, pois os corantes de fluorescência podem ser branqueados durante a imagem.
As imagens de referência de calibração biológica permitem que os usuários alinhem facilmente qualquer número desejado de canais ao custo de preparação adicional da amostra. Outra vantagem das imagens de referência de calibração biológica é a disponibilidade de "média" de múltiplas referências que ajudam a preencher todos os campos de visão. Este método pode sofrer de diferenças nas condições de imagem se a amostra de calibração for preparada em um slide diferente. A maior parte desse problema pode ser resolvida se ambos os alvos e referências forem preparados no mesmo slide usando óculos de cobertura de câmara comercial(Tabela 1),e outras condições de imagem são mantidas constantes como na etapa 2.3.3 do protocolo. Neste caso, uma precisão de correção semelhante à das imagens de referência crosstalk pode ser esperada3. O protocolo para usar a faloidina como mostrado aqui é uma das maneiras mais fáceis de manchar uma única estrutura celular com múltiplas cores. Existem inúmeros cenários possíveis para preparar amostras de calibração biológica. Para imunostaining, uma amostra pode ser rotulada com um único anticorpo primário seguido de coloração com anticorpos secundários de múltiplas cores. Desta forma, uma única estrutura de destino pode ser rotulada com múltiplas cores. Alternativamente, 5-ethynyl-2'-deoxyuridina, detectado por "clique" rótulos de química recém-sintetizados DNA em múltiplas cores em alta densidade, como descrito em detalhes anteriormente8. Para células vivas, é útil preparar uma cepa transgênica abrigando duas cópias de um gene que são fundidas a GFP ou mCherry para rotular a mesma estrutura com duas cores. Se o número de cópia do gene for crítico como frequentemente observado para proteínas de membrana, uma única cópia do gene pode ser fundida em conjunto com GFP e mCherry(Figura 7). Proteínas fluorescentes fotoconvertíveis, como o mEOS218,também podem ser usadas iluminando um nível moderado de luz violeta para obter ambas as espécies proteicas com ou sem fotoconversão. Em baixas condições de oxigênio, o GFP também pode ser usado como uma proteína fotoconvertível de verde a vermelho19,20. A escolha da amostra de calibração certa tornará o experimento mais robusto.

A imagem multicolorida é um dos aspectos fundamentais da microscopia de fluorescência biológica, nos casos em que a relação espacial de diferentes moléculas ou estruturas é de grande interesse. Aberração cromática, uma aberração óptica de luz policromática causada pela dispersão, muda a posição aparente dos objetos coloridos de interesse. Da mesma forma, microscópios equipados com múltiplas câmeras dedicadas à aquisição de cada cor têm mudanças cromáticas mais complexas devido a diferenças de elementos ópticos e alinhamento imperfeito entre os canais. Assim, tais mudanças cromáticas podem levar a uma falsa conclusão, a menos que explicitamente corrigida pelo usuário. Embora as mudanças cromáticas não tenham sido um grande problema, desde que a resolução da microscopia seja limitada pelo limite de resolução clássica, o desenvolvimento recente da microscopia de super resolução1 levou à necessidade de uma correção mais precisa das mudanças cromáticas.
Tem sido uma prática comum medir mudanças cromáticas de sistemas de microscópio usando um slide de calibração de contas multicolorida2. O método de calibração baseado em contas é apropriado para medir mudanças cromáticas de toda a óptica do microscópio em direção à superfície do deslizamentode tampas 2. Este método, no entanto, é incapaz de medir mudanças cromáticas nas amostras biológicas de interesse. É importante notar que muitas amostras biológicas são tridimensionais (3D), e as mudanças cromáticas dessas amostras são diferentes daquelas na superfície do deslizamento de tampas. Além disso, as mudanças cromáticas mudam com as condições de imagem2,3. Medimos as mudanças cromáticas em amostras biológicas 3D e descobrimos que a incerteza das mudanças cromáticas era de até 350 nm pelo método clássico de calibração multicolorido3. Portanto, as mudanças cromáticas precisam ser medidas em amostras biológicas na profundidade do interesse e sob as condições de imagem que estão sendo utilizadas.
Aqui, descrevemos procedimentos para medir mudanças cromáticas em amostras biológicas e corrigir essas mudanças usando nosso software, Chromagnon3. Para medir mudanças cromáticas em amostras biológicas, nosso método utiliza dois tipos de conjuntos de dados, uma imagem "alvo" e uma imagem de "referência". A imagem "alvo" é uma imagem multicolorida de interesse, por exemplo, imagens manchadas de DNA, envelope nuclear e microtúbulos. Muitas vezes é impossível medir mudanças cromáticas em tal imagem. Portanto, precisamos de uma imagem de "referência" dedicada a medir as mudanças cromáticas na amostra. A única definição de uma imagem de "referência" é uma imagem multicolorida do mesmo objeto. Nesse sentido, uma imagem multicolorida também é um tipo de imagem de referência. Aqui, descrevemos três tipos diferentes de imagem de referência que são usadas para medir mudanças cromáticas nas amostras biológicas: "imagens de referência de crosstalk", "imagens de referência de campo brilhante" e "imagens de referência de calibração biológica". O tipo de imagem de referência depende do tipo de microscópio que está sendo utilizado ou da precisão de correção exigida conforme resumido na Tabela 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Crosstalk</td>
			<td>Campo brilhante</td>
			<td>Calibração biológica (em um slide diferente)</td>
			<td>Calibração biológica (no mesmo slide)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Precisãoum
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Simplicidade</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microscopia aplicável</td>
			<td>Campo largo</td>
			<td>Campo largo</td>
			<td>Todos</td>
			<td>Todos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Disponibilidade de alinhamento local</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: Número de "+" indica aumento da classificação. O single plus é de cerca de 50 nm e três mais é cerca de 15 nm em 3D. b: A precisão depende do quanto as condições de imagem variáveis são mantidas constantes. c: A calibração local medida por amostras de contas multicoloridas pode ser combinada conforme descrito na seção de protocolo 4.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Parâmetros ao escolher o tipo de imagens de referência.
As "imagens de referência crosstalk" têm a maior precisão de correção e são relativamente simples de realizar3,4 (Tabela 1). A desvantagem é sua limitação nas aplicações de microscopia devido à sua incapacidade de medir mudanças cromáticas em caminhos de excitação. Além disso, para obter tais imagens, o microscópio deve ser equipado com espelhosdicróicos multiband, e filtros de emissão que são controlados independentemente a partir dos filtros de excitação ou fontes de luz. A microscopia adequada inclui microscopia convencional de campo largo, microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM) como microscopia de localização/microscopia óptica estocástica (PALM/STORM)5,,6 e microscopia de expansão7 observada com microscopia de campo largo. Uma imagem de referência crosstalk é adquirida a partir da própria amostra de destino. É uma imagem de fluorescência de crosstalk (sangria)de um corante obtido em todos os canais necessários. A emissão de fluorescência sempre se expande para os comprimentos de onda mais longos, portanto, corantes com o comprimento de onda de emissão mais curto estão animados para obter fluorescência de crosstalk em canais de comprimentos de onda mais longos. Por exemplo, quando a amostra é manchada com azul, verde e vermelho, apenas o corante azul é animado, e a luz de emissão é obtida nos canais azul, verde e vermelho. Neste protocolo, o DNA manchado com 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) foi usado para obter fluorescência de crosstalk.
"Imagens de referência de campo brilhante" são uma alternativa mais fácil e menos fototóxica para "imagens de referência de crosstalk", mas são as menos precisas3 (Tabela 1). Estas são imagens de campo brilhante da amostra de destino, adquiridas em todos os canais de cores usados na imagem alvo.
As "imagens de referência de calibração biológica" têm a vantagem de serem aplicáveis a qualquer tipo de microscopia devido à sua capacidade de medir as mudanças cromáticas tanto nos caminhos de excitação quanto de emissão3,,8 (Tabela 1). A microscopia adequada inclui microscopia de campo largo, microscopia confocal, microscopia de folha de luz, esgotamento estimulado de emissões (STED)9,microscopia de iluminação estruturada (SIM)10,Airyscan/SORA11,,12, SMLM observada com o modo total de fluorescência de reflexão interna (TIRF), Super resolução Olympus (OSR)13, e assim por diante. Uma imagem de referência de calibração biológica é adquirida a partir de uma amostra de calibração igualmente preparada como a amostra alvo, mas com a coloração de uma única estrutura com múltiplas cores. A precisão de correção supera a resolução da maioria das microscopias de super-resolução e preparar uma amostra de calibração biológica pode ser relativamente simples. Outra vantagem é a disponibilidade para "média" de múltiplas imagens de referência. Portanto, embora as imagens individuais contenham informações ruins para a medição de turnos cromáticos, o conteúdo da informação pode ser aumentado com a média de múltiplas imagens. A precisão depende do quanto as condições de imagem são mantidas constantes. Nesse sentido, o melhor desempenho é obtido quando ambas as amostras de destino e referência estão no mesmo slide, utilizando, por exemplo, óculos de cobertura de câmara de 8 poços(Tabela 1, à direita-mais). Neste protocolo, a actina manchada com três cores de faloideina foi usada como calibração biológica.
Uma vez que uma imagem de referência é obtida, então a mudança cromática é medida e corrigida pelo nosso software Chromagnon. Não há limitação no número de canais, seções Z e prazos que o Chromagnon pode medir e corrigir as mudanças cromáticas para. Chromagnon mede mudanças cromáticas em duas etapas. O primeiro passo adquire os parâmetros de alinhamento "global" ou "afim" de tradução nos eixos X, Y, Z, ampliação ao longo dos eixos X, Y, Z e rotação ao redor do eixo Z. A precisão de cálculo do alinhamento global é de ~16 nm em 3D e ~8 nm em 2D. O segundo passo é um "alinhamento local" iterativo 2D opcional nas imagens projetadas para obter uma maior precisão. No processo de alinhamento local, as imagens são subdivididas em várias regiões e mudanças cromáticas nessas regiões locais são medidas. Posteriormente, as regiões são ainda mais divididas e as mudanças cromáticas nas sub-regiões são medidas iterativamente até que o número de pixels na região atinja o número mínimo de pixels (geralmente 60 x 60 pixels). O mapa de alinhamento local resultante é combinado com o parâmetro de alinhamento global e é aplicado à imagem alvo por uma transformação elástica. Após esta etapa, a precisão de cálculo é melhorada para ~14 nm em 3D e ~6 nm em 2D. O alinhamento local não é adequado para imagens de referência de calibração biológica porque a estrutura biológica na referência é diferente da do alvo (Tabela 1). Portanto, apenas o alinhamento global é utilizado para imagens de referência de calibração biológica.
As mudanças cromáticas locais são originárias de duas fontes; microscópio instrumental distorção local e inhomogeneidade estrutural biológica. Como a distorção local instrumental do microscópio é constante, isso pode ser medido a partir da amostra de referência multicolorida e corrigido como um parâmetro fixo. Chromagnon pode combinar o mapa de distorção local instrumental do microscópio e os parâmetros de alinhamento global das calibrações biológicas(Tabela 1). Usando este método, espera-se que a precisão média da calibração biológica seja melhorada em um adicional de 1-2 nm.
Aqui, descrevemos um protocolo para corrigir as mudanças cromáticas de imagens de fluorescência 3D usando nosso software Chromagnon, da extremidade baixa mais fácil à mais alta precisão. Usamos a imunostaining de células HeLa como exemplo e as observamos usando microscopia de campo largo 3D e 3D-SIM. Na primeira seção, descrevemos como preparar amostras de destino e amostras de calibração biológica. Essa parte do protocolo deve ser otimizada para os alvos específicos da pesquisa. Na segunda seção, descrevemos os métodos de aquisição para três tipos de imagens de referência por microscópios. A suposição era obter canais azuis, verdes e vermelhos, mas a composição do canal deve ser modificada pelos alvos específicos da pesquisa e pelas configurações do microscópio. Não importa se o microscópio está equipado com uma única câmera ou múltiplas câmeras. Na terceira seção, descrevemos como podemos usar nosso software para medir e corrigir mudanças cromáticas da imagem alvo usando imagens de referência. Finalmente, na quarta seção, descrevemos um método para complementar as imagens de referência de calibração biológica usando a calibração local instrumental de um microscópio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

A microscopia de fluorescência multicolorida quantitativa baseia-se na cuidadosa correspondência espacial dos canais de cores adquiridos em diferentes comprimentos de onda. Devido à aberração cromática e ao alinhamento imperfeito das câmeras, as imagens adquiridas em cada canal podem ser deslocadas e ampliadas, bem como rotacionadas em relação umas às outras em qualquer uma das três dimensões. Com o método de calibração clássica, as mudanças cromáticas são medidas por contas multicoloridas anexadas à superfície de um deslizamento de cobertura, e um número de softwares estão disponíveis para medir as mudanças cromáticas de tais amostras de calibração. No entanto, a aberração cromática pode variar de profundidade, alterar com condições de observação e ser induzida pela própria amostra biológica, dificultando assim a determinação da verdadeira quantidade de mudança cromática na amostra de interesse e em todo o volume. Corrigir mudanças cromáticas com maior precisão é particularmente relevante para microscopia de super-resolução, onde apenas pequenas mudanças cromáticas podem afetar análises quantitativas e alterar a interpretação de imagens multicoloridas. Desenvolvemos um software de código aberto Chromagnon e métodos de acompanhamento para medir e corrigir mudanças cromáticas 3D em amostras biológicas. Aqui fornecemos um protocolo de aplicação detalhado que inclui requisitos especiais para preparação de amostras, aquisição de dados e processamento de software para medir mudanças cromáticas em amostras biológicas de interesse.

Um exemplo de correção de mudança cromática usando uma imagem de referência crosstalk é mostrado na Figura 5. A imagem foi obtida com um microscópio de campo largo equipado com uma única câmera. A emissão de fluorescência do DAPI foi utilizada como referência (Figura 5A,B) para corrigir os canais azul, verde e vermelho. A imagem é composta por 3 canais de fatias de 60 Z, cada uma composta de 256 x 256 pixels. As imagens foram desconvolvadas antes de medir as mudanças cromáticas. Medindo as mudanças cromáticas locais usando Chromagnon levou 51 s em um Mac com Intel Core i7 (quad core, 8 threads, 2,7 GHz), RAM de 16 GB e armazenamento flash de 1 TB. O parâmetro de alinhamento foi aplicado à imagem alvo (Figura 5C,D), que tem exatamente o mesmo número de voxels que a imagem de referência. Preparar o arquivo alinhado levou 3 s. Como resultado do corte dos pixels de borda durante o processo de alinhamento (caixa deseleção de margens de corte na Figura 1C),o número de voxels foi reduzido após o alinhamento(fatias de Figura 5B,51 Z, 252 x 251 pixels). O DNA na ponte de anáfase (indicada por pontas de flecha) é visto incorretamente fora do envelope nuclear antes do alinhamento(Figura 5C, óbvio no painel inferior mostrando a visão XZ), mas como esperado dentro do envelope após o alinhamento(Figura 5D).
Um exemplo de correção de mudança cromática usando uma imagem de referência de calibração biológica é mostrado na Figura 6. As imagens foram obtidas com um microscópio SIM equipado com três câmeras. Três imagens de células HeLa manchadas com faloides conjugadas a corantes azuis, verdes e vermelhos foram mediadas(Figura 6A). A imagem de referência compreende 3 canais de fatias de 76 Z, cada uma composta de 1.024 x 1.024 pixels. Medir mudanças cromáticas usando Chromagnon sem alinhamento local exigiu 194 s no sistema Mac descrito acima. O parâmetro foi aplicado a uma imagem-alvo composta por 3 canais de fatias de 73 Z, cada uma composta de 1.024 x 1.024 pixels. A geração do arquivo alinhado levou 25 s. A visualização XZ mostra posições incorretas do canal ao longo do Z, e ligeiramente ao longo das direções X(Figura 6A,C), mas este erro de registro foi corrigido após o alinhamento(Figura 6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> Figura 5: Um exemplo de alinhamento com uma imagem de referência crosstalk. As células HeLa foram manchadas com DAPI para DNA (mostrado em magenta), Alexa Fluor 488 (mostrada em amarelo) para envelope nuclear, e Alexa Fluor 555 (mostrada em azul) para microtúbulos. As imagens foram adquiridas por microscopia de campo largo 3D com uma única câmera e desconvolved. (A,B) Uma imagem de referência de crosstalk representativa usando emissão DE DAPI, antes e depois do alinhamento por Chromagnon. Três canais coloridos são mostrados como sobrepostos. (C,D) Uma seção óptica da pilha 3D em três canais antes e depois do alinhamento. A aberração cromática axial é óbvia na ponte de anáfase mostrada por pontas de flecha. A barra de escala no painel A indica 5 μm para todos os painéis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> Figura 6: Um exemplo de alinhamento com uma imagem de referência de calibração biológica As imagens foram adquiridas com 3D-SIM equipado com três câmeras. (A,B) Uma imagem de referência media uma média de três imagens antes (A) e depois(B) alinhamento. As células HeLa foram manchadas com fábula conjugada com Alexa Fluor 405, 488 ou 594. (C,D) A imagem alvo antes(C) e depois(D) alinhamento. As células HeLa foram manchadas com DAPI para DNA (mostrado em magenta), Alexa Fluor 488 (mostrada em amarelo) para envelope nuclear, e Alexa Fluor 594 (mostrada em azul) para microtúbulos. A barra de escala no painel A indica 5 μm para todos os painéis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A correção de mudanças cromáticas em imagens de microscopia de fluorescência multicolorida (3D) é crucial para análises quantitativas de dados. Este protocolo é desenvolvido para medir e corrigir mudanças cromáticas em amostras biológicas através da aquisição de imagens de referência adequadas e processamento com o software de código aberto, Chromagnon.

Correção de alta precisão de mudanças cromáticas 3D na Era da Super-Resolução Imagem Biológica Usando Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

As imagens de microscopia de coral de marsh contêm Shift Cromática em três dimensões. Isso prejudica a análise de colocalização de imagens de alta resolução. É geralmente difícil remover o Turno Cromático originado de uma amostra biológica em si, nosso método pode corrigir mudanças cromáticas em uma amostra biológica usando imagens de referência adquiridas separadamente.Demonstrando o procedimento será Takako Koujin um técnico do meu grupo. Comece semeando 2,5 vezes 10 para as quintas células curandadas em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros e cultivando-as em uma incubadora de dióxido de carbono. Após 24 horas de incubação substitua o meio por dois mililitros de 3,7% de formaldeído em PBS e misture suavemente.Conserte as vendas por 15 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma rotativa. Lave as células três vezes com dois mililitros de PBS por cinco a dez minutos. Permeabiliza-os com dois mililitros de ponto 1% tentem os próximos 100 em PBS enquanto giram e repetem as lavagens com PBS.Em seguida, colori as células usando um protocolo padrão de coloração de anticorpos, conforme descrito no manuscrito do texto. Para obter uma imagem de referência de referência crosstalk para microscopia widefield, adicione dois mililitros de ponto cinco microgramas por mililitro Dappy para permanecer no DNA. Deixe as células na plataforma rotativa por 30 minutos.Em seguida, substitua a solução por 100 microliters de meio de montagem para obter uma imagem de referência de referência de calibração biológica para qualquer tipo de microscopia, incluindo microscopia confocal e super resolução. Conserte as células como descrito anteriormente, e prepare a solução de estoque de um corante fluorescente conjugado em 1,5 mililitros de metanol. Adicione a faloideina na PBS a uma diluição de 1 a 100 para o piso Alexa 405 um a 1000 para alexa piso 488 e um a 200 para alexa piso 594.Adicione um mililitro da solução às células e incuba-as por 30 minutos enquanto gira. Lave as células três a cinco vezes com dois mililitros de PBS. Em seguida, substitua o PBS por 100 microliters de meio de montagem.Para adquirir imagens de fluorescência usando microscopia widefield coloque a amostra alvo no microscópio no software de imagem, abra a janela de teste de design e execute, defina a etapa Z apropriada e selecione os canais azul, verde e vermelho. Na guia Executar, adicione o nome do arquivo da imagem e comece a imagem. Para adquirir imagens de referência crosstalk para medir shifts cromáticos na amostra selecione a luz de excitação apenas para Dappy e certifique-se de usar exatamente a mesma posição de estágio e altura Z como para a amostra de destino.Alternativamente, usar uma imagem de campo brilhante como um local de referência para a amostra de destino no microscópio de campo largo e adquirir uma imagem de fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos. Em seguida, adquira imagens de campo brilhante do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos na mesma posição do palco e usando a mesma altura Z. Para adquirir imagens de fluorescência usando microscopia de super resolução, como o 3D Sim coloque a amostra alvo no microscópio e adquira uma imagem sim fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos.Então reconstrua a imagem super resolvida. Em seguida, coloque a mancha de amostra com phalloidina multicolorida em um microscópio sim 3D. E adquirir múltiplas imagens sim fluorescência como as imagens de referência de calibração biológica em posições de estágio de ponto, em seguida, reconstruir as imagens super resolvidas.Use um navegador web para baixar a mais nova versão binária do Chromagnon. Extrair o programa e colocar o arquivo executável em um local conveniente. Arraste e solte os arquivos de referência do campo direito crosstalk ou referências de calibração biológica à caixa de referência ou clique em arquivos de referência para abrir uma caixa de diálogo seletor de arquivos.Se o programa pedir para instalar um Java Development Kit, pressione Sim e navegue até a página baixada. Em seguida, baixe e instale o JDK para o Sistema Operacional conforme instruído. Arraste e solte os arquivos de destino da coloração de anticorpos na caixa de destino.Escolha um formato de imagem de saída e especifique o sufixo para o nome do arquivo de saída. Para imagens de referência crosstalk com alta relação sinal/ruído. Escolha a projeção na lista de escolha do alinhamento local e use um tamanho mínimo de janela de 60.Para obter várias imagens de referência de calibração biológica, verifique a opção de referências médias e não escolha nenhuma para alinhar local, clique em executar todas as medidas para iniciar as medições. Para garantir que a medição tenha sido realizada corretamente, arraste e solte as imagens de referência na caixa de referência e na caixa de destino. Em seguida, execute o programa e verifique se as imagens estão perfeitamente sobrepostas.A correção de turno cromático em microscopia de campo largo pode ser realizada usando uma imagem de referência de crosstalk. Esta imagem foi obtida com um microscópio widefield equipado com uma única câmera. A emissão de fluorescência de Dappy foi usada como referência para corrigir os canais azul, verde e vermelho.Após o alinhamento com Chromagnon, o Shift Cromático e a imagem de referência foram corrigidos. Quando o parâmetro de alinhamento foi aplicado à imagem alvo por Chromagnon, o DNA e a ponte de anáfase, que é vista incorretamente fora do envelope nuclear antes do alinhamento aparece como esperado dentro do envelope. A correção de turno cromático de uma imagem sim 3D pode ser realizada usando uma imagem de referência de calibração biológica.Três imagens sim 3D de células HeLa manchadas com faloides conjugadas a corantes azuis, verdes e vermelhos foram averígadas e o Deslocamento Cromático foi medido por Chromagnon. Após o alinhamento, o Shift Cromático e a imagem de referência foram corrigidos. O parâmetro de alinhamento foi aplicado a uma imagem de destino.A visualização XZ mostra a posição incorreta do canal ao longo do Z e ligeiramente ao longo das direções X, que foi corrigida após o alinhamento. Para melhor desempenho é importante obter imagens de referência nas mesmas condições e no tempo como imagens de destino.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

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