Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
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我们非常感谢蒂埃里·加利（精神病学和神经科学中心，INSERM）提供VAMP7-pHluorin质粒。我们感谢Tarn Duong就统计分析提供法律意见，并感谢高德实验室成员进行富有成果的讨论。作者非常肯定细胞和组织成像设施（PICT-IBiSA @Burg、PICT-EM @Burg 和 PICT-IBISA @Pasteur）和尼康成像中心，居里研究所（巴黎），法国国家研究基础设施法国-生物成像（ANR10-INBS-04）的成员。H.L.得到癌症治疗协会（ARC）的支持，根据玛丽·斯考多夫斯卡-库里赠款协议第666003号，P.M.从欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新方案获得资助。这项工作得到了感染-ERA（ANR-14-IFEC-0002-04）、Labex CelTisPhyBio（ANR-10-LBX-0038）和伊德克斯巴黎科学与莱特雷斯（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）以及国家恢复科学中心和居里研究所的资助。

1. 微模式细胞的制备
<ol><li>细胞的转染<ol>
<li>转染前一天，种子2.5 x 106 hTERT-RPE1细胞进入12井板（2 x 2厘米）的一个井在1 mL的介质。</li>
		<li>在转染当天，用VAMP7-pHluorin质粒（100μL缓冲液，0.8μgDNA，3μL转染混合物）制备转染混合物。孵育10分钟。 注： VAMP7 是一个 lysosomal v -SNARE， 与发光的 pHluorin 标签融合。pHluorin探针被低pH淬火，但在外细胞形成质子释放和pHluorin开始发出信号<sup class="x...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. 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通过TIRFM活细胞成像VAMP7-pHluorin在环状微模式规范化细胞中监测出状细胞的外细胞细胞发生事件，对外细胞细胞事件的空间参数进行了严格的统计分析。使用转换的Ripley的K函数和基于最近邻域距离的统计测试，我们确认从裂酶体分泌不是一个随机过程,8，9。两项统计分析都令人信服地表明，外细胞增多事件表现出聚类（图2D和2G）。</st...

外细胞增多是一种普遍的细胞过程，囊泡与血浆膜融合并释放其含量。囊泡可以完全与等离子膜（完全融合）融合，或创建一个融合孔，在有限的时间内保持开放（亲吻和运行）1。例如，新合成的蛋白质从来自高尔吉复合物的囊泡释放到细胞外介质中。这种生物合成，反极通路是原始的，特别是在多细胞生物体，分泌信号肽（如激素，神经递质）和细胞外基质成分（如胶原蛋白），以及交通跨膜蛋白到血浆膜。此外，分泌物可能来自不同的内膜：1） 回收内膜，以重复使用跨膜蛋白;2） 多体体（MMB）释放外体;3） 用于释放蛋白糖解酶的糖体。内染色体分泌已被证明对神经土菌生长、伪波迪亚形成、血浆膜修复和ATP依赖信号2非常重要。
为了研究单细胞水平的外细胞病，已经采用了几种技术。贴片夹允许在各种活细胞3中检测具有高时分辨率的单一外细胞病事件。但是，此方法不提供有关外细胞增多事件的定位信息，也不提供它发生的隔间的信息。电子显微镜允许以高空间分辨率直接可视化外细胞事件，并结合免疫标签提供有关所涉及的隔间和分子特异性的信息。这种方法的一个缺点是缺乏关于过程动态的信息，以及它无法进行高通量研究。光显微镜方法，如总内部反射荧光显微镜（TIRFM），利用消逝场照亮光泳在覆盖唇（100纳米）附近，为研究外细胞增多事件提供了良好的时间和空间分辨率。然而，这种方法只与粘附细胞兼容，只能应用于细胞的腹体/下同部分。
值得注意的是，等离子膜揭示了基于仅在限制区域存在的粘合复合物的显著异质性。这种异质性限制，例如，不同配体4的吸收。同样，最近有报道说，从高尔吉综合体分泌物集中在等离子膜5的"热点"。此外，众所周知，某些货物是通过焦粘附相关的外细胞增多6分泌的。因此，应特别注意外细胞增多事件是否随机分布在空间中，或者是否集中在血浆膜的特定区域。根据里普利的K函数，提出了几个统计工具来探讨这些问题7，8，9。,97,我们的方法将这些工具与微模式相结合，以控制细胞形状和等离子膜异质性。除了提供区分粘合剂和非粘性区域的方法外，该技术还允许对不同的细胞和条件进行比较，并增加统计分析的能力。
在这里，我们使用各种统计工具来研究由 TIRFM 活细胞成像 VAMP7-pHluorin 在环状微模式规范化 hTert-RPE1 细胞中监测的异细胞细胞学事件的空间分布。经证实，来自利索索姆的分泌物不是随机过程8,8，9，外细胞增多事件表现出聚类。值得注意的是，我们发现外细胞增多事件也聚集在非粘附区域，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。然而，细胞粘附确实增强了聚类。一致地，我们的分析确定了位于粘合剂和非粘剂区域之间的边界的外细胞增多区域。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

通过总内部反射荧光显微镜（TIRFM）对pHluorin标记可溶性N-乙酰胺-敏感因子附件蛋白REceptor（V-SNARE）囊量相关膜蛋白7（VAMP7）进行实时成像，这是从溶酶体分泌物的一种简单方法。利用微模型表面的细胞培养来使细胞形状正常化，利用各种统计工具对分泌模式进行空间分析。使用 Ripley 的 K 函数和基于最近邻域距离 （NND） 的统计测试，我们确认来自裂酶体分泌不是随机过程，而是显示显著的聚类。值得注意的是，我们的分析显示，外细胞增多事件也聚集在非粘附区，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。尽管如此，我们发现细胞粘附能增强聚类。除了精确定义的粘合剂和非粘性区域外，这些微模型的圆形几何形状允许使用极坐标，从而简化分析。我们使用内核密度估计（KDE）和外细胞病事件极坐标的累积分布函数来识别外细胞病的富集区。在环形微模式细胞中，聚类发生在粘合剂和非粘膜区域之间的边界。我们的分析说明了如何使用统计工具来调查不同生物过程的空间分布。

从VAMP7-pHluorin10、11hTert-RPE1细胞中可视化的异细胞病事件的时10,11空特征分析。hTert-RPE1细胞是非转化细胞，很好地采用微模式，在以往的基于微模式的研究4，14中被广泛使用。VAMP7 是一个 lysosomal v-SNARE15，在其 N 术语处被标记与超级黄道法林， 位于利索索姆的流明中。在细胞内，pHluorin探针被...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

在微模型细胞上对细胞外细胞的活成像允许这个过程的空间定量。使用微模式进行形态学规范化是揭示细胞过程空间分布的一般规则的杰出工具。

定量微模式细胞细胞外细胞异细胞的时态参数

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

该协议演示了如何使用 TOF 显微镜的实时成像来研究细胞分泌，并提供用于检测聚类事件或高活性区域的工具。使用此协议，我们可以在微模式表面上生成细胞培养，使细胞分裂正常化，从而促进分泌事件的特殊范围。细胞分泌各种大分子，在免疫调节中起重要的作用。在癌症中，解除调节的分泌会影响蛋白糖解酶的释放，从而促进入侵。分泌物的量化将使我们能够更好地了解癌症中的降解分泌物和其他动态过程，如抗原表达。尽管我们的成像和分析协议非常简单，但它需要生成在微模式上广泛传播的单个细胞。在这段视频中，我们将演示如何在微模式盖玻片上培养细胞，以及如何使用空间统计工具可视化和分析分泌事件。为准备微表光的盖玻片，在深紫外光下激活乙醇消毒直径为25毫米的玻璃盖玻片5分钟。在激活盖玻片时，在湿润室内的一块石蜡薄膜上加入一滴 30 微升聚硅氨酸嫁接聚乙烯二甘醇。在激活结束时，将活化表面侧的盖玻片向下放置到落液上，并覆盖湿润室，在室温下孵育一小时。在孵育结束时，用蒸馏水清洗盖玻片两次。当盖玻片干燥时，用蒸馏水清洗石英光面膜一次，用酒精洗涤一次。用过滤的气流干燥照片面罩，将照片面罩镀铬侧暴露在深紫外线下五分钟。在照明结束时，将一滴 10 微升水添加到每个照片面罩的镀铬侧，并将每个盖玻片的聚乙烯二醇侧放在每滴水上。去除多余的水后，在滑梯上放置薄膜盖，以避免脱水。将照片蒙版的非镀铬涂层面暴露在深紫外线下五分钟，然后向照片蒙版添加多余的水以去除盖玻片。此步骤将在表面上产生微模式印记。然后在潮湿腔室的石蜡膜上，在石蜡膜上孵育盖玻片，在层流罩下孵育一小时。对于细胞播种到准备好的微表图表面，在孵化结束时，将盖玻片放在磁性盖玻片架微表板侧向上，并立即在盖玻片中添加图案介质。添加密封件后，使用磁性设备固定盖玻片，然后用附加图案介质填充盖玻片支架。然后用玻璃盖合上支架。当细胞准备就绪时，将5倍10添加到第5个转染不朽视网膜色素上皮细胞到盖玻片中，并在细胞培养箱中孵育支架中的细胞10分钟。在孵育结束时，使用一个移液器吸吸旧介质，同时使用第二个移液器每次洗涤用新鲜介质清洗细胞五次，以去除非附着细胞和任何残留的胎儿牛血清。最后一次洗涤后，将支架返回孵化器三小时，以允许全细胞扩散。要成像外细胞增多事件，请将盖玻片支架置于总内部反射荧光显微镜下，并搜索表达 VAMP7-pHluorin 完全传播的细胞。改变激光的角度，直到达到总的内部反射荧光角度，允许VAMP7-pHluorin外细胞病事件的可视化，并在与外细胞病率和时间刻度兼容的频率下执行五分钟的采集。为了获得外细胞增多坐标，打开斐济获得的外细胞增多事件膜，通过向外传播的明亮信号的外观手动识别外细胞增多事件。使用点工具标记外细胞增多事件的中心，并使用分析和测量来测量 x 和 y 坐标以及时间坐标。将一个单元格的测量值保存在一个文本文件中。在电子表格中打开文本文件，并删除除切片 x 和 y 坐标列的所有内容。接下来，使用椭圆形工具和测量测量中心和直径，并获取每个单元的 x 和 y 坐标和 Feret 的直径。将所有单元格的测量值保存在一个文本文件中。打开电子表格中的文本文件，并删除除 x 和 y 坐标和 Feret 直径列外的所有内容。然后添加每个单元的半径测量值，然后从每个单元的 Feret 直径获取半径。使用直线工具测量每个单元的微模式环的厚度。将此测量值保存在一个文本文件中，然后将粘附长度除以单元格半径以计算规范化粘附长度。对于单个单元空间分析，首先安装 RStudio 的包，然后将包加载到 RStudio 中。使用 ESA 功能运行包。用户界面将打开，然后选择数据集 TXT 文件的目录和输出绘图的目录。该脚本将自动启动和执行分析，提供包含数值结果的相应绘图和 TXT 文件的 PDF 文件。在细胞内，探针中的地板被异体的低pH值淬火，但在外细胞形成过程中，随着质子释放，pH值增加，pHLOrin开始发出信号。pHluorin 信号在外细胞形成期间表现出峰值，表示利索体质子的快速释放，然后是指数信号衰减，表示等离子体膜上探针的二维扩散。通常，转染不朽的人类视网膜色素上皮细胞表现出重要的细胞分离活性，平均外细胞形成率为0.28赫兹。通过内核密度估计可以可视化外细胞病的二D分布，以显示局部密度的差异。与完全空间随机性有三种可能的偏差：聚类、分散或聚类和分散的混合。里普利的 K 函数可用于评估这些偏差。值得注意的是，非粘性区域的外细胞增多事件也聚集在一起，表明粘附分子并不是诱导血浆膜分泌热点的唯一结构。根据代表性细胞的模数绘制外细胞病事件的直方图，可发现粘合剂和非粘合区域之间的边界周围有一个峰值。成对分析表明，粘附区的表面密度低于非粘附区，可能是由于细胞外围外细胞病的显著减少。将微模式上的细胞粘附与统计分析相结合，有助于精确定位细胞过程（如分泌物）在空间中的调控方式。今后还需要做更多的工作来确定分泌活动聚类的分子机制。

Research

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