Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 till A.M., JP18H05528 och JP17H03636 till T.H., och JP17H01444 och JP18H05533 till H.Y. L.S. bekräftar stödet från Welcome Trust Strategic Awards 091911 och 107457/Z/15/Z finansiering avancerad bildbehandling vid Micron Oxford.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Förfarandet för kromatisk korrigering är en avvägning mellan noggrannhet och ansträngning. För att spara onödiga ansträngningar, är det bättre att veta hur mycket noggrannhet som krävs för din studie. Den högsta noggrannheten kanske inte krävs för konventionell wide-field (live) imaging, och därför är ljusa fältreferensbilder ofta tillräckliga för att korrigera den kromatiska förskjutningen. På samma sätt, när bildbehandlingstillståndet och miljön är konstant, kommer upprepad användning av en biologisk kalibrering att spara tid. Å andra sidan, om en mycket exakt registrering önskas, högkvalitativa överhörning eller biologisk kalibrering referensbilder är nödvändiga. För bästa prestanda bör referensbilder erhållas med så lika villkor och tidpunkter som målbilderna som möjligt. Så länge både referens- och målbilder erhålls med samma mikroskopi, kommer högre rumslig upplösning att förbättra korrigeringsnoggrannheten. Om deconvolution är tillgänglig för både referens- och målbilder kan det förbättra korrigeringsnoggrannheten genom att genomföra detta innan korrigeringen. För bästa prestanda bör provtagningssatsen för den optiska (Z)-axeln uppfyllas i både referens- och målfilen för exakt subpixelinter interpolation (protokollsteg 2.1.3).
Underlåtenhet att korrigera kromatisk förändring leder till felaktiga slutsatser. Dessutom kan användning av fel kalibrering till och med förvärra kromatiska skiften i stället för att korrigera dem, och detta måste därför undvikas. Vi har sammanfattat de möjliga orsakerna till misslyckanden, och deras gemensamma lösningar, i tabell 2. För att undersöka orsaken till ett fel är det i första hand nödvändigt att visuellt kontrollera om den kromatiska förskjutningen i referensbilden korrigeras exakt (protokollsteg 3.12). De flesta fel beror på referensbildernas kvalitet och avhjälps enkelt enligt beskrivningarna i tabell 2. När det gäller referensbildernas kvalitet är det viktigt att notera att den globala anpassningens noggrannhet minskar om hela synfältet inte är fyllt med provet (figur 7, tabell 2). Jämfört med det goda exemplet som visas i figur 7Ainnehåller det dåliga exemplet i figur 7B endast tre kärnkuvert i den övre vänstra regionen, och Chromagnon misslyckades med att justera en del av denna bild. Detta beror på att den globala anpassningsmetoden för Chromagnon delar upp synfältet i fyra regioner(figur 7C)för att mäta skillnaderna i rotation och förstoring med hög noggrannhet3. Denna metod, om den används korrekt, är en ordning mer exakt än andra linjära metoder såsom logpolär omvandling och simplex metoder3. Om någon av de fyra regionerna inte är tillgängliga, kommer Chromagnon att byta till mindre effektiva linjära metoder. För bästa prestanda är därför exemplen i figur 7B och figur 7C oönskade, och de fyra regionerna bör fyllas med objekt. Användare kan kontrollera om något kvadratiskt område i synfältet inte är tillgängligt för mätning genom att titta på loggfilen ("Chromagnon.log"; se protokollsteg 3.10). Lyckligtvis kan detta problem lätt övervinnas genom att i genomsnitt flera biologiska kalibreringsbilder eller använda lokal justering för överhörning eller ljusa fält referensbilder (Tabell 2). I motsats till om referensbilder inte har korrigerats är det svårare att identifiera underlåtenhet att korrigera målbilder. Eftersom sådana fel uppstår på grund av skillnader i filformat, bildframställningsförhållanden, bildtider, bildåtergivnings-/justeringsmetoder mellan referens- och målbilderna (tabell 2)bör användarna alltid vara försiktiga när de använder referensbilder som erhålls under olika förhållanden/tidpunkter från målbilderna. Några exempel bilder finns tillgängliga för testning<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)</a>för att få konkret uppfattning om bra och dåliga exempel bilder.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problem</td>
			<td>Orsaka</td>
			<td>Lösning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Det gick inte att korrigera referensbilden</td>
			<td>Låg kontrast</td>
			<td>Hämta om möjligt en bild med högre kontrast. Om en referensbild med ljust fält används, reacquire bilden i en vattenbaserad lösning för att få högre kontrast i cellen. Alternativt kan du prova att tillämpa beräkningsbullereduktion (t.ex. gaussisk filtrering). Stäng av den lokala justeringen, som är känsligare för brus.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Kontaminering av icke-relaterade bilder</td>
			<td>Ta bort källan till de orelaterade bilderna i exemplet om möjligt. För överhörning referensbilder, kontrollera excitation spektra av de färgämnen som används för målbilder. Om färgämnena är upphetsade under förvärvet av en överhörningsbild (t.ex. Om damm på kamerachipet skapar en uppenbar kanalskillnad rengör du kamerachippet eller använder en beräkningsliknande plattfältsmetod.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>En extremt ljuspunkt gjord av en kosmisk strålning</td>
			<td>Hämta bilden igen om möjligt. Alternativt kan du prova att tillämpa beräkningsbullereduktion (t.ex. filtrering av median eller gaussisk).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Deconvolution artefakter (konstgjorda signaler vid axial och laterala kanter)</td>
			<td>Trimma kantpixlarna eller Z-avsnitten efter dekontrieringen. Om den ena sidan trimmas bör den andra sidan också trimmas för att behålla bildcentret.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Z-stegstorleken är för gles</td>
			<td>En Z-stack bör förvärvas för att uppfylla Nyquistkriteriet enligt protokoll 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Optisk avvikelse</td>
			<td>Sfärisk villfarelse är den största avvikelsen som orsakas av användare. Välj rätt objektiv för provet och använd en täckslipjocklek på 170 μm. Om objektivet är utrustad med en korrigeringsring, justera den för att hitta den position där det högsta fluorescensantalet erhålls från fokus. När det gäller ett oljenedsänkningsmål utan korrigeringsring, justera brytningsindexet för nedsänkningsoljan som ökar fluorescensantalet i fokus.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Synfältet är ofyllt (fig. 7)</td>
			<td>När det gäller biologiska kalibrering referensbilder, genomsnitt många bilder. När det gäller överhörning eller referensbilder med ljust fält använder du lokal justering.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>En oidentifierad programvara bugg</td>
			<td>Rapportera problemet via GitHub (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Det gick inte att korrigera målbilden</td>
			<td>Metadata för bildfilen går förlorad</td>
			<td>Använd det ursprungliga mikroskopfilformatet som innehåller fullständiga metadata och undvik att konvertera till en tiff-fil med flera sidor före bearbetning. Använd samma ordning på kanaler som det står i protokoll 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Felaktiga justeringsmetoder för den givna mikroskopiet</td>
			<td>Använd inte den lokala justeringsmetoden när du mäter från biologiska kalibreringsreferensbilder till målbilder. Använd inte andra korshörningsreferensbilder än bredfältsmikroskopi.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Skillnader i bildbehandlingsförhållanden</td>
			<td>Håll bildförhållandena konstanta mellan referens- och målbilderna enligt protokoll 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Skillnader i urval (inklusive täcket)</td>
			<td>Använd alltid samma monteringsmedium, täckslip (t.ex. nr 1.5H) och ett liknande fokusdjup.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Mikroskop drift sedan kalibreringen gjordes senast</td>
			<td>Gör en kalibrering lika ofta som varannan vecka. Håll temperaturen konstant, och använd ett flytande bord för att undvika hårdvarudrift av mikroskopet.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Felsökning för kromatisk korrigering.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> Bild 7: Exempel på referensbilder. Kärn- kuvert i fissionjästceller märkta med GFP och mCherry. Bilder förvärvades med konventionella wide-field mikroskopi. Kromatiska skift korrigerades med Chromagnon utan lokal justering med hjälp av bilderna själva som referensbilder. Bilderna deconvolveds sedan för att visa detaljerna. (A) Ett bra exempel med många objekt i synfältet. (B) Ett dåligt exempel med objekt endast i det övre vänstra hörnet. Feljustering är uppenbart på en viss region av bilden. (C) Ett oönskat exempel där en av quadrisection (åtskilda av prickade tvärrlinjer) är tom. Skalan på panel A anger 5 μm för hela fältvyn och 1,25 μm för den förstorade vyn och gäller för alla paneler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
I det här protokollet beskrev vi tre olika referenstyper (tabell 1). Bland dem, överhörning referensbilder och biologisk kalibrering referensbilder behöver ytterligare noggrann diskussion. För överhörning referensbilder, prover färgas med DAPI eller Hoechst 33342, och monteras i glycerol eller kommersiella monteringsmedia kan effektivt användas för att anpassa den blå, grön och röda kanaler. På samma sätt kan Alexa Fluor 488 användas för att anpassa de gröna och röda kanalerna. Emellertid, erhålla överhörning fluorescens är ofta svårt eftersom många blå färgämnen utom DAPI och Hoechst är dimmer och sönderfall snabbare än de flesta gröna och röda färgämnen. Dessutom är utsläppsspektrat för moderna färgämnen smalare, vilket gör att anpassningen av mer än tre kanaler med denna metod utmanar. Uppmärksamhet bör också ägnas åt några vanliga röda färgämnen (t.ex. Alexa Mjöl 568 och 594, men inte Alexa Fluor 555) som kan vara upphetsad av violett ljus, som förhindrar att erhålla hög kontrast överhörning bilder från blå färgämnen. En annan nackdel är att denna metod inte kan mäta den kromatiska villfarelsen av excitationsljusbanor i flerfärgsupptring, eftersom endast en enda excitationvåglängd används för excitation (tabell 1). Eftersom de flesta avancerade mikroskopi använder förändrad belysning optik, är tillämpningen av denna metod begränsad. Ändå är dess högre korrigering noggrannhet tillräckligt fördelaktigt för att det ska beskrivas i detta protokoll. I allmänhet bör en överhörning bild tas efter en målbild för att förhindra blekning eller fototoxiska effekter. För SMLM som observeras med bredbandsläget bör en referensbild förvärvas innan en målbild förvärvas, eftersom fluorescensfärgämnen kan blekas vid avbildning.
Biologiska kalibrering referensbilder tillåter användare att enkelt anpassa önskat antal kanaler på bekostnad av ytterligare provberedning. En annan fördel med biologisk kalibrering referensbilder är tillgången på "genomsnitt" flera referenser som hjälper till att fylla alla synfält. Denna metod kan lida av skillnader i bildframställningsförhållanden om kalibreringsprovet bereds på en annan bild. Det mesta av detta problem kan lösas om både mål och referenser bereds på samma bild med hjälp av kommersiella kammarlockglas (tabell 1), och andra bildförhållanden hålls konstanta som i protokollsteg 2.3.3. I detta fall kan en korrigeringsnoggrannhet som liknar den för överhörningsreferensbilder förväntas3. Protokollet att använda falloidin som visas här är ett av de enklaste sätten att färga en enda cellulär struktur med flera färger. Det finns många möjliga scenarier för att förbereda biologiska kalibreringsprover. För immunfärgning kan ett prov märkas med en enda primär antikropp följt av färgning med sekundära antikroppar i flera färger. På så sätt kan en enda målstruktur märkas med flera färger. Alternativt, 5-etynyl-2'-deoxyuridin, detekteras av "klick" kemi etiketter nyligen syntetiserade DNA i flera färger med hög densitet, som beskrivs i detalj tidigare8. För levande celler är det användbart att förbereda en transgen stam som hyser två kopior av en gen som är smält till GFP eller mCherry att märka samma struktur med två färger. Om genens kopieringsnummer är kritiskt så ofta som det observeras för membranproteiner, kan en enda kopia av genen fixeras tandemly till GFP och mCherry (figur 7). Fotokonverterbara fluorescerande proteiner, såsom mEOS218, kan också användas genom att belysa en måttlig nivå av violett ljus för att erhålla både proteinarter med eller utan fotokonvertering. Under låga syreförhållanden kan GFP också användas som ett fotokonverterbart protein från grönt till rött19,20. Att välja rätt kalibreringsprov kommer därmed att göra experimentet mer robust.

Multicolor imaging är en av de grundläggande aspekterna av biologisk fluorescensmikroskopi, i de fall där det rumsliga förhållandet mellan olika molekyler eller strukturer är av stort intresse. Kromatisk aberration, en optisk avvikelse av polykromatiskt ljus som orsakas av spridning, ändrar den skenbara positionen för de färgade objekt av intresse. På samma sätt har mikroskop utrustade med flera kameror som ägnas åt att förvärva varje färg mer komplexa kromatiska förändringar på grund av skillnader i optiska element och ofullkomlig anpassning mellan kanalerna. Sådana kromatiska förändringar kan således leda till en felaktig slutsats om inte användaren uttryckligen korrigerar. Även om kromatiska förändringar inte har varit ett stort problem så länge som upplösningen av mikroskopi begränsas av den klassiska upplösningen gränsen, nyligen utveckling av super-upplösning mikroskopi1 har föranlett behovet av mer exakt korrigering av kromatiska förändringar.
Det har varit vanligt att mäta kromatiska skift av mikroskop system med hjälp av en multicolor pärla kalibrering bild2. Den pärlbaserade kalibreringsmetoden är lämplig för mätning av kromatiska skiftningar från mikroskopets hela optik mot täckspakens yta2. Denna metod kan dock inte mäta kromatiska förändringar i de biologiska prov av intresse. Det är viktigt att notera att många biologiska prover är tredimensionella (3D), och de kromatiska förskjutningarna av sådana prover skiljer sig från dem vid täckspakets yta. Dessutom förändras kromatiska skift med bildytor2,3. Vi har mätt kromatiska förändringar i 3D biologiska prover och fann att osäkerheten i kromatiska skift var ofta så mycket som 350 nm av den klassiska multicolor-pärla kalibreringsmetod3. Kromatiska skiften måste därför mätas i biologiska prover på det intressanta djupet och under de bildframställningsförhållanden som används.
Här beskriver vi procedurer för att mäta kromatiska förändringar i biologiska prover och korrigera dessa skift med hjälp av vår programvara, Chromagnon3. För att mäta kromatiska förändringar i biologiska prover använder vår metod två typer av datauppsättningar, en "målbild" och en "referensbild". Den "mål" bilden är en multicolor bild av intresse, till exempel bilder färgade för DNA, kärnkuvert och mikrotubuli. Det är ofta omöjligt att mäta kromatiska förändringar i en sådan bild. Därför behöver vi en "referens" bild som är dedikerade till att mäta de kromatiska förskjutningar i provet. Den enda definitionen av en "referens" bild är en flerfärgsbild av samma objekt. I den meningen är en multicolor pärlor bild också en typ av referensbild. Här beskriver vi tre olika typer av referensbild som används för att mäta kromatiska skiftningar i de biologiska proverna: "överhörning referensbilder", "bright-field reference images" och "biological calibration reference images". Vilken typ av referensbild som ska användas beror på vilken typ av mikroskop som används eller vilken korrigeringsnoggrannhet som krävs enligt tabell 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Överhörning</td>
			<td>Ljust fält</td>
			<td>Biologisk kalibrering (på en annan bild)</td>
			<td>Biologisk kalibrering (på samma bild)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggrannheten
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enkelhet</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tillämplig mikroskopi</td>
			<td>Brett fält</td>
			<td>Brett fält</td>
			<td>Alla</td>
			<td>Alla</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tillgång till lokal justering</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-C.
</td>
			<td>-C.
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: Antal "+" indikerar ökande betyg. Enda plus är ca 50 nm och tre plus är ca 15 nm i 3D. b: Noggrannheten beror på hur mycket de variabla bildförhållandena hålls konstanta. c: Lokal kalibrering mätt med flerfärgade pärlprover kan kombineras enligt beskrivningen i protokollavsnitt 4.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Parametrar när du väljer typ av referensbilder.
"Överhörning referensbilder" har den högsta korrigeringsnoggrannheten och är relativt enkel att utföra3,,4 (tabell 1). Nackdelen är deras begränsning i mikroskopi applikationer på grund av deras oförmåga att mäta kromatiska förändringar i retningsvägar. För att erhålla sådana bilder bör mikroskopet också vara utrustat med dikroa speglar med flera band och utsläppsfilter som är oberoende styrda från excitationsfilter eller ljuskällor. Lämplig mikroskopi inkluderar konventionell wide-field mikroskopi, single molecule localization microscopy (SMLM) såsom fotoaktiverad lokalisering mikroskopi/ stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (PALM / STORM)5,,6 och expansion mikroskopi7 observeras med bred fält mikroskopi. En överhörning referensbild förvärvas från själva målprovet. Det är en bild av överhörning (genomblödning) fluorescens av ett färgämne som erhållits i alla nödvändiga kanaler. Fluorescensutsläppet utvidgas alltid mot de längre våglängderna, därför är färgämnen med den kortaste utsläppsvåglängden glada över att få överhörning fluorescens i kanaler av längre våglängder. Till exempel, när provet färgas med blått, grönt och rött, bara det blå färgämnet är upphetsad, och emissionsljuset erhålls i de blå, gröna och röda kanalerna. I detta protokoll, DNA färgas med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) användes för att få överhörning fluorescens.
"Referensbilder med ljust fält" är ett enklare och mindre fototoxiskt alternativ till "överhörningsreferensbilder" men är de minst exakta3 (tabell 1). Det här är ljusa fältbilder av målexemplet, som förvärvats i alla färgkanaler som används i målbilden.
"Biologiska kalibreringsreferensbilder" har fördelen av att vara tillämpliga på alla typer av mikroskopi på grund av deras förmåga att mäta kromatiska skiften både i excitations- och utsläppsvägarna3,,8 (tabell 1). Lämplig mikroskopi omfattar bredfältsmikroskopi, konfokalmikroskopi, ljusplåtsmikroskopi, stimulerad utarmning av utsläpp (STED)9, strukturerad belysningmikroskopi (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM observerats med det totala interna reflektionsfluorescensläget (TIRF), Olympus superupplösning (OSR)13och så vidare. En biologisk kalibrering referensbild förvärvas från en kalibrering prov på samma sätt beredd som målprov, men med färgning av en enda struktur med flera färger. Korrigeringsnoggrannheten utmärker upplösningen av de flesta superupplösningsmikroskopi och förbereda ett biologiskt kalibreringsprov kan vara relativt enkelt. En annan fördel är tillgängligheten till "genomsnittliga" flera referensbilder. Även om de enskilda bilderna innehåller dålig information för mätning av kromatiska skift, kan informationsinnehållet ökas genom att medelvärdet av flera bilder i genomsnitt. Noggrannheten beror på hur mycket bildbehandlingsförhållandena hålls konstanta. I detta avseende erhålls bästa prestanda när både mål- och referensprover finns på samma bild, till exempel med hjälp av 8-välklade täckglas (tabell 1, högst till höger). I detta protokoll, aktin färgas med tre färger av falloidin användes som en biologisk kalibrering.
När en referensbild erhålls mäts och korrigeras den kromatiska förskjutningen av vår programvara Chromagnon. Det finns ingen begränsning på numrera av kanaliserar, Z delar upp och tidsramar det Chromagnon kan mäta och korrigera de chromatic förskjutningarna för. Chromagnon mäter kromatiska förändringar i två steg. Det första steget förvärvar de "globala" eller "affine" justeringsparametrarna för översättning i X-, Y-, Z-axlarna, förstoring längs X-, Y-, Z-axlarna och rotationen runt Z-axeln. Beräkningsnoggrannheten för den globala justeringen är ~16 nm i 3D och ~8 nm i 2D. Det andra steget är en valfri 2D iterativ "lokal justering" på projicerade bilder för att få en högre noggrannhet. I den lokala anpassningsprocessen är bilderna indelade i flera regioner och kromatiska förändringar i dessa lokala regioner mäts. Därefter delas regionerna ytterligare och kromatiska skift i underregionerna mäts iterativt tills antalet pixlar i regionen når det minsta antalet pixlar (vanligtvis 60 x 60 pixlar). Den resulterande lokala justeringskartan kombineras med den globala justeringsparametern och tillämpas på målbilden av en elastisk omformning. Efter detta steg förbättras beräkningsnoggrannheten till ~14 nm i 3D och ~6 nm i 2D. Den lokala justeringen är inte lämplig för biologiska kalibreringsreferensbilder eftersom den biologiska strukturen i referensen skiljer sig från den i målet (tabell 1). Därför används endast global justering för biologiska kalibreringsreferensbilder.
De kromatiska skiftena för lokal påbörjar från två källor; mikroskop instrumental lokal distorsion och biologisk strukturell inhomogenitet. Eftersom mikroskop instrumental lokal distorsion är konstant, kan detta mätas från multicolor pärlor referensprov och korrigeras som en fast parameter. Chromagnon kan kombinera mikroskopet instrumental lokal distorsion karta och den globala justering parametrar från biologiska kalibreringar (tabell 1). Med denna metod förväntas den genomsnittliga noggrannheten hos biologisk kalibrering förbättras med ytterligare 1−2 nm.
Här beskriver vi ett protokoll för att korrigera kromatiska förändringar av 3D fluorescensbilder med hjälp av vår programvara Chromagnon, från den enklaste låga änden till högsta noggrannhet. Vi använder immunfärgning av HeLa-celler som ett exempel och observerade dem med hjälp av 3D-wide-field mikroskopi och 3D-SIM. I det första avsnittet beskriver vi hur man förbereder målprover och biologiska kalibreringsprover. Denna del av protokollet bör optimeras för de specifika målen för forskningen. I det andra avsnittet beskriver vi förvärvsmetoderna för tre typer av referensbilder genom mikroskop. Antagandet var att få blå, gröna och röda kanaler, men kanalsammansättning bör ändras av de specifika målen för forskningen och av uppställningarna för mikroskopet. Det spelar ingen roll om mikroskopet är utrustat med en enda kamera eller flera kameror. I det tredje avsnittet beskriver vi hur man kan använda vår programvara för att mäta och korrigera kromatiska förskjutningar av målbilden med hjälp av referensbilder. Slutligen, i det fjärde avsnittet, beskriver vi en metod för att komplettera de biologiska kalibreringsreferensbilderna med hjälp av ett mikroskops instrumentala lokala kalibrering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

Kvantitativ multicolor fluorescensmikroskopi bygger på noggrann rumslig matchning av färgkanaler som förvärvats vid olika våglängder. På grund av kromatisk aberration och den ofullkomliga anpassningen av kameror, kan bilder som förvärvats i varje kanal flyttas och förstoras, samt roteras i förhållande till varandra i någon av de tre dimensionerna. Med den klassiska kalibreringsmetoden mäts kromatiska skiftningar med flerfärgade pärlor som är fästa vid ytan av ett täckspak, och ett antal program finns tillgängliga för att mäta de kromatiska förskjutningar från sådana kalibreringsprover. Kromatisk aberration kan dock variera med djup, förändras med observationsförhållanden och framkallas genom själva det biologiska provet, vilket hindrar bestämningen av den verkliga mängden kromatiska förskjutningar i urvalet av intresse och över volymen. Att korrigera kromatiska skift med högre noggrannhet är särskilt relevant för superupplösningsmikroskopi där endast små kromatiska skift kan påverka kvantitativa analyser och ändra tolkningen av flerfärgsbilder. Vi har utvecklat en programvara med öppen källkod Chromagnon och tillhörande metoder för att mäta och korrigera 3D-kromatiska förändringar i biologiska prover. Här tillhandahåller vi ett detaljerat programprotokoll som innehåller särskilda krav för provberedning, datainsamling och programvarubearbetning för att mäta kromatiska förändringar i biologiska prover av intresse.

Ett exempel på korrigering av kromatiskt skift med hjälp av en överhörningsreferensbild visas i figur 5. Bilden erhölls med ett brett fältmikroskop utrustat med en enda kamera. Fluorescensutsläpp från DAPI användes som referens (figur 5A,B) för att korrigera de blå, gröna och röda kanalerna. Bilden består av 3 kanaler med 60 Z-skivor, var och en består av 256 x 256 pixlar. Bilderna deconvolved innan man mäter de kromatiska skiften. Mätning av lokala kromatiska skift med Chromagnon tog 51 s på en Mac med Intel Core i7 (quad core, 8-trådar, 2,7 GHz), 16 GB RAM och 1 TB flashlagring. Justeringsparametern tillämpades på målbilden (figur 5C,D), som har exakt samma antal voxels som referensbilden. Förbereda den justerade filen tog 3 s. Som ett resultat av trimning kanten pixlar under justeringsprocessen(gröda marginaler kryssruta i figur 1C),antalet voxels minskades efter justering (Figur 5B, 51 Z segment, 252 x 251 pixlar). DNA i anafasbron (indikerad med pilspetsar) ses felaktigt utanför kärnhöljet före justering (Figur 5C, uppenbart i den nedre panelen som visar XZ-vyn), men som förväntat inuti kuvertet efter justering (figur 5D).
Ett exempel på korrigering av kromatiskt skift med hjälp av en biologisk kalibreringsreferensbild visas i figur 6. Bilderna erhölls med ett SIM-mikroskop utrustat med tre kameror. Tre bilder av HeLa celler färgas med falloidiner konjugerade till blå, grön och röda färgämnen var i genomsnitt (figur 6A). Referensbilden består av 3 kanaler med 76 Z-skivor, som var och en består av 1 024 x 1 024 pixlar. Mätning av kromatiska skift med Chromagnon utan lokal justering krävs 194 s på Mac-systemet som beskrivs ovan. Parametern tillämpades på en målbild som består av 3 kanaler med 73 Z-segment, som var och en består av 1 024 x 1 024 pixlar. Generering av den justerade filen tog 25 s. XZ-vyn visar felaktiga kanalpositioner längs Z:n och något längs X-riktningarna(bild 6A,C),men denna felregistrering korrigerades efter justering (figur 6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> Bild 5: Ett exempel på anpassning till en överhörning referensbild. HeLa celler var färgas med DAPI för DNA (visas i magenta), Alexa Fluor 488 (visas i gult) för nukleära kuvert, och Alexa Fluor 555 (visas i blått) för mikrotubuli. Bilder förvärvades av 3D bredfältsmikroskopi med en enda kamera och deconvolved. (A,B) En representativ överhörning referensbild med DAPI-utsläpp, före och efter justering av Chromagnon. Tre färgkanaler visas som överdragna. (C,D) En optisk del av 3D-stacken i tre kanaler före och efter justeringen. Axiell kromatiska aberration är uppenbar vid anaphase bron visas av pilspetsar. Skalan bommar på panel A indikerar 5 μm för alla paneler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> Figur 6: Ett exempel på anpassning till en biologisk kalibreringsreferensbild Bilder förvärvades med 3D-SIM utrustad med tre kameror. (A,B) En referensbild i genomsnitt från tre bilder före(A)och efter(B)justering. HeLa celler var färgas med falloidin konjugerade med Alexa Fluor 405, 488 eller 594. (C,D) Målbilden före (C) och efter(D)justering. HeLa celler var färgas med DAPI för DNA (visas i magenta), Alexa Fluor 488 (visas i gult) för nukleära kuvert, och Alexa Fluor 594 (visas i blått) för mikrotubuli. Skalan bommar på panel A indikerar 5 μm för alla paneler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Korrigering av kromatiska förändringar i tredimensionella (3D) flerfärgsfluorescensmikroskopibilder är avgörande för kvantitativa dataanalyser. Detta protokoll är utvecklat för att mäta och korrigera kromatiska förändringar i biologiska prover genom förvärv av lämpliga referensbilder och bearbetning med öppen källkod, Chromagnon.

Hög noggrannhet korrigering av 3D kromatiska förändringar i en ålder av super-resolution biologisk avbildning med chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Marsh korallmikroskopi bilder innehåller kromatisk Shift i tre dimensioner. Det försämrar colocalization analys av högupplösta bilder. Det är i allmänhet svårt att ta bort Chromatic Shift härstammar från ett biologiskt prov själv, kan vår metod korrigera kromatisk förskjutning i ett biologiskt prov med hjälp av separat förvärvade referensbilder.Demonstrera förfarandet kommer att Takako Koujin en tekniker från min grupp. Börja med sådd 2,5 gånger 10 till den femte healer celler på en 35 millimeter glas botten skålen och odla dem i en koldioxid inkubator. Efter 24 timmars inkubation ersätt mediet med två milliliter på 3,7%formaldehyd i PBS och blanda försiktigt.Fixa försäljningen i 15 minuter vid rumstemperatur på en roterande plattform. Tvätta cellerna tre gånger med två milliliter PBS i fem till 10 minuter. Permeabilisera dem med två milliliter punkt 1%prova nästa 100 i PBS medan roterande och upprepa tvättar med PBS.Färga sedan cellerna med hjälp av ett standardprotokoll för antikroppsfärgning enligt beskrivningen i textmanuskriptet. För att få en referensbild av överhörningsreferens för widefieldmikroskopi, tillsätt två milliliter punkt fem mikrogram per milliliter Dappy för att stanna i DNA. Låt cellerna på den roterande plattformen vara kvar i 30 minuter.Byt sedan ut lösningen mot 100 mikroliter av monteringsmedium För att få en referensbild av biologisk kalibreringsreferens för någon form av mikroskopi, inklusive konfokal och superupplösningsmikroskopi. Fix cellerna som tidigare beskrivits, och förbereda stamlösningen ett fluorescerande färgämne konjugerat phalloidin i 1,5 milliliter metanol. Tillsätt phalloidin i PBS vid en utspädning av en till 100 för Alexa golv 405 en till 1000 för Alexa golv 488 och en till 200 för Alexa golv 594.Tillsätt en milliliter av lösningen till cellerna och inkubera dem i 30 minuter medan du roterar. Tvätta cellerna tre till fem gånger med två milliliter PBS. Byt sedan ut PBS:en mot 100 mikroliter monteringsmedium.För att förvärva fluorescensbilder med hjälp av widefield mikroskopi placera målprovet på mikroskopet i bildhanteringsprogrammet, öppna design och köra experiment fönstret, ställa in lämpligt Z steg och välj de blå, gröna och röda kanaler. Lägg till bildfilnamnet och påbörja bildtagningen i fliken Kör. Att förvärva överhörning referensbilder för mätning Kromatiska Skift i provet välj excitation ljus endast för Dappy och se till att använda exakt samma steg position och Z höjd som för målet provet.Alternativt, att använda en ljus fältbild som referens plats till målprovet på det breda fältet mikroskop och förvärva en fluorescens bild av målet i blått, grönt och rött kanaler. Sedan förvärva ljusa fältbilder av målet i blått, grönt och rött kanaler på exakt samma scenposition och med hjälp av samma Z-höjd. Att förvärva fluorescens bilder med hjälp av super upplösning mikroskopi, såsom 3D-sim placera målet provet på mikroskopet och förvärva en fluorescens sim bild av målet i blå, grön och röda kanaler.Sedan rekonstruera super löst bild. Nästa plats provet fläcken med multicolor phalloidin på en 3D sim mikroskop. Och skaffa flera fluorescens sim bilder som den biologiska kalibrering referensbilder på punkt steg positioner, sedan rekonstruera super lösta bilder.Använd en webbläsare för att ladda ner den nyaste binära utgåvan av Chromagnon. Extrahera programmet och sätta den körbara filen på en bekväm plats. Dra och släpp referensfilerna för antingen överhörning höger fält eller biologiska referenser kalibrering till referensrutan eller klicka på referensfiler för att öppna en fil väljare dialog.Om programmet ber att installera en Java Development Kit, tryck Ja, och navigera till den nedladdade sidan. Hämta sedan och installera JDK för operativsystemet enligt instruktionerna. Dra och släpp målfilerna av antikroppsfärgning i målrutan.Välj ett utdatabildformat och ange suffixet för utdatafilnamnet. För överhörningsreferensbilder med hög signal-brus-förhållande. Välj projektion från vallistan över lokal justera och använd en minsta fönsterstorlek på 60.För en multipel biologisk kalibrering referensbilder kontrollera genomsnittliga referenser alternativet Och välj ingen för lokal justera, klicka sedan på Kör alla för att starta mätningar. Om du vill vara säker på att mätningen utfördes korrekt drar och släpper du referensbilderna i referensrutan och målrutan. Kör sedan programmet och verifiera att bilderna är perfekt överlappade.Kromatisk Skiftkorrigering i widefieldmikroskopi kan utföras med hjälp av en överhörningsreferensbild. Denna bild erhölls med ett brett l mikroskop utrustad med en enda kamera. Fluorescensutsläpp från Dappy användes som referens för att korrigera de blå, gröna och röda kanalerna.Efter justering med Chromagnon den kromatiska Shift och referensbilden korrigerades. När justeringsparametern applicerades till uppsätta som mål avbildar vid Chromagnon DNAEN och anaphasen överbryggar, som ses felaktigt förutom det kärn- kuvertet, för justering visas som förväntat insida kuvertet. Kromatisk Skiftkorrigering av en 3D-simbild kan utföras med hjälp av en biologisk kalibreringsreferensbild.Tre 3D sim bilder av HeLa celler färgas med phalloidins konjugerade till blå, gröna och röda färgämnen var averged och den kromatiska Shift mättes av Chromagnon. Efter justering kromatiska Shift och referensbilden korrigerades. Parametern för justering tillämpades på en målbild.XZ-vyn visar felaktig kanalposition längs Z och något längs X-riktningarna, som korrigerades efter justering. För bästa prestanda är det viktigt att erhålla referensbilder under samma förhållanden och tidpunkten som en målbilder.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter till stöd i Visualisering av Eye Imaginal skiva i Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Snabb Homogen detektion av biologiska analyser med magnetkamera System Modulation biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studera age-dependent genomisk instabilitet med S. cerevisiae Kronologisk Livslängd Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-upplösning avbildning av de bakteriella Division Maskin

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prover för Optimera STORM Super-resolution Mikroskopi

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-upplösning avbildning av Cytokinetic Z Ring i levande bakterier Använda Snabb 3D-Structured Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...