Name: high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

Bu çalışma JSPS KAKENHI Hibe Numaraları JP19H03202 tarafından A.M., desteklenmiştir JP18H05528 ve JP17H03636 T.H., ve JP17H01444 ve JP18H05533 H.Y. L.S. için Welcome Trust Stratejik Ödülleri 091911 ve 107457/Z/15/Z fon tarafından destek kabul Mikron Oxford gelişmiş görüntüleme.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy.">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).</li><li>Gr&#252;nwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+&#946;-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport.">In vivo imaging of labelled endogenous &#946;-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy.">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li><li>M&#252;ller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Scanning+Microscopy.">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li><li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerin,+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy,+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane.">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li><li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies.">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+green+fluorescent+protein.">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li><li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red.">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Renk düzeltme prosedürü doğruluk ve çaba arasında bir dengedir. Gereksiz çabaları kaydetmek için, çalışmanız için ne kadar doğruluk gerektiğini bilmek daha iyidir. Konvansiyonel geniş alan (canlı) görüntüleme için en yüksek doğruluk gerekli olmayabilir ve bu nedenle, parlak alan referans görüntüleri genellikle renk değişimini düzeltmek için yeterlidir. Benzer şekilde, görüntüleme durumu ve ortam sabit olduğunda, biyolojik kalibrasyonun tekrar tekrar kullanılması zamandan tasarruf sağlayacaktır. Öte yandan, son derece doğru bir kayıt isteniyorsa, yüksek kaliteli crosstalk veya biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri gereklidir. En iyi performans için, referans görüntüleri mümkün olduğunca hedef görüntüler olarak benzer koşullar ve zamanlamaları ile elde edilmelidir. Hem referans hem de hedef görüntüler aynı mikroskopi ile elde edildiği sürece, daha yüksek uzamsal çözünürlük düzeltme doğruluğunu artıracaktır. Deconvolution hem referans hem de hedef görüntüler için kullanılabilirse, düzeltmeden önce bunu uygulamak düzeltme doğruluğunu artırabilir. Ayrıca, en iyi performans için optik (Z) eksenine ait örnekleme teoremi, hassas alt piksel enterpolasyonu için hem referans hem de hedef dosyasında gerçekleştirilmelidir (protokol adımı 2.1.3).
Kromatik değişimin düzeltilememesi yanlış sonuçlara yol açar. Ayrıca, yanlış kalibrasyon kullanarak bile kromatik vardiya yerine bunları düzeltmek daha kötü olabilir, ve bu nedenle kaçınılması gerekir. Hataların olası nedenlerini ve bunların ortak çözümlerini Tablo 2'deözetledik. Bir hatanın nedenini incelemek için öncelikle, referans görüntüdeki renk değişiminin tam olarak düzeltilip düzeltilmeyişecenin görsel olarak kontrol edilmesi gerekir (protokol adım 3.12). Çoğu hata referans görüntülerin kalitesinden kaynaklanmaktadır ve Tablo 2'dekiaçıklamalara göre kolayca giderilir. Referans görüntülerin kalitesine ilişkin olarak, tüm görüş alanı örnekle doldurulmamışsa küresel hizalamanın doğruluğunun azaldığını belirtmek önemlidir (Şekil 7, Tablo 2). Şekil 7A'dagösterilen iyi örnekle karşılaştırıldığında, Şekil 7B'de gösterilen kötü örnek, sol üst bölgede yalnızca üç nükleer zarf içerir ve Chromagnon bu görüntünün bir bölümünü hizalamayı başaramaz. Bunun nedeni, Chromagnon'un küresel hizalama yönteminin, döndürme ve büyütme farklılıklarını yüksek doğrulukla ölçmek için görüş alanını dört bölgeye(Şekil 7C)bölmesidir3. Bu yöntem, doğru çalıştırılırsa, günlük polar dönüşümü ve simpleksyöntemleri3 gibi diğer doğrusal yöntemlerden daha doğru bir sıradır. Dört bölgeden herhangi biri kullanılamıyorsa, Chromagnon daha az etkili doğrusal yöntemlere geçecektir. Bu nedenle, en iyi performans için Şekil 7B ve Şekil 7C'de gösterilen örnekler istenmez ve dört bölge nesnelerle doldurulmalıdır. Kullanıcılar, günlük dosyasına bakarak görüş alanının herhangi bir kuadratik bölgesinin ölçülemez olup olmadığını kontrol edebilir ("Chromagnon.log"; bkz. protokol adımı 3.10). Neyse ki, bu sorun kolayca birden fazla biyolojik kalibrasyon görüntüleri ortalama veya crosstalk veya parlak alan referans görüntüleri(Tablo 2)için yerel hizalama kullanarak aşılabilir. Referans görüntülerinin düzeltilememesi durumunda, hedef görüntülerin düzeltilmemesi nin belirlenmesi daha zordur. Dosya biçimlerindeki farklılıklar, görüntüleme koşulları, görüntüleme zamanlamaları, referans ve hedef görüntüler arasındaki görüntüleme/hizalama yöntemleri(Tablo 2)gibi hatalar ortaya çıktığından, kullanıcılar hedef görüntülerden farklı koşullarda/zamanlamalarda elde edilen referans görüntülerini kullanırken her zaman dikkatli olmalıdır. Bazı örnek görüntüler, iyi ve kötü örnek görüntülerin somut bir fikrini elde etmek için test<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)</a>için kullanılabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sorun</td>
			<td>Neden</td>
			<td>Çözüm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Başvuru görüntüsünü düzeltemedi</td>
			<td>Düşük kontrast</td>
			<td>Mümkünse daha yüksek kontrastlı görüntü elde edin. Parlak alan referans görüntüsü kullanılırsa, hücrenin daha yüksek kontrastını elde etmek için görüntüyü su tabanlı bir çözeltide yeniden edinin. Alternatif olarak, hesaplamalı gürültü azaltma (örneğin Gaussian filtreleme) uygulamayı deneyin. Gürültüye karşı daha hassas olan yerel hizalamayı kapatın.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Alakasız görüntülerin kirlenmesi</td>
			<td>Mümkünse örnekteki ilgisiz görüntülerin kaynağını kaldırın. Crosstalk referans görüntüleri için, hedef görüntüler için kullanılan boyaların uyarma spektrumlarını kontrol edin. Boyalar bir crosstalk görüntüsünün edinimi sırasında heyecanlıysa (örneğin Alexa Fluor 568 veya 594), diğer boyaları düşünün (örneğin Alexa Fluor 555). Kamera çipindeki tozlar belirgin bir kanal farkı oluşturuyorsa, kamera çipini temizleyin veya hesaplamalı düz alan yöntemi kullanın.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Kozmik ışıntarafından yapılmış son derece parlak bir nokta</td>
			<td>Mümkünse görüntüyü yeniden edinin. Alternatif olarak, hesaplamalı gürültü azaltma (örneğin, Ortanca veya Gaussian filtreleme) uygulamayı deneyin.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dekonvolution eserler (eksenel ve lateral kenarlarda yapay sinyaller)</td>
			<td>Deconvolution sonra kenar piksel veya Z bölümleri kırpın. Bir taraf kesilmişse, görüntü merkezini korumak için diğer taraf da kesilmelidir.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Z adım boyutu çok seyrek</td>
			<td>Protokol 2.1.3'te yazıldığı gibi Nyquist kriterini yerine getirmek için bir Z yığını alınmalıdır.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Optik sapma</td>
			<td>Küresel sapma, kullanıcıların neden olduğu en büyük sapmadır. Numune için doğru objektif lensi seçin ve 170 μm'lik bir kapak kalınlığı kullanın. Objektif lens bir düzeltme halkası ile donatılmışsa, odaktan en yüksek floresan sayısının elde edildiği konumu bulmak için ayarlayın. Düzeltme halkası olmayan bir yağ daldırma hedefi durumunda, odaktaki floresan sayısını artıran daldırma yağının kırılma indeksini ayarlayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Görüş alanı doldurulmamış (Res. 7)</td>
			<td>Biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri durumunda, ortalama birçok görüntü. Çapraz konuşma veya parlak alan referans görüntüleri söz konusu olduğunda, yerel hizalamayı kullanın.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Tanımlanamayan bir yazılım hatası</td>
			<td>Sorunu GitHub<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a> aracılığıyla bildirin
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hedef görüntü düzeltileme</td>
			<td>Görüntü dosyasının meta verileri kaybolur</td>
			<td>Tam meta veriler içeren özgün mikroskop dosya biçimini kullanın ve işlemeden önce çok sayfalı bir tiff dosyasına dönüştürmeyi kaçının. Protokol 3.3'te yazıldığı gibi kanalların aynı sırasını kullanın.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Verilen mikroskopi için yanlış hizalama yöntemleri</td>
			<td>Biyolojik kalibrasyon referans görüntülerinden hedef görüntülere kadar ölçüm yaparken yerel hizalama yöntemini uygulamayın. Geniş alan mikroskopisi dışında çapraz konuşma referans görüntüleri kullanmayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Görüntüleme koşullarındaki farklılıklar</td>
			<td>Görüntüleme koşullarını, protokol 2.3.3'te yazıldığı gibi referans ve hedef görüntüler arasında sabit tutun.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Numune farklılıkları (coverslip dahil)</td>
			<td>Her zaman aynı montaj ortamını, coverslip'i (örn. 1.5H no) ve benzer bir odak derinliği kullanın.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Kalibrasyon son yapıldığından beri mikroskop kayması</td>
			<td>Her iki haftada bir kalibrasyon yapın. Sıcaklığı sabit tutun ve mikroskobun donanım sürüklenmesini önlemek için yüzen bir tablo kullanın.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Renk düzeltmesi için sorun giderme.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> Şekil 7: Referans görüntüleri örnekleri. GFP ve mCherry ile etiketlenmiş fisyon maya hücrelerinde nükleer zarf. Görüntüler geleneksel geniş alan mikroskobu ile elde edildi. Kromatik kaymalar, görüntülerin kendileri referans görüntü olarak kullanılarak yerel hizalama olmadan Chromagnon kullanılarak düzeltildi. Görüntüler daha sonra ayrıntıları göstermek için deconvolved edildi. (A) Görüş alanında birçok nesne ile iyi bir örnek. (B) Yalnızca sol üst köşedeki nesnelerle kötü bir örnek. Görüntünün belirli bir bölgesinde yanlış hizalama açıktır. (C) Dörtliki bölümden birinin (noktalı çapraz çizgilerle ayrılmış) boş olduğu istenmeyen bir örnek. A panelindeki ölçek çubuğu tam alan görünümü için 5 m, genişletilmiş görünüm için 1,25 m olduğunu gösterir ve tüm paneller için geçerlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu protokolde üç farklı referans türü(Tablo 1)açıklanmıştır. Bunlar arasında, crosstalk referans görüntüleri ve biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri daha dikkatli tartışma gerekir. Crosstalk referans görüntüleri için, örnekler DAPI veya Hoechst 33342 ile boyanmış ve gliserol veya ticari montaj medya monte verimli mavi hizalamak için kullanılabilir, yeşil, ve kırmızı kanallar. Benzer şekilde, Alexa Fluor 488 yeşil ve kırmızı kanalları hizalamak için kullanılabilir. Ancak, DAPI ve Hoechst dışında birçok mavi boyalar en yeşil ve kırmızı boyalar daha hızlı dimmer ve çürüme beri crosstalk floresan elde genellikle zordur. Ayrıca, modern boyaların emisyon spektrumları daha dardır, bu da bu yöntemle üçten fazla kanalın hizalanmasını zorlaştırır. Ayrıca bazı ortak kırmızı boyalar (örneğin, Alexa Un 568 ve 594, ama Alexa Fluor 555) bu mor ışık tarafından heyecanlı olabilir, mavi boyalar yüksek kontrastlı crosstalk görüntüleri elde önlemek ödenmelidir. Başka bir dezavantajı da, bu yöntemin uyarma ışık yollarının renk sapması çok renkli uyarmada ölçülemez, çünkü uyarma için sadece tek bir uyarma dalga boyu kullanılır(Tablo 1). En gelişmiş mikroskopi değiştirilmiş aydınlatma optik kullandığından, bu yöntemin uygulanması sınırlıdır. Yine de, yüksek düzeltme doğruluğu bu protokolde açıklanacak kadar avantajlıdır. Genel olarak, ağartma veya fototoksik etkileri önlemek için bir hedef görüntü sonra bir crosstalk görüntü alınmalıdır. Geniş alan modu ile gözlenen SMLM için, floresan boyalar görüntüleme sırasında ağartılmış olabilir gibi bir hedef görüntü elde etmeden önce bir referans görüntü elde edilmelidir.
Biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri, kullanıcıların ek numune hazırlama pahasına istenilen sayıda kanalı kolayca hizalayabilmelerini sağlar. Biyolojik kalibrasyon referans görüntülerinin bir diğer avantajı da, tüm görüş alanlarını doldurmaya yardımcı olan birden fazla başvurunun "ortalama" bulunmasıdır. Kalibrasyon numunesi farklı bir slaytüzerinde hazırlanırsa, bu yöntem görüntüleme koşullarında farklılıklar yaşayabilir. Bu sorunun çoğu, ticari odacıklı örtüler(Tablo 1)kullanılarak hem hedefler hem de referanslar aynı slayt üzerinde hazırlanırsa ve diğer görüntüleme koşulları protokol adım 2.3.3'te olduğu gibi sabit tutulursa bu sorunun çoğu çözülebilir. Bu durumda, crosstalk referans görüntüleri benzer bir düzeltme doğruluğu beklenebilir3. Burada gösterildiği gibi phalloidin kullanmak için protokol birden fazla renk ile tek bir hücresel yapı leke için en kolay yollarından biridir. Biyolojik kalibrasyon örnekleri hazırlamak için çok sayıda olası senaryo vardır. İmmünboyama için, bir örnek tek bir primer antikor ile etiketlenebilir ve ardından birden fazla rengin ikincil antikorları ile boyanabilir. Bu şekilde, tek bir hedef yapısı birden çok renkile etiketlenebilir. Alternatif olarak, 5-ethynyl-2'-deoksiuridin, "tıklayın" kimya etiketleri tarafından tespit yeni yüksek yoğunlukta birden fazla renkte SENTEZLENEN DNA, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi8. Canlı hücreler için, aynı yapıyı iki renkle etiketlemek için GFP veya mCherry'ye kaynaşmış bir genin iki kopyasını barındıran transgenik bir suşu hazırlamak yararlıdır. Genin kopya sayısı membran proteinleri için sıklıkla gözlenen kritik sayılsa, genin tek bir kopyası GFP ve mCherry ile birlikte kaynaştırılabilir(Şekil 7). MEOS218gibi fotodönüştürülebilir floresan proteinler, fotodönüşümlü veya fotodönüşümsüz her iki protein türünü elde etmek için orta derecede menekşe ışığını aydınlatarak da kullanılabilir. Düşük oksijen koşullarında, GFP de kırmızı19,,20yeşil bir fotodönüştürülebilir protein olarak kullanılabilir. Doğru kalibrasyon örneğinin seçilmesi böylece denemeyi daha sağlam hale getirecektir.

Çok renkli görüntüleme, farklı molekül veya yapıların mekansal ilişkisinin büyük ilgi gördüğü durumlarda biyolojik floresan mikroskopinin temel yönlerinden biridir. Renk sapması, dağılım nedeniyle polikromatik ışığın optik sapması, ilgi renkli nesnelerin görünür konumunu değiştirir. Benzer şekilde, her rengi elde etmeye adanmış birden fazla kamera ile donatılmış mikroskoplar, optik elemanfarklılıkları ve kanallar arasındaki kusurlu hizalama nedeniyle daha karmaşık renk kaymalarına sahiptir. Bu nedenle, bu tür renk değişimleri, kullanıcı tarafından açıkça düzeltilmediği sürece yanlış bir sonuca yol açabilir. Kromatik kaymalar, mikroskopinin çözümü klasik çözünürlük sınırı ile sınırlı olduğu sürece önemli bir sorun olmasa da, süper çözünürlüklü mikroskopi1'in son zamanlarda kiremit kaymalarının daha doğru düzeltilmesi gereğini ortaya koymuştur.
Çok renkli boncuk kalibrasyon slayt2kullanarak mikroskop sistemlerinin kromatik kaymaları ölçmek için yaygın bir uygulama olmuştur. Boncuk bazlı kalibrasyon yöntemi, mikroskobun tüm optiklerinden coverslip2yüzeyine doğru renk kaymalarını ölçmek için uygundur. Ancak bu yöntem, biyolojik ilgi örneklerindeki kromatik kaymaları ölçemez. Birçok biyolojik örneğin üç boyutlu (3D) olduğunu ve bu tür örneklerin kromatik kaymalarının kapak kaymasıyüzeyindekinden farklı olduğunu belirtmek önemlidir. Ayrıca, renk kaymaları görüntüleme koşulları ile değiştirmek2,3. Biz 3D biyolojik örneklerde kromatik kaymaları ölçülen ve renk kaymaları belirsizlik genellikle kadar 350 nm klasik çok renkli boncuk kalibrasyon yöntemi3olduğunu bulduk . Bu nedenle, renk kaymaları biyolojik numunelerde ilgi derinliğinde ve kullanılan görüntüleme koşullarında ölçülmalıdır.
Burada, biyolojik numunelerde kromatik kaymaları ölçmek ve yazılımımız Chromagnon3'ukullanarak bu vardiyaları düzeltmek için prosedürleri tanımlıyoruz. Biyolojik numunelerde kromatik kaymaları ölçmek için, yöntemimiz iki tür veri kümesi, bir "hedef" görüntü ve bir "referans" görüntü kullanır. "Hedef" görüntü ilgi çok renkli bir görüntü, örneğin, DNA, nükleer zarf ve mikrotübüller için boyanmış görüntüler. Genellikle böyle bir görüntüde renk kaymalarını ölçmek mümkün değildir. Bu nedenle, örnekteki renk kaymalarını ölçmek için adanmış bir "referans" görüntüye ihtiyacımız vardır. "Başvuru" görüntüsünün tek tanımı, aynı nesnenin çok renkli görüntüsüdür. Bu anlamda, çok renkli boncukgörüntü de referans görüntü türüdür. Burada, biyolojik numunelerde renk kaymalarını ölçmek için kullanılan üç farklı referans görüntü türünü tanımlıyoruz: "çapraz konuşma referans görüntüleri", "parlak alan referans görüntüleri" ve "biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri". Referans görüntünün türü, kullanılan mikroskobun türüne veya Tablo 1'deözetlendiği gibi gerekli düzeltme doğruluğuna bağlıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Karışma</td>
			<td>Parlak alan</td>
			<td>Biyolojik kalibrasyon (farklı bir slaytta)</td>
			<td>Biyolojik kalibrasyon (aynı slaytta)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doğruluka
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sade -lik</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uygulanabilir mikroskopi</td>
			<td>Geniş alan</td>
			<td>Geniş alan</td>
			<td>Tüm</td>
			<td>Tüm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yerel hizalamanın kullanılabilirliği</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: "+" sayısı artan derecelendirmeyi gösterir. Tek artı yaklaşık 50 nm ve üç artı 3D yaklaşık 15 nm olduğunu. b: Doğruluk değişken görüntüleme koşullarının ne kadar sabit tutulduğuna bağlıdır. c: Çok renkli boncuk örnekleri ile ölçülen yerel kalibrasyon protokol bölüm 4'te açıklandığı şekilde kombine edilebilir.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Referans görüntülerinin türünü seçerken parametreler.
"Crosstalk referans görüntüleri" en yüksek düzeltme doğruluğuna sahiptir ve3,4 (Tablo 1)gerçekleştirmek için nispeten basittir. Bunun dezavantajı, uyarma yollarındaki kromatik kaymaları ölçemememelerinden dolayı mikroskopi uygulamalarındaki sınırlamadır. Ayrıca, bu tür görüntüleri elde etmek için, mikroskop çok bantlı dikroik aynalar ve uyarma filtreleri veya ışık kaynaklarından bağımsız olarak kontrol edilen emisyon filtreleri ile donatılmış olmalıdır. Uygun mikroskopi konvansiyonel geniş alan mikroskobu, tek molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi foto-aktive lokalizasyon mikroskobu / stokstik optik rekonstrüksiyon mikroskopi (PALM / STORM)5,6 ve genleşme mikroskobu7 geniş alan mikroskopisi ile gözlenen içerir. Hedef numunenin kendisinden bir çapraz konuşma referans görüntüsü elde edilir. Gerekli tüm kanallarda elde edilen bir boyanın çapraz konuşma (bleed-through) floresan bir görüntüsüdür. Floresan emisyon her zaman uzun dalga boylarına doğru genişler, bu nedenle en kısa emisyon dalga boyuna sahip boyalar, uzun dalga boylarındaki kanallarda çapraz sap floresan elde etmek için heyecanlanırlar. Örneğin, örnek mavi, yeşil ve kırmızı ile boyandığında, yalnızca mavi boya heyecanlanır ve emisyon ışığı mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda elde edilir. Bu protokolde, 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile boyanmış DNA çapraz sap floresan elde etmek için kullanılmıştır.
"Parlak alan referans görüntüleri" "crosstalk referans görüntüleri" için daha kolay ve daha az fototoksik bir alternatif ama en az doğru3 (Tablo 1)vardır. Bunlar, hedef görüntüde kullanılan tüm renk kanallarında elde edilen hedef örneğin parlak alan görüntüleridir.
"Biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri" hem uyarma hem de emisyon yollarında renk kaymalarını ölçebilme yeteneği nedeniyle her türlü mikroskopiye uygulanabilir olma avantajına sahiptir3,8 ( Tablo1). Uygun mikroskopi geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu, ışık sayfası mikroskobu, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED)9, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)10, Airyscan / SORA11,12, SMLM toplam iç yansıma floresans (TIRF) modu ile gözlenen, Olympus süper çözünürlük (OSR)13, vb. içerir. Biyolojik kalibrasyon referans görüntüsü, hedef numune olarak benzer şekilde hazırlanmış, ancak birden fazla renkte tek bir yapının boyanarak bir kalibrasyon örneğinden elde edilir. Düzeltme doğruluğu en süper çözünürlüklü mikroskopi çözünürlüğü öne çıkmaktadır ve biyolojik kalibrasyon örneği hazırlanması nispeten basit olabilir. Başka bir avantajı "ortalama" birden fazla referans görüntüleri için kullanılabilirliği. Bu nedenle, tek tek görüntüler renk değişimleri ölçümü için zayıf bilgi içerse de, bilgi içeriği birden çok görüntü nün ortalaması ile artırılabilir. Doğruluk görüntüleme koşullarının ne kadar sabit tutulduğuna bağlıdır. Bu bağlamda, hem hedef hem de referans örnekleri aynı slaytta olduğunda, örneğin 8 kuyulu odacıklı tulum(Tablo 1, en sağ) kullanılarak en iyi performans elde edilir. Bu protokolde, phalloidin üç renk ile boyanmış aktin biyolojik kalibrasyon olarak kullanılmıştır.
Bir referans görüntü elde edildikten sonra, kromatik kayma ölçülür ve bizim yazılım Chromagnontarafından düzeltilir. Chromagnon'un kromatik kaymaları ölçebileceği ve düzeltebileceği kanal, Z bölümleri ve zaman dilimlerinin sayısında herhangi bir sınırlama yoktur. Kromatik kaymaları iki adımda ölçer. İlk adım, X, Y, Z eksenlerinde çevirinin "global" veya "affine" hizalama parametrelerini, X, Y, Z eksenleri boyunca büyütmeve Z ekseni etrafında dönmeparametrelerini kazanır. Küresel hizalamanın hesaplama doğruluğu 3D'de ~16 nm ve 2B'de ~8 nm'dir. İkinci adım, daha yüksek bir doğruluk elde etmek için yansıtılan görüntülerde isteğe bağlı 2D yinelemeli "yerel hizalama"dır. Yerel hizalama işleminde, görüntüler birden çok bölgeye bölünür ve bu yerel bölgelerdeki renk kaymaları ölçülür. Daha sonra, bölgeler daha da bölünür ve bölgedeki piksel sayısı en az piksel sayısına (genellikle 60 x 60 piksel) ulaşana kadar alt bölgelerdeki kromatik kaymalar yinelemeli olarak ölçülür. Elde edilen yerel hizalama eşlemi, genel hizalama parametresi ile birleştirilir ve elastik bir dönüşüm le hedef görüntüye uygulanır. Bu adımı takiben, hesaplama doğruluğu 3D'de ~14 nm ve 2D'de ~6 nm'ye yükseltilir. Referanstaki biyolojik yapı hedeftekilerden farklı olduğundan, yerel hizalama biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için uygun değildir(Tablo 1). Bu nedenle, biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için yalnızca küresel hizalama kullanılır.
Lokal kromatik değişimler iki kaynaktan kaynaklanır; mikroskop enstrümental lokal distorsiyon ve biyolojik yapısal inhomojenite. Mikroskop enstrümantal yerel distorsiyon sabit olduğundan, bu çok renkli boncuk referans örnek ölçülebilir ve sabit bir parametre olarak düzeltilir. Kromaton mikroskop enstrümantal lokal bozulma haritasını ve biyolojik kalibrasyonlardan küresel hizalama parametrelerini birleştirebilir(Tablo 1). Bu yöntem kullanılarak, biyolojik kalibrasyonun ortalama doğruluğunun ek 1−2 nm ile iyileştirilmesi beklenmektedir.
Burada, bizim yazılım Chromagnonkullanarak 3D floresan görüntülerin kromatik kaymaları düzeltmek için bir protokol açıklar , en kolay düşük ucundan en yüksek doğruluk için. HeLa hücrelerinin immünboyamasını örnek olarak kullanıyoruz ve 3Boyutlu geniş alan mikroskobu ve 3D SIM kullanarak gözlemledik. Birinci bölümde, hedef numunelerin ve biyolojik kalibrasyon örneklerinin nasıl hazırlanacağı açıklanmıştır. Protokolün bu bölümü araştırmanın belirli hedefleri için optimize edilmelidir. İkinci bölümde, mikroskoplar tarafından üç çeşit referans görüntü elde edilmesi yöntemlerini açıklıyoruz. Varsayım mavi, yeşil ve kırmızı kanallar elde etmekti, ancak kanal kompozisyonu araştırmanın belirli hedefleri ve mikroskop un kurulumları tarafından değiştirilmelidir. Mikroskop tek bir kamera veya birden fazla kamera ile donatılmış olup olmadığını fark etmez. Üçüncü bölümde, referans görüntüleri kullanarak hedef görüntünün kromatik kaymalarını ölçmek ve düzeltmek için yazılımımızı nasıl kullanabileceğimizi anlatıyoruz. Son olarak, dördüncü bölümde, bir mikroskop enstrümental lokal kalibrasyon kullanarak biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri tamamlamak için bir yöntem açıklar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 405 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16170078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>No. 1S HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Described in Ref 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody with Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-accuracy correction of 3d chromatic shifts in the age of super-resolution biological imaging using chromagnon

Kantitatif çok renkli floresan mikroskopisi, farklı dalga boylarında elde edilen renk kanallarının dikkatli uzamsal eşleşmesine dayanır. Renk sapması ve kameraların kusurlu hizalanması nedeniyle, her kanalda edinilen görüntüler kaydırılabilir ve büyütülebilir ve üç boyuttan herhangi birinde birbirlerine göre döndürülebilir. Klasik kalibrasyon yöntemi ile, kromatik kaymalar bir coverslip yüzeyine bağlı çok renkli boncuklar ile ölçülür ve bu tür kalibrasyon örnekleri renk kaymaları ölçmek için bir dizi yazılım mevcuttur. Ancak, renk sapması derinlik, gözlem koşulları ile değişim ve biyolojik örnek kendisi tarafından indüklenen, böylece ilgi örnek ve hacim boyunca renk kayması gerçek miktarının belirlenmesini engelleyen değişebilir. Daha yüksek doğrulukta kromatik kaymaların düzeltilmesi, özellikle sadece hafif renk kaymalarının nicel analizleri etkileyebileceği ve çok renkli görüntülerin yorumlanmasını değiştirebileceği süper çözünürlüklü mikroskopi için önemlidir. Biyolojik numunelerde 3Boyutlu kromatik kaymaları ölçmek ve düzeltmek için bir açık kaynak yazılımı Chromagnon ve beraberindeki yöntemler geliştirdik. Burada, biyolojik ilgi örneklerindeki kromatik kaymaları ölçmek için numune hazırlama, veri toplama ve yazılım işleme için özel gereksinimler içeren ayrıntılı bir uygulama protokolü salıyoruz.

Bir crosstalk referans görüntüsü kullanılarak kromatik kaydırma düzeltme örneği Şekil 5'tegösterilmiştir. Görüntü, tek bir kamera ile donatılmış geniş alan mikroskobu ile elde edildi. DAPI'den floresan emisyonu mavi, yeşil ve kırmızı kanalları düzeltmek için referans olarak(Şekil 5A,B)kullanılmıştır. Görüntü, her biri 256 x 256 pikselden oluşan 60 Z dilimden oluşan 3 kanaldan oluşmaktadır. Görüntüler renk kaymalarını ölçmeden önce dekonvolved edildi. Chromagnon kullanarak yerel kromatik vardiya ölçme Intel Core i7 (dört çekirdekli, 8-threads, 2.7 GHz), 16 GB RAM ve 1 TB flaş depolama ile mac 51 s aldı. Hizalama parametresi, referans görüntüsüyle tam olarak aynı sayıda voxel olan hedef görüntüye(Şekil 5C,D)uygulanmıştır. Hizalanmış dosyanın hazırlanması 3 s aldı. Hizalama işlemi sırasında kenar piksellerinin (Şekil 1C'dekikırpma kenar boşlukları onay kutusu) kırpığı sonucunda, voxel sayısı hizalamadan sonra azaltıldı(Şekil 5B, 51 Z dilimleri, 252 x 251 piksel). Anafaz köprüsündeki DNA (ok uçları ile gösterilir) hizalamadan önce nükleer zarfın dışında yanlış görülür(Şekil 5C, XZ görünümünü gösteren alt panelde belirgin), ancak hizalamadan sonra zarfın içinde beklendiği gibi(Şekil 5D).
Biyolojik kalibrasyon referans görüntüsünü kullanarak kromatik kayma düzeltmeörneği Şekil 6'dagösterilmiştir. Görüntüler üç kamera ile donatılmış bir SIM mikroskop ile elde edildi. Mavi, yeşil ve kırmızı boyalarla konjuge phalloidinlerle boyanmış HeLa hücrelerinin üç görüntüsü ortalaması na göre belirlenmiştir(Şekil 6A). Referans görüntü, her biri 1.024 x 1.024 pikselden oluşan 76 Z diliminden oluşan 3 kanaldan oluşmaktadır. Chromagnon kullanılarak yerel hizalama olmadan kromatik kaymaların ölçülmesi yukarıda açıklanan Mac sisteminde 194 s gereklidir. Parametre, her biri 1.024 x 1.024 pikselden oluşan 73 Z diliminden oluşan 3 kanaldan oluşan hedef görüntüye uygulandı. Hizalanmış dosyanın üretimi 25 s aldı. XZ görünümü Z boyunca ve X yönleri boyunca biraz yanlış kanal konumlarını gösterir(Şekil 6A,C) ancak bu yanlış kayıt hizalamadan sonra düzeltilmiştir (Şekil 6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> Şekil 5: Çapraz konuşma referans görüntüsüyle hizalama örneği. HeLa hücreleri DNA için DAPI ile boyandı (macenta gösterilir), Alexa Fluor 488 (sarı gösterilir) nükleer zarf için, ve Alexa Fluor 555 (mavi gösterilir) mikrotübüller için. Görüntüler tek bir kamera ile 3D geniş alan mikroskopisi ile elde edildi ve deconvolved. (A,B) Dapi emisyon kullanarak temsili bir crosstalk referans görüntü, önce ve Chromagnontarafından hizalama sonra . Üç renk kanalları overlaid olarak gösterilir. (C,D) Hizalamadan önce ve sonra üç kanalhalinde 3B yığının optik bir bölümü. Ok başları ile gösterilen anafaz köprüsünde eksenel renk sapması belirgindir. A panelindeki ölçek çubuğu tüm paneller için 5 μm'yi gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> Şekil 6: Biyolojik kalibrasyon referans görüntüsü ile hizalama örneği Görüntüler üç kamera ile donatılmış 3D-SIM ile elde edildi. (A,B) (A ) ve sonra (AB) hizalamadan önce üç görüntüden ortalama bir referans görüntü. HeLa hücreleri Alexa Fluor 405, 488 veya 594 ile konjuge phalloidin ile boyandı. (C,D) (C) ve sonrası (D) hizalamadan önceki hedef görüntü. HeLa hücreleri DNA için DAPI ile boyandı (macenta gösterilir), Alexa Fluor 488 (sarı gösterilir) nükleer zarf için, ve Alexa Fluor 594 (mavi gösterilir) mikrotübüller için. A panelindeki ölçek çubuğu tüm paneller için 5 μm'yi gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon at JoVE.com

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Üç boyutlu (3D) çok renkli floresan mikroskopi görüntülerinde kromatik kaymaların düzeltilmesi nicel veri analizleri için çok önemlidir. Bu protokol, uygun referans görüntülerin edinimi ve açık kaynak yazılım, Chromagnonile işleme yoluyla biyolojik numunelerde kromatik kaymaları ölçmek ve düzeltmek için geliştirilmiştir.

Chromagnon Kullanarak Süper Çözünürlüklü Biyolojik Görüntüleme Çağında 3D Kromatik Değişimlerin Yüksek Doğrulukdüzeltmesi

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Bataklık mercan mikroskobu görüntüleri üç boyutlu Kromatik Shift içerir. Bu, yüksek çözünürlüklü görüntülerin kolokalizasyon analizini bozar. Biyolojik bir numuneden kaynaklanan Kromatik Kayma'yı çıkarmak genellikle zordur, yöntemimiz ayrı olarak elde edilen referans görüntüleri kullanarak biyolojik bir numunedeki kromatik kaymayı düzeltebilir.Prosedürü gösteren Takako Koujin benim grubumdan bir teknisyen olacak. 35 milimetrelik cam alt çanak üzerinde beşinci şifacı hücrelere 2,5 kez 10 tohumlama ve bir karbondioksit kuluçka onları büyüyen başlayın. Kuluçka 24 saat sonra PBS% 3.7 formaldehit iki mililitre ile orta değiştirin ve yavaşça karıştırın.Dönen bir platformda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca satış düzeltin. Hücreleri beş ila 10 dakika boyunca iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. İki mililitre nokta %1 ile permeabilize 1, pbs'de sonraki 100'ü deneyin ve PBS ile yıkıntıları tekrarlayın.Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi standart bir antikor boyama protokolü kullanarak hücreleri lekeleyin. Geniş alan mikroskopisi için crosstalk referans bir referans görüntü elde etmek için, DNA kalmak için mililitre Dappy başına nokta beş mikrogram iki mililitre ekleyin. Hücreleri döner platformda 30 dakika bekletin.Daha sonra çözeltiyi 100 mikrolitre montaj ortamı ile değiştirerek konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi de dahil olmak üzere her türlü mikroskobuiçin biyolojik kalibrasyon referansının referans görüntüsünü elde edin. Daha önce açıklandığı gibi hücreleri düzeltmek ve stok çözüm bir floresan boya metanol 1.5 mililitre içinde phalloidin konjuge hazırlamak. PBS içine phalloidin ekleyin 1 00 Alexa zemin 405 bir 1000 Alexa zemin 488 ve 200 Alexa zemin 594 için bir seyreltme.Hücrelere çözeltinin bir mililitre ekleyin ve dönerken 30 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri iki mililitre PBS ile 3-5 kez yıkayın. Daha sonra PBS'yi 100 mikrolitre montaj ortamı ile değiştirin.Geniş alan mikroskobu kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için görüntüleme yazılımında hedef örneği mikroskoba yerleştirin, tasarım penceresini açın ve deneme penceresini çalıştırın, uygun Z adımını belirleyin ve mavi, yeşil ve kırmızı kanalları seçin. Çalıştır sekmesinde, görüntü dosyası adını ekleyin ve görüntülemeye başlayın. Örnekteki Kromatik Kaymaları ölçmek için çapraz konuşma referans görüntüleri elde etmek için uyarma ışığını yalnızca Dappy için seçin ve hedef örnekle aynı sahne konumu ve Z yüksekliği kullandığınızdan emin olun.Alternatif olarak, geniş alan mikroskobundaki hedef örneğe referans noktası olarak parlak bir alan görüntüsü kullanmak ve mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda hedefin floresan görüntüsünü elde etmek. Daha sonra aynı sahne pozisyonunda ve aynı Z yüksekliği kullanarak mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda hedefin parlak alan görüntülerini elde edin. 3D Sim gibi süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için hedef örneği mikroskoba yerleştirin ve hedefin mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda floresan sim görüntüsünü elde edin.Sonra süper çözümlenmiş görüntü yeniden. Sonraki yer 3D sim mikroskop üzerinde çok renkli phalloidin ile örnek leke. Ve nokta sahne pozisyonlarında biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri olarak birden fazla floresan sim görüntüleri elde, sonra süper çözülmüş görüntüleri yeniden.Chromagnon en yeni ikili sürümü indirmek için bir web tarayıcısı kullanın. Programı ayıklayın ve çalıştırılabilir dosyayı uygun bir konuma koyun. Çapraz konuşma nın sağ alanını veya biyolojik kalibrasyon başvurularını başvuru kutusuna sürükleyin ve bırakın veya dosya seçici iletişim kutusunu açmak için başvuru dosyalarını tıklatın.Program bir Java Geliştirme Kiti yüklemek isterse, Evet tuşuna basın ve indirilen sayfaya gidin. Daha sonra talimat verildiği gibi İşletim Sistemi için JDK'yı indirin ve kurun. Hedef kutusuna antikor boyama hedef dosyalarını sürükleyin ve bırakın.Çıktı görüntü biçimini seçin ve çıktı dosyası adı için sonek belirtin. Gürültü oranı yüksek sinyal ile crosstalk referans görüntüler için. Yerel hizalama nın seçim listesinden projeksiyon seçin ve en az 60 pencere boyutu kullanın.Birden çok biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için ortalama referanslar seçeneğini kontrol edin ve yerel hizalama için hiçbirini seçmeyin, ardından ölçümleri başlatmak için tümleri çalıştır'ı tıklatın. Ölçümün doğru yapıldığından emin olmak için, referans görüntülerini başvuru kutusuna ve hedef kutusuna sürükleyin ve bırakın. Ardından programı çalıştırın ve görüntülerin mükemmel bir şekilde örtüşen olduğunu doğrulayın.Geniş alan mikroskopisinde Kromatik Kayma Düzeltmesi çapraz konuşma referans görüntüsü kullanılarak yapılabilir. Bu görüntü tek bir kamera ile donatılmış geniş bir mikroskop ile elde edildi. Dappy floresan emisyon mavi, yeşil ve kırmızı kanalları düzeltmek için bir referans olarak kullanılmıştır.Chromagnon ile hizalandıktan sonra Kromatik Shift ve referans görüntüsü düzeltildi. Hizalama parametresi Chromagnon tarafından hedef görüntüye uygulandığında DNA ve anafaz köprüsü, hizalama zarfın içinde beklendiği gibi görünmeden önce nükleer zarfın dışında yanlış görülür. 3D sim görüntünün Kromatik Kaydırma Düzeltmesi biyolojik kalibrasyon referans görüntüsü kullanılarak gerçekleştirilebilir.Mavi, yeşil ve kırmızı boyalara konjuge phalloidinlerle boyanmış HeLa hücrelerinin üç adet 3Boyutlu sim görüntüleri ortaya çıktı ve Kromatik Kayma Kromatendonik tarafından ölçüldü. Hizalama dan sonra Kromatik Shift ve referans görüntü düzeltildi. Hizalama parametresi hedef görüntüye uygulandı.XZ görünümü, Z boyunca ve biraz da Hizalama'dan sonra düzeltilen X yol tarifi boyunca yanlış kanal konumunu gösterir. En iyi performans için, aynı koşullar altında referans görüntüleri ve hedef görüntüler olarak zamanlama elde etmek önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biology

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...