Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Vi anerkender i høj grad Thierry Galli (Center for Psykiatri og Neurovidenskab, INSERM) for at give VAMP7-pHluorin plasmid. Vi takker Tarn Duong for rådgivning om statistisk analyse og medlemmer af GOUD-laboratoriet for frugtbare diskussioner. Forfatterne anerkender i høj grad Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg og PICT-IBiSA @Pasteur) og Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem af den franske nationale forskningsinfrastruktur Frankrig-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. blev støttet af Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), og P.M. modtog støtte fra Eu's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) og Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) samt Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Curie.

1. Fremstilling af mikropatternede celler
<ol><li>Transinfektion af celler<ol>
<li>En dag før transfektion, frø 2,5 x 106 hTERT-RPE1 celler i en brønd af en 12 brønd plade (2 x 2 cm) i 1 ml medium.</li>
		<li>På transfektionsdagen forberedes transinfektionsblandingen med VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffer, 0,8 μg DNA, 3 μL transfektionsblanding). Inkuber i 10 min. BEMÆRK: VAMP7 er en lysosomal v-SNARE, sammensmeltet med et luminalt pHluorin-mærke. PHluorinsonden slukkes ved lav pH, men under ...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Vi overvågede exocytose hændelser fra lysosomalrummet ved TIRFM levende celle billeddannelse af VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserede celler og udførte en streng statistisk analyse af de rumlige parametre for exocytose hændelser. Ved hjælp af den transformerede Ripley's K-funktion og en statistisk test baseret på den nærmeste naboafstand bekræftede vi, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældigproces 8,,9. Begge statistiske analyse...

Exocytose er en universel cellulær proces, hvor en vesicle sikringer med plasmamembranen og frigiver dens indhold. Vesicle kan enten smelte helt sammen med plasmamembranen (fuld fusion) eller skabe en fusion pore, der forbliver åben i en begrænset periode (kiss-and-run)1. For eksempel frigives nysyntede proteiner i det ekstracellulære medie fra vesikler, der kommer fra Golgi-komplekset. Denne biosyntetiske, anterograde vej er ur, især i flercellede organismer, at udskille signalering peptider (f.eks hormoner, neurotransmittere) og ekstracellulære matrix komponenter (f.eks kollagen), samt at trafik transmembrane proteiner til plasmamembranen. Derudover kan sekreter forekomme fra forskellige endosomer: 1) genanvendelse endosomer med henblik på at genbruge transmembrane proteiner; 2) multivesicular organer (MVBs) til at frigive exosomer; og 3) lysosomer til frigivelse af proteolytiske enzymer. Endosomal sekretion har vist sig at være vigtigt for neurite udvækst, pseudopodia dannelse, plasma membran reparation, og ATP-afhængige signalering2.
At studere exocytose på enkelt celleniveau, flere teknikker har været ansat. Patch-clamp giver mulighed for påvisning af enkelte exocytose hændelser med en høj tidsmæssig opløsning i en bred vifte af levende celler3. Denne metode indeholder dog ikke oplysninger om lokalisering af exocytosehændelser, eller fra hvilket rum den forekommer. Elektronmikroskopi giver mulighed for direkte visualisering af exocytiske hændelser med høj rumlig opløsning, og i kombination med immunmærkning giver oplysninger om specificiteten af de involverede rum og molekyler. En ulempe ved denne tilgang er manglen på oplysninger om dynamikken i processen, samt dens manglende evne til at udføre høj-throughput undersøgelser. Lysmikroskopi tilgange såsom samlede interne refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM), som udnytter evanescent feltet til at belyse fluorophores i nærheden af coverslip (100 nm), giver god tidsmæssig og rumlig opløsning til at studere exocytose begivenheder. Men, denne metode er kun kompatibel med klæbende celler og kan kun anvendes på ventrale / ringere del af celler.
Bemærk, plasmamembranen afslører betydelig heterogenitet baseret på klæbende komplekser, der kun er til stede i begrænsede områder. Denne heterogenitet begrænserf.eks. Tilsvarende er det for nylig blevet rapporteret, at sekretion fra Golgi-komplekset er koncentreret på "hot spots" i plasmamembranen5. Desuden er det kendt, at visse laster udskilles gennem fokal-vedhæftning-associeret exocytose6. Der bør derfor lægges særlig vægt på spørgsmålet om, hvorvidt exocytosehændelser er tilfældigt fordelt i rummet, eller om de er koncentreret på bestemte områder af plasmamembranen. Flere statistiske værktøjer baseret på Ripley's K-funktion er blevet foreslået at undersøge dissespørgsmål 7,8,9. Vores tilgang kombinerer disse værktøjer med mikropattering til at styre celleform og plasma membran heterogenitet. Ud over at give et middel til at skelne mellem klæbende og ikke-vedhæftige områder, denne teknik giver også mulighed for sammenligning på tværs af forskellige celler og betingelser og øger styrken af statistiske analyser.
Her anvender vi en række statistiske værktøjer til at studere den rumlige fordeling af exocytose hændelser fra lysosomal rum overvåget af TIRFM levende celle billeddannelse af VAMP7-pHluorin i ringformet mikropattern-normaliseret hTert-RPE1 celler. Det blev bekræftet, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældigproces 8,9 og at exocytose begivenheder udviser klyngedannelse. Bemærk, at vi fandt, at exocytose begivenheder er også grupperet i ikke-vedhæftige områder, hvilket indikerer, at vedhæftning molekyler er ikke de eneste strukturer, der kan fremkalde hemmelighedsfulde hot spots på plasmamembranen. Ikke desto mindre, celle vedhæftning gjorde forbedre klyngedannelse. Konsekvent identificerede vores analyse berigede områder af exocytose, der var placeret ved grænsen mellem klæbemidlet og ikke-vedhæftige områder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Levende billeddannelse af pHluorin mærket Opløselig N-ethylmaleimid-følsomme-faktor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associeret membran protein 7 (VAMP7) ved total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM) er en enkel måde at udforske sekretion fra lysosomal rum. Drage fordel af cellekultur på micropatterned overflader til at normalisere celleform, en række statistiske værktøjer blev anvendt til at udføre en rumlig analyse af sekretoriske mønstre. Ved hjælp af Ripley's K funktion og en statistisk test baseret på den nærmeste nabo afstand (NND), bekræftede vi, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældig proces, men viser betydelig klyngedannelse. Bemærk, vores analyse viste, at exocytose begivenheder er også grupperet i nonadhesion områder, hvilket indikerer, at vedhæftning molekyler er ikke de eneste strukturer, der kan fremkalde sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Alligevel fandt vi, at celle vedhæftning forbedrer klyngedannelse. Ud over præcist definerede klæbende og ikke-vedhæftige områder, den cirkulære geometri af disse mikromaterialer tillader brug af polære koordinater, forenkle analyser. Vi brugte KDE (Kernel Density Estimation) og den kumulative fordelingsfunktion på polarkoordinater for exocytosehændelser til at identificere berigede områder af exocytose. I ringformede mikroceller forekom klyngedannelse ved grænsen mellem de klæbende og ikke-vedhæftige områder. Vores analyse illustrerer, hvordan statistiske værktøjer kan anvendes til at undersøge rumlige fordelinger af forskellige biologiske processer.

De spatiotemporale egenskaber exocytose hændelser blev analyseret fra lysosomer visualiseret af VAMP7-pHluorin10,11 i hTert-RPE1 celler. hTert-RPE1-celler er ikke-transformerede celler , der anvender godt til mikropatterning og har været flittigt anvendt i tidligere mikropatternbaseredeundersøgelser 4,14. VAMP7 er en lysosomal v-SNARE15, der blev mærket med super eklipti pHluor...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Levende billeddannelse af lysosomal exocytose på mikropatterned celler giver mulighed for en rumlig kvantificering af denne proces. Morfologi normalisering ved hjælp af mikropatterner er et fremragende værktøj til at afdække generelle regler om den rumlige fordeling af cellulære processer.

Kvantificering af spatiotemporale parametre for cellulær exocytose i mikropatterned celler

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Denne protokol viser, hvordan man undersøger cellesekretion ved hjælp af live-billeddannelse ved HJÆLP AF TOF-mikroskopi og indeholder værktøjer til registrering af klyngehændelser eller områder med høj aktivitet. Ved hjælp af denne protokol kan vi generere cellekulturer på mikropatternoverflader, der normaliserer celledeling og dermed letter de særlige områder af sekretoriske begivenheder. Celler udskiller en række makromolekyler, der spiller vigtige roller i immunregulering.I kræft, dereguleret sekretion påvirker frigivelsen af proteolytiske enzymer, der letter invasion. Kvantificeringen af sekretion vil sætte os i stand til bedre at forstå forringet sekretion i kræft og andre dynamiske processer såsom har antigen præsentation. Selv om vores billedbehandling og analyse protokol er ligetil, det kræver generering af enkelte celler, der er godt spredt på et stykke mikropattern.I denne video vil vi demonstrere, hvordan man kulturceller på micropattern coverslips og hvordan man visualisere og analysere sekretoriske begivenheder ved hjælp af spacial statistiske værktøjer. For at forberede coverslips til mikropattering, aktivere ethanol steriliseret 25 millimeter diameter glas coverslips under dybt ultraviolet lys i fem minutter. Mens coverslips er ved at blive aktiveret, tilsættes en 30 microliter dråbe polylysin graft polyethylenglycol per coverslip på et stykke paraffin film i et fugtigt kammer.Ved afslutningen af aktiveringen skal dækslerne sættes på dråberne og dække det fugtige kammer i en times inkubation ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes dækslerne to gange i destilleret vand. Mens coverslips tørrer, vaske en kvarts fotomaske én gang med destilleret vand og en gang med alkohol.Tør fotomasken med filtreret luftstrøm og udsæt fotomasken krom belagt side op til dybt ultraviolet lys i fem minutter. I slutningen af belysningen tilsættes en 10 mikroliter dråbe vand på krombelagt side af hver fotomaske og placere polyethylenglycol side af hver coverslip på hver dråbe vand. Når du har fjernet overskydende vand, skal du placere et filmdæksel over objektglassene for at undgå dehydrering.Udsæt de ikke-krombelagte sider af fotomaskerne til dybt ultraviolet lys i yderligere fem minutter, før du tilføjer overskydende vand til fotomaskerne for at fjerne dækslerne. Dette trin vil producere mikropattern aftryk på overfladen. Derefter inkuberes coverslips i en ekstracellulær matrix protein opløsning på paraffin film i et fugtigt kammer i en time under en laminar flow hætte.Ved cellesåning på den forberedte mikromønsteroverflade, skal dækslerne i slutningen af inkubationen sættes i en magnetisk dæksletholder mikromønsterside op og straks tilsættes mønstermedium til dækslerne. Når forseglingen er tilsætning, skal du immobilisere dækslerne med den magnetiske anordning, før dækholderen fyldes med ekstra mønstermedium. Luk derefter holderen med et glaslåg.Når cellerne er klar, tilsættes 5 gange 10 til den femte af de transfekterede udødeliggjorte retinale pigment epitelceller til coverslips og inkubere cellerne i holderen i 10 minutter i cellekultur inkubator. Ved inkubationens afslutning anvendes en pipette til at aspirere det gamle medium, mens der anvendes endnu en pipette til at vaske cellerne fem gange med frisk medium per vask for at fjerne de ikke-tilknyttede celler og eventuelle resterende føtale kvægserum. Efter den sidste vask skal holderen returneres til inkubatoren i tre timer for at tillade fuld cellespredning.For at afbilde exocytose hændelser, placere coverslip indehaveren under en total intern refleksion fluorescens mikroskop, og søge efter en celle, der udtrykker VAMP7-pHluorin, der er fuldt spredt. Skift vinklen på laseren, indtil en total intern refleksion fluorescens vinkel, der gør det muligt at visualisere VAMP7-pHluorin exocytose begivenheder er nået og udføre en fem-minutters erhvervelse med en frekvens kompatibel med exocytosis sats og tidsskala. For at opnå exocytose koordinater, åbne erhvervet exocytose begivenhed film i Fiji og manuelt identificere exocytosis begivenheder ved udseendet af et lyst signal, der spreder sig udad.Brug punktværktøjet til at markere midten af exocytose-hændelsen og bruge analyser og måle til at måle x- og y-koordinaterne samt den tidsmæssige koordinat. Gem målingerne af en celle i én tekstfil. Åbn tekstfilen i et regneark, og fjern alle kolonner med udsnittet x og y.Brug derefter det ovale værktøj og mål til at måle midten og diameteren og til at opnå x- og y-koordinaterne og Ferets diameter for hver celle. Gem målingerne af alle celler i én tekstfil. Åbn tekstfilen i et regneark, og fjern alle kolonnerne x og y-koordinat og Ferets diameter.Tilføj derefter radiusmålingen for hver celle, og hent derefter radius fra Ferets diameter for hver celle. Brug værktøjet med den lige linje til at måle tykkelsen af mikropatternringen i hver celle. Gem denne måling for alle celler i én tekstfil, og opdel derefter friktionslængden med celleradiussen for at beregne den normaliserede friktionslængde.For enkelt celle rumlig analyse, først installere pakken af RStudio og indlæse pakken i RStudio. Kør pakken med funktionen ENS. Der åbnes en brugergrænseflade, og derefter vælge mappen til TXT-datasættets datasæt og en mappe til outputplottene.Scriptet vil automatisk starte og udføre analysen, der giver PDF-filer af de tilsvarende plots og TXT filer, der indeholder de numeriske resultater. Inde i cellen, gulvet i sonden er slukket af den lave pH af lysosomet, men under exocytose, pHluorin begynder at udsende et signal som pH stiger på grund af proton frigivelse. PHluorinsignalet udviser en top under exocytose, der repræsenterer hurtig frigivelse af lysosomale protoner, efterfulgt af et eksponentielt signalforfald, der repræsenterer sondens 2D-diffusion ved plasmamembranen.Typisk, transfect udødeliggjort menneskelige retinale pigmenterede epitelceller demonstrere en vigtig lysosomal sekretion aktivitet med en gennemsnitlig exocytose sats på 0,28 Hertz. Det er muligt at visualisere 2D-fordelingen af exocytose ved kernetæthedsestimering for at afsløre forskelle i lokale tætheder. Der er tre mulige afvigelser fra fuldstændig rumlig tilfældighed: klyngedannelse, spredning eller en blanding af klyngedannelse og spredning.Ripleys K-funktion kan bruges til at vurdere disse afvigelser. Det skal bemærkes, at exocytose-hændelser i det ikke-klæbende område også er grupperet, hvilket indikerer, at vedhæftningsmolekyler ikke er de eneste strukturer, der fremkalder sekretoriske hotspots ved plasmamembraner. Plotte histogram af exocytose begivenheder i henhold til modulus for en repræsentativ celle afslører et højdepunkt omkring grænsen mellem klæbende og ikke-klæbende områder.Parret analyse viser, at overfladetætheden er lavere i vedhæftningsområdet end i ikke-vedhæftningsområdet, potentielt på grund af det kraftige fald i exocytose i celleperiferi. Ved at kombinere cellevedhæftning på mikropatterner med statistisk analyse er det lettere at finde ud af, hvordan komplekse cellulære processer som sekretion reguleres i rummet. Der er behov for mere arbejde i fremtiden for at afgøre, hvilken molekylær mekanisme, der ligger til grund for klyngedannelsen af sekretorisk aktivitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kortlægning af Motilitet i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Forberedelser af tarmene

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematisk Analyse af celledeling og Expansion: Kvantificering af Cellular Grundlag for vækst og Sampling Developmental zoner i<em&gt; Zea mays</em&gt; Blade

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse af Cytokinetic Begivenheder i Fission Gær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...