Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

ونحن نعترف كثيرا تييري غالي (مركز الطب النفسي وعلم الأعصاب، INSERM) لتوفير VAMP7-pHluorin plasmid. نشكر تارن دوونغ على المشورة بشأن التحليل الإحصائي وأعضاء مختبر GOUD لإجراء مناقشات مثمرة. الكتاب الاعتراف كثيرا الخلية والأنسجة التصوير مرفق (PICT - IBiSA @Burg ، PICT - EM @Burg وPICT - IBiSA @Pasteur) ونيكون مركز التصوير ، معهد كوري (باريس) ، عضو في فرنسا الفرنسية الوطنية للبحوث البنية التحتية - BioImaging (ANR10 - INBS - 04). وقد تلقت هـ.ل. الدعم من رابطة ابحاث السرطان (ARC) وتلقت P.M. التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie No 666003. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04)، وSlabex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038 ) وريديكس باريس للعلوم ولتريس (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)، وكذلك المركز الوطني لريشيرتشي ساينتفيك ومعهد كوري.

1- إعداد الخلايا الصغيرة
<ol><li>نقل الخلايا<ol>
<li>قبل يوم واحد من عملية الانتـرُف، بذور 2.5 × 106 خلايا hTERT-RPE1 في بئر واحد من 12 بئراً (2 × 2 سم) في 1 مل من المتوسط.</li>
		<li>في يوم transfection، وإعداد خليط transfection مع VAMP7-pHluorin plasmid (100 ميكرولتر من العازلة، 0.8 ميكروغرام من الحمض النووي، 3 ميكرولتر من خليط transfecti...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

رصدنا أحداث الزخراب من المقصورة الليسوسومية من قبل TIRFM تصوير الخلايا الحية من VAMP7-pHluorin في خلايا ميكروباتترن على شكل حلقة وأجرى تحليلا إحصائيا دقيقا للبارامترات المكانية لأحداث الزبيب. توظيف وظيفة K ريبلي تحولت واختبار إحصائي على أساس أقرب مسافة الجار، وأكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية ع?...

إكسوسيتوزيس هو عملية الخلوية العالمية التي الصمامات في vesicle مع غشاء البلازما وتطلق محتواها. يمكن للفتح إما أن يصهر تماما مع غشاء البلازما (الانصهار الكامل) أو إنشاء المسام الانصهار التي تبقى مفتوحة خلال فترة زمنية محدودة (قبلة وتشغيل)1. على سبيل المثال، يتم إطلاق البروتينات المركبة حديثاً في الوسط خارج الخلية من الفُيْنَسَة التي تأتي من مجمع غولجي. هذا المسار البيولوجي، anterograde هو بدائي، وخاصة في الكائنات الحية متعددة الخلايا، لافراز الببتيدات إشارة (على سبيل المثال، الهرمونات، الناقلات العصبية) ومكونات مصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال، الكولاجين)، وكذلك إلى نقل البروتينات عبر الغشاء إلى غشاء البلازما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث إفرازات من إندوسومات مختلفة: 1) إعادة تدوير الغدد الوسومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الميمبرين؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ (1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتين 2) الهيئات متعددة الأطراف (MVBs) لإطلاق الكوسومات؛ و 3) lysosomes للافراج عن الانزيمات البروتية. وقد تبين إفراز الغدد النابعة لتكون مهمة لthgrowth نيوريت، تشكيل pseudopodia، وإصلاح غشاء البلازما، وإشارات ATP تعتمد2.
لدراسة الزخراب على مستوى الخلية الواحدة، تم استخدام العديد من التقنيات. التصحيح المشبك يسمح للكشف عن أحداث اكسوسيتوزيس واحد مع دقة زمنية عالية في مجموعة واسعة من الخلايا الحية3. ومع ذلك، لا يوفر هذا الأسلوب معلومات حول ترجمة أحداث القذف، ولا من أي المقصورة يحدث. يسمح المجهر الإلكتروني بالتصور المباشر للأحداث واظهارية مع دقة مكانية عالية، وبالاقتران مع علم المناعة يوفر معلومات حول خصوصية المقصورات والجزيئات المعنية. ومن عيوب هذا النهج نقص المعلومات عن ديناميات العملية، فضلا عن عدم قدرتها على إجراء دراسات عالية الإنتاجية. 24- توفر أساليب التحليل المجهري الخفيف مثل التحليل المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM)، الذي يستغل الحقل المضيء لإلقاء الضوء على الفلوروفور في محيط الغطاء (100 نانومتر)، دقة زمنية ومكانية جيدة لدراسة أحداث القذف. ومع ذلك، هذه الطريقة متوافقة فقط مع الخلايا المتصّقة ولا يمكن تطبيقها إلا على الجزء البطني/السفلي من الخلايا.
لاحظ أن غشاء البلازما يكشف عن عدم تجانس كبير على أساس مجمعات لاصقة موجودة فقط في المناطق المحظورة. هذا التغاير يقيد، على سبيل المثال، امتصاص حروف رابطة مختلفة4. وبالمثل، فقد أفيد مؤخرا أن إفراز مجمع غولجي يتركز في "النقاط الساخنة" في غشاء البلازما5. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف أن بعض البضائع تفرز من خلال التركيز التصاق المرتبطة exocytosis6. وهكذا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لمسألة ما إذا كانت الأحداث exocytosis توزع عشوائيا في الفضاء، أو ما إذا كانت تتركز في مناطق محددة من غشاء البلازما. وقد اقترحت العديد من الأدوات الإحصائية على أساس وظيفة سبيلي K لاستكشاف هذه الأسئلة7،8،9. نهجنا يجمع بين هذه الأدوات مع micropatterning للسيطرة على شكل الخلية وغشاء البلازما غير متجانسة. بالإضافة إلى توفير وسيلة للتمييز بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة ، تسمح هذه التقنية أيضًا بالمقارنة عبر الخلايا والظروف المختلفة وتزيد من قوة التحليلات الإحصائية.
هنا نوظف مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيع المكاني لأحداث القذف من المقصورة الليسوسومية التي رصدها TIRFM التصوير الخلية الحية من VAMP7-pHluorin في شكل رنين micropattern تطبيع hTert-RPE1 الخلايا. وقد تأكد أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية8,9 وأن الأحداث exocytosis المعرض التجمع. ملاحظة, وجدنا أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير التصانية, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز النقاط الساخنة الإفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، فإن التصاق الخلية عزز التجمع. على الدوام، حدد تحليلنا المناطق المخصبة من الزخرفة التي كانت تقع على الحدود بين المناطق اللاصقة وغير الالتصاقية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

التصوير الحي للpHluorin الموسومة القابلة للذوبان N-ethylmaleimide الحساسة عامل ملحق البروتين REceptor (V-SNARE) بروتين الغشاء المرتبط Vesicle 7 (VAMP7) عن طريق مجموع المجهر الفلورية الداخلية الانعكاس (TIRFM) هو وسيلة مباشرة لاستكشاف إفراز من المقصورة lysosomal. الاستفادة من ثقافة الخلية على الأسطح micropatterned لتطبيع شكل الخلية، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لإجراء تحليل مكاني للأنماط الإفرازية. باستخدام وظيفة ريبلي K واختبار إحصائي يستند إلى أقرب مسافة الجيران (NND)، أكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية ولكن يظهر التجمع كبيرة. ملاحظة, تحليلنا كشفت أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير الالتصاق, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز بؤر ساخنة إفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، وجدنا أن التصاق الخلية يعزز التجمع. بالإضافة إلى المناطق اللاصقة وغير اللاصقة المحددة بدقة ، فإن الهندسة الدائرية لهذه الميكوروبات يسمح باستخدام الإحداثيات القطبية ، وتبسيط التحليلات. استخدمنا تقدير كثافة النواة (KDE) ووظيفة التوزيع التراكمية على الإحداثيات القطبية لأحداث الإزدِاد لتحديد المناطق الغنية من الزّب. وفي الخلايا الصغيرة ذات الشكل الحلقي، حدث التجميع عند الحدود بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة. ويوضح تحليلنا كيف يمكن استخدام الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيعات المكانية للعمليات البيولوجية المتنوعة.

تم تحليل الخصائص الزقة من أحداث القذف من lysosomes التي تصورها VAMP7-pHluorin10,11 في خلايا hTert-RPE1. خلايا hTert-RPE1 هي خلايا غير مُنقلة تعتمد بشكل جيد على الميكروتيناتينغ وقد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات السابقة المستندة إلى ميكروباتترن4،14</...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

التصوير الحي للزخات الليفية على الخلايا الصغيرة يسمح لك بالكمية المكانية لهذه العملية. التطبيع مورفولوجيا باستخدام micropatterns هو أداة متميزة للكشف عن القواعد العامة حول التوزيع المكاني للعمليات الخلوية.

قياس المعلمات االوقائية من إكسوسيتسيس الخلوية في الخلايا micropatterned

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

يوضح هذا البروتوكول كيفية التحقق من إفراز الخلية باستخدام التصوير الحي بواسطة المجهر TOF ويوفر أدوات للكشف عن أحداث التجمعات أو المناطق ذات النشاط العالي. باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا توليد الثقافات الخلية على الأسطح الصغيرة التي تطبيع انقسام الخلايا وبالتالي تسهيل نطاقات خاصة من الأحداث إفرازية. تفرز الخلايا مجموعة متنوعة من الجزيئات الكبيرة التي تلعب أدوارًا مهمة في تنظيم المناعة.في السرطان، إفراز تحريرها يؤثر على الإفراج عن الإنزيمات البروتية التي تسهل الغزو. سوف يمكننا القياس الكمي للافراز من فهم أفضل إفراز المتدهورة في السرطان والعمليات الحيوية الأخرى مثل هذا العرض المستضد. على الرغم من أن لدينا التصوير والتحليل البروتوكول هو واضح ، فإنه يتطلب توليد خلايا واحدة التي تنتشر بشكل جيد على قطعة من micropattern.في هذا الفيديو، سوف نوضح كيفية زراعة الخلايا على الأغطية الصغيرة وكيفية تصور وتحليل الأحداث السرية باستخدام الأدوات الإحصائية المكانية. لإعداد أغطية لmicropatterning، تنشيط الإيثانول تعقيم 25 ملليمتر الزجاج يغطي قطرها 25 تحت الضوء فوق البنفسجي العميق لمدة خمس دقائق. في حين يتم تنشيط الأغطية، إضافة واحد 30 قطرات ميكرولتر من البولي إيثيلين الكسب غير المشروع بولي إيثيلين جلايكول في coverlip على قطعة من فيلم البارافين داخل غرفة رطبة.في نهاية التنشيط، ضع غطاء السطح النشط على السطح أسفل على قطرات وتغطية غرفة رطبة لمدة ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الأغطية مرتين في الماء المقطر. في حين أن الأغطية هي التجفيف، وغسل قناع صور الكوارتز مرة واحدة مع الماء المقطر ومواحدة مرة مع الكحول.جفف قناع الصورة مع تدفق الهواء المصفى وفضح قناع الصورة كروم المغلفة الجانب تصل إلى الضوء فوق البنفسجي العميق لمدة خمس دقائق. في نهاية الإضاءة، إضافة قطرة 10 ميكرولتر من الماء على الجانب المغلفة الكروم من كل قناع الصورة ووضع جانب البولي إيثيلين جلايكول من كل غطاء على كل قطرة ماء. بعد إزالة أي ماء زائد، ضع غطاءً للفيلم على الشرائح لتجنب الجفاف.تعريض الجوانب المغلفة غير الكروم من أقنعة الصورة إلى ضوء فوق البنفسجي العميق لمدة خمس دقائق إضافية قبل إضافة المياه الزائدة إلى أقنعة الصورة لإزالة الأغطية. هذه الخطوة سوف تنتج بصمات micropattern على السطح. ثم احتضان الأغطية في محلول بروتين مصفوفة خارج الخلية على فيلم البارافين في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة تحت غطاء تدفق لارينار.لبذات الخلايا على سطح micropattern المعدة، في نهاية الحضانة، ووضع الأغطية في الجانب المغناطيسي حامل غطاء micropattern حتى وإضافة نمط على الفور المتوسطة إلى الأغطية. بعد إضافة الختم، شلّس الغطاءات مع الجهاز المغناطيسي قبل ملء حامل الغطاء بنمط إضافي. ثم أغلق الحامل بغطاء زجاجي.عندما تكون الخلايا جاهزة، إضافة 5 مرات 10 إلى 5 من الخلايا الظهارية الصباغ الشبكية الخالدة عبر العدوى إلى الأغطية واحتضان الخلايا في حامل لمدة 10 دقائق في الحاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، استخدم ماصة واحدة لpireate المتوسطة القديمة أثناء استخدام ماصة ثانية لغسل الخلايا خمس مرات مع المتوسطة الطازجة لكل غسل لإزالة الخلايا غير المرفقة وأية مصل البقر الجنين المتبقية. بعد الغسيل الأخير، ارجع الحامل إلى الحاضنة لمدة ثلاث ساعات للسماح بانتشار الخلية بالكامل.لتصوير أحداث القذف، ضع حامل الغطاء تحت مجهر الانعكاس الداخلي الكلي، وابحث عن خلية تعبر عن VAMP7-pHluorin تنتشر بالكامل. تغيير زاوية الليزر حتى يتم الوصول إلى زاوية الانعكاس الداخلي الكلي الفلورية التي تسمح للتصور من الأحداث exocytosis VAMP7-pHluorin وتنفيذ عملية استحواذ لمدة خمس دقائق على تردد متوافق مع معدل التناضح والمقياس الزمني. للحصول على إحداثيات التناضح، افتح فيلم حدث الإزراق المكتسب في فيجي وحدد يدوياً أحداث الداء الطارد عن طريق ظهور إشارة ساطعة تنتشر إلى الخارج.استخدام أداة نقطة للاحتفال مركز الحدث exocytosis واستخدام تحليل وقياس لقياس س و y الإحداثيات وكذلك الإحداثيات الزمنية. حفظ قياسات خلية واحدة في ملف نصي واحد. افتح الملف النصي في جدول بيانات وأزل كافة الأعمدة ما عدا الشريحة x و y-coordinate.بعد ذلك، استخدم الأداة البيضاوية وقياس لقياس المركز وقطره والحصول على س و إحداثيات ص وقطر فيريت لكل خلية. حفظ قياسات كافة الخلايا في ملف نصي واحد. افتح الملف النصي في جدول البيانات وأزل كافة الإحداثيات سوى x و y وأعمدة قطر Feret.ثم إضافة قياس نصف القطر لكل خلية، ثم الحصول على نصف القطر من قطر Feret لكل خلية. استخدم أداة الخط المستقيم لقياس سمك الحلقة الصغيرة لكل خلية. حفظ هذا القياس لكافة الخلايا في ملف نصي واحد، ثم تقسيم طول التصاق على نصف قطر الخلية لحساب طول التصاق تطبيع.بالنسبة للتحليل المكاني لخلية واحدة، قم أولاً بتثبيت حزمة RStudio ثم قم بتحميل الحزمة في RStudio. تشغيل الحزمة مع وظيفة ESA. سيتم فتح واجهة مستخدم، ثم حدد الدليل لملفات TXT لمجموعة البيانات ودليل لمؤامرة الإخراج.سيبدأ البرنامج النصي تلقائيًا وينجز التحليل، مع توفير ملفات PDF للمواقع المقابلة وملفات TXT التي تحتوي على النتائج الرقمية. داخل الخلية، يتم إخماد الأرض في التحقيق من قبل انخفاض عدد المواد الهية من lysosome، ولكن أثناء الخراج، pHluorin يبدأ في إصدار إشارة كما يزيد من pH بسبب إطلاق البروتون. تظهر إشارة pHluorin ذروة أثناء القذف الذي يمثل الإطلاق السريع للبروتونات الليفية ، يليه تسوس إشارة أسية يمثل الانتشار 2D للمسبار في غشاء البلازما.عادة، transfect خلد الخلايا الظهارية مصطبغة شبكية العين البشرية توضح نشاط إفراز lysosomal الهامة مع متوسط معدل الظهارة من 0.28 هيرتز. فمن الممكن تصور 2D توزيع الزخراب بواسطة تقدير كثافة النواة للكشف عن الاختلافات في الكثافة المحلية. هناك ثلاثة انحرافات محتملة عن العشوائية المكانية الكاملة: التجميع أو التشتت أو خليط من التجميع والتشتت.يمكن استخدام وظيفة ريبلي K لتقييم هذه الانحرافات. ملاحظة, أحداث القذف في منطقة غير لاصقة هي أيضا مجمعة تشير إلى أن جزيئات التصاق ليست الهياكل الوحيدة التي تحفز النقاط الساخنة في إفرازية في أغشية البلازما. رسم الرسم البياني لأحداث exocytosis وفقا لم ومعامل لخلية تمثيلية يكشف عن ذروة حول الحدود بين المناطق اللاصقة وغير لاصقة.التحليل المقترن يوضح أن كثافة السطح أقل في منطقة الالتصاق مما هي عليه في منطقة عدم الالتصاق، يحتمل أن يرجع ذلك إلى الانخفاض القوي في إفرازات في محيط الخلية. الجمع بين التصاق الخلية على micropatterns مع التحليل الإحصائي يسهل القدرة على تحديد كيفية تنظيم العمليات الخلوية المعقدة مثل إفراز في الفضاء. هناك حاجة إلى مزيد من العمل في المستقبل لتحديد الآلية الجزيئية التي تكمن وراء تجميع النشاط السري.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

قياس سبان الخميرة الحياة الزمني بواسطة خلايا ثمرة المسنين

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

إيماس التصوير في خلايا الشبكية مع القطبين الميكروسكوب TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

قياس التردد من ورم الخلايا باستخدام الحد من نشر زرع الخلايا في التخفيف اسماك الزرد مسانج

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

رسم الخرائط الزمانية المكانية في القدرة على الحركة في<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الاستعدادات للأمعاء

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

تحليل الحركية من انقسام الخلايا والتوسع: تحديد مقدار الأساس الخلوي للمناطق التنموية النمو وأخذ العينات في<em&gt; ذرة شامية</em&gt; أوراق

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...