Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

We erkennen Thierry Galli (Center of Psychiatry and Neurosciences, INSERM) voor het leveren van de VAMP7-pHluorine plasmide. Wij danken Tarn Duong voor advies over statistische analyse en leden van het GOUD laboratorium voor vruchtbare discussies. De auteurs erkennen sterk de Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg en PICT-IBiSA @Pasteur) en Nikon Imaging Center, Institut Curie (Parijs), lid van de Franse National Research Infrastructure France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. werd ondersteund door de Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) en P.M. ontving financiering uit het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. Dit werk werd ondersteund door subsidies van INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), de Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) en Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), evenals het Centre National de la Recherche Scientifique en Institut Curie.

1. Bereiding van micropatronen
<ol><li>Transfectie van cellen<ol>
<li>Een dag voor de transfectie, zaad 2,5 x 106 hTERT-RPE1 cellen in een put van een 12 put plaat (2 x 2 cm) in 1 mL van medium.</li>
		<li>Bereid op de dag van de overbesmetting het transfectiemengsel met VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffer, 0,8 μg DNA, 3 μL transfectiemengsel). Incubeer gedurende 10 minuten. OPMERKING: VAMP7 is een lysosomale v-SNARE, gefuseerd met een luminale pHluorin-tag. De pHluorine sonde wordt gedoofd door lage...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

We monitorden exocytosegebeurtenissen uit het lysosomale compartiment door TIRFM live celbeeldvorming van VAMP7-pHluorine in ringvormige micropattern-genormaliseerde cellen en voerden een rigoureuze statistische analyse uit van de ruimtelijke parameters van exocytosegebeurtenissen. In dienst van de getransformeerde Ripley's K-functie en een statistische test op basis van de dichtstbijzijnde afstand van de buren, bevestigden we dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces is8,,<...

Exocytose is een universeel cellulair proces waarbij een blaasje samensmelt met het plasmamembraan en de inhoud ervan vrijgeeft. De blaas kan ofwel volledig samensmelten met het plasmamembraan (volledige fusie) of een fusieporie creëren die gedurende een beperkte tijd open blijft (kiss-and-run)1. Zo komen nieuw gesynthetiseerde eiwitten vrij in het extracellulaire medium van akelige die afkomstig zijn van het Golgi-complex. Deze biosynthetische, anterograde route is primordiale, vooral in meercellige organismen, om signaal peptiden afscheiden (bijvoorbeeld hormonen, neurotransmitters) en extracellulaire matrix componenten (bijvoorbeeld collageen), evenals om transmembrane eiwitten te verhandelen naar het plasmamembraan. Bovendien kunnen afscheidingen optreden van verschillende endosomosomen: 1) recycling endosomes om transmembranen te hergebruiken; 2) multivesiculaire instanties (MVB's) om exosomen vrij te geven; en 3) lysosomen voor het vrijkomen van proteolytische enzymen. Endosomale afscheiding is aangetoond dat het belangrijk is voor neurite uitgroei, pseudopodia vorming, plasma membraan reparatie, en ATP-afhankelijke signalering2.
Om exocytose op eencellig niveau te bestuderen, zijn verschillende technieken toegepast. Patch-klem zorgt voor de detectie van enkele exocytose gebeurtenissen met een hoge temporele resolutie in een breed scala van levende cellen3. Deze methode geeft echter geen informatie over de lokalisatie van exocytosegebeurtenissen, noch uit welk compartiment het voorkomt. Elektronenmicroscopie maakt directe visualisatie van exocytische gebeurtenissen met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk, en in combinatie met immunolabeling geeft informatie over de specificiteit van de betrokken compartimenten en moleculen. Een nadeel van deze aanpak is het gebrek aan informatie over de dynamiek van het proces, evenals het onvermogen om high-throughput studies uit te voeren. Lichte microscopie benaderingen zoals totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), die gebruik maakt van de evanescente veld om fluoroforen te verlichten in de buurt van de coverslip (100 nm), biedt een goede temporele en ruimtelijke resolutie om exocytose gebeurtenissen te bestuderen. Deze methode is echter alleen compatibel met aanhangende cellen en kan alleen worden toegepast op het ventrale/inferieure deel van cellen.
Van belang, het plasmamembraan onthult significante heterogeniteit op basis van lijmcomplexen die alleen aanwezig zijn in gebieden met beperkte toegang. Deze heterogeniteit beperkt bijvoorbeeld de opname van verschillende liganden4. Ook is onlangs gemeld dat afscheiding van het Golgi-complex is geconcentreerd op "hot spots" in het plasmamembraan5. Bovendien is het bekend dat bepaalde ladingen worden afgescheiden door focal-adhesie-geassocieerde exocytose6. Er moet dus bijzondere aandacht worden besteed aan de vraag of exocytosegebeurtenissen willekeurig in de ruimte worden verspreid, of dat ze geconcentreerd zijn op specifieke gebieden van het plasmamembraan. Verschillende statistische instrumenten op basis van de K-functie van Ripley zijn voorgesteld om deze vragen te onderzoeken7,8,9. Onze aanpak combineert deze tools met micropatronen om celvorm en plasmamembraan heterogeniteit te controleren. Deze techniek biedt niet alleen een middel om onderscheid te maken tussen lijm- en niet-belangrijke gebieden, maar maakt ook vergelijking tussen verschillende cellen en omstandigheden mogelijk en verhoogt de kracht van statistische analyses.
Hier maken we gebruik van een verscheidenheid aan statistische instrumenten om de ruimtelijke verdeling van exocytosegebeurtenissen te bestuderen uit het lysosomale compartiment dat wordt bewaakt door TIRFM live celbeeldvorming van VAMP7-pHluorine in ringvormige micropattern-genormaliseerde hTert-RPE1-cellen. Er werd bevestigd dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces8,9 is en dat exocytosegebeurtenissen clustering vertonen. Van nota, vonden we dat exocytose gebeurtenissen zijn ook geclusterd in niet-belangrijke gebieden, wat aangeeft dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die secretoire hot spots kan induceren op het plasmamembraan. Niettemin, celhechting heeft versterkt clustering. Consequent identificeerde onze analyse verrijkte gebieden van exocytose die zich op de grens tussen de lijm en niet-aangrenzende gebieden bevonden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Live beeldvorming van het pHluorine gelabeld Oplosbare N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-geassocieerd membraaneiwit 7 (VAMP7) door totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) is een eenvoudige manier om de afscheiding uit het lysosomale compartiment te verkennen. Gebruikmakend van de celcultuur op micropatronen om de celvorm te normaliseren, werden verschillende statistische instrumenten gebruikt om een ruimtelijke analyse van secretoire patronen uit te voeren. Met behulp van Ripley's K-functie en een statistische test op basis van de dichtstbijzijnde buurafstand (NND), hebben we bevestigd dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces is, maar significante clustering vertoont. Van nota, onze analyse toonde aan dat exocytose gebeurtenissen ook geclusterd in niet-hechting gebieden, wat aangeeft dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die kunnen leiden tot secretoire hot spots op het plasmamembraan. Toch ontdekten we dat celhechting de clustering verbetert. Naast nauwkeurig gedefinieerde lijm- en niet-belangrijke gebieden, maakt de cirkelvormige geometrie van deze micropatronen het gebruik van polaire coördinaten mogelijk, waardoor analyses worden vereenvoudigd. We gebruikten Kernel Density Estimation (KDE) en de cumulatieve distributiefunctie op polaire coördinaten van exocytosegebeurtenissen om verrijkte gebieden van exocytose te identificeren. In ringvormige micropatronen vond clustering plaats aan de grens tussen de lijm en niet-aangrenzende gebieden. Onze analyse illustreert hoe statistische instrumenten kunnen worden gebruikt om ruimtelijke verdelingen van diverse biologische processen te onderzoeken.

De spatiotemporale kenmerken van exocytose-voorvallen werden geanalyseerd op lysosomen gevisualiseerd door VAMP7-pHluorine10,11 in hTert-RPE1 cellen. hTert-RPE1-cellen zijn niet-getransformeerde cellen die goed tot micropatronen worden gebruikt en die op grote schaal zijn gebruikt in eerdere micropatronen4,14. VAMP7 is een lysosomale v-SNARE15 die werd gelabeld met de super eclipti...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Live beeldvorming van lysosomale exocytose op micropatterned cellen maakt een ruimtelijke kwantificering van dit proces mogelijk. Morfologie normalisatie met behulp van micropatronen is een uitstekend hulpmiddel om algemene regels over de ruimtelijke verdeling van cellulaire processen te ontdekken.

Kraaktemporale parameters van cellulaire exocytose in micropatterned cellen kwantificeren

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Dit protocol laat zien hoe celsecretie te onderzoeken met behulp van live imaging door TOF-microscopie en biedt tools voor het detecteren van clustergebeurtenissen of regio's met een hoge activiteit. Met behulp van dit protocol kunnen we celculturen genereren op micropatronen die de celdeling normaliseren en zo de speciale reeksen secretoire gebeurtenissen vergemakkelijken. Cellen scheiden een verscheidenheid aan macromoleculen af die een belangrijke rol spelen bij immuunregulering.Bij kanker, gedereguleerde afscheiding beïnvloedt de vrijlating van proteolytische enzymen die invasie te vergemakkelijken. De kwantificering van de afscheiding zal ons in staat stellen om beter te begrijpen gedegradeerde afscheiding in kanker en andere dynamische processen zoals antigeen presentatie heeft. Hoewel ons beeldvormings- en analyseprotocol eenvoudig is, vereist het het genereren van enkele cellen die goed verspreid zijn op een stuk micropatroon.In deze video laten we zien hoe cellen op micropatroon coverslips kunnen worden gekweekt en hoe ze secretoire gebeurtenissen kunnen visualiseren en analyseren met behulp van ruimtelijke statistische tools. Om coverslips voor te bereiden op micropatronen, activeert u ethanol gesteriliseerd 25 millimeter diameter glazen coverslips onder diep ultraviolet licht gedurende vijf minuten. Terwijl de coverslips worden geactiveerd, voeg een 30 microliter druppel van polylysine graft polyethyleenglycol per coverslip op een stuk paraffine film binnen een vochtige kamer.Plaats aan het einde van de activering de opdekken geactiveerde oppervlaktezijde naar beneden op de druppels en bedek de vochtige kamer voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de covers twee keer in gedestilleerd water. Terwijl de covers drogen, was een kwarts foto masker een keer met gedestilleerd water en een keer met alcohol.Droog het fotomasker met gefilterde luchtstroom en stel het fotomasker chromen gecoate kant gedurende vijf minuten bloot tot diep ultraviolet licht. Voeg aan het einde van de verlichting een druppel water van 10 microliter toe aan de met chroom beklede kant van elk fotomasker en plaats de polyethyleenglycolzijde van elke coverslip op elke druppel water. Na het verwijderen van overtollig water, plaats een film deksel over de dia's om uitdroging te voorkomen.Stel de niet-verchroomde zijkanten van de fotomaskers gedurende nog eens vijf minuten bloot aan diep ultraviolet licht voordat u overtollig water toevoegt aan de fotomaskers om de coverslips te verwijderen. Deze stap zal de micropatroonafdrukken op het oppervlak produceren. Vervolgens incubeer de coverslips in een extracellulaire matrix eiwit oplossing op paraffine film in een vochtige kamer voor een uur onder een laminaire flow hood.Voor celzaaien op het voorbereide micropatroonoppervlak, aan het einde van de incubatie, plaats de coverslips in een magnetische coverslip houder micropattern kant omhoog en voeg onmiddellijk patroon medium aan de coverslips. Na toevoeging van de afdichting, immobiliseren van de coverslips met het magnetische apparaat voor het vullen van de coverslip houder met extra patroon medium. Sluit vervolgens de houder met een glazen deksel.Wanneer de cellen klaar zijn, voeg 5 keer 10 toe aan de 5e van de doorfecteerde vereeuwigde netvliespigmenteppitheelcellen aan de coverslips en broed de cellen in de houder gedurende 10 minuten in de celkweek incubator. Gebruik aan het einde van de incubatie één pipet om het oude medium aan tezuigen terwijl u een tweede pipet gebruikt om de cellen vijf maal te wassen met vers medium per wasbeurt om de niet-bevestigde cellen en eventuele resterende foetale runderserum te verwijderen. Na de laatste wasbeurt keert u de houder gedurende drie uur terug naar de couveuse om volledige cel verspreiding mogelijk te maken.Om exocytose-gebeurtenissen in beeld te brengen, plaatst u de coversliphouder onder een totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop en zoekt u naar een cel die VAMP7-pHluorine uitdrukt die volledig is verspreid. Verander de hoek van de laser tot een totale interne reflectie fluorescentiehoek die het mogelijk maakt de visualisatie van VAMP7-pHluorine exocytose gebeurtenissen wordt bereikt en het uitvoeren van een vijf minuten durende acquisitie op een frequentie die compatibel is met de exocytose snelheid en tijdschaal. Om de exocytosecoördinaten te verkrijgen, opent u de verworven exocytose-gebeurtenisfilm in Fiji en identificeert u handmatig de exocytosegebeurtenissen door het verschijnen van een helder signaal dat zich naar buiten verspreidt.Gebruik het puntgereedschap om het midden van de exocytosegebeurtenis te markeren en gebruik analyseren en meten om de x- en y-coördinaten en de temporele coördinaat te meten. Sla de metingen van één cel op in één tekstbestand. Open tekstbestand in een spreadsheet en verwijder alle, behalve de kolommen segment x en y-coördinaat.Gebruik vervolgens het ovale gereedschap en meet om het midden en de diameter te meten en om de x- en y-coördinaten en Feret's diameter van elke cel te verkrijgen. Sla de metingen van alle cellen op in één tekstbestand. Open het tekstbestand in een spreadsheet en verwijder alle, behalve de x- en y-coördinaat en de diameterkolommen van Feret.Voeg vervolgens de straalmeting voor elke cel toe en verkrijg vervolgens de straal van de diameter van de Feret voor elke cel. Gebruik het rechte lijngereedschap om de dikte van de micropatroonring van elke cel te meten. Sla deze meting op voor alle cellen in één tekstbestand en verdeel vervolgens de hechtingslengte door de celstraal om de genormaliseerde hechtingslengte te berekenen.Installeer eerst het pakket RStudio voor eencellige ruimtelijke analyse en laad het pakket in RStudio. Voer het pakket uit met de FUNCTIE ESA. Er wordt een gebruikersinterface geopend en vervolgens de map voor de TXT-bestanden voor de gegevensset en een map voor de uitvoerplots geselecteerd.Het script start en voert automatisch de analyse uit, waarbij PDF-bestanden worden weergegeven van de bijbehorende plots en TXT-bestanden met de numerieke resultaten. In de cel wordt de vloer in sonde gedoofd door de lage pH van het lysosoom, maar tijdens exocytose begint pHluorine een signaal uit te zenden als de pH toeneemt als gevolg van protonafgifte. Het pHluorine-signaal vertoont een piek tijdens exocytose die de snelle afgifte van lysosomale protonen vertegenwoordigt, gevolgd door een exponentieel signaalverval dat de 2D-diffusie van de sonde bij het plasmamembraan vertegenwoordigt.Typisch, transfect vereeuwigd menselijke retinale gepigmenteerde epitheelcellen vertonen een belangrijke lysosomale afscheiding activiteit met een gemiddelde exocytose snelheid van 0,28 Hertz. Het is mogelijk om de 2D-verdeling van exocytose te visualiseren door schatting van de kerneldichtheid om verschillen in lokale dichtheden te onthullen. Er zijn drie mogelijke afwijkingen van volledige ruimtelijke willekeur: clustering, dispersie, of een mengsel van clustering en dispersie.Ripley's K-functie kan worden gebruikt om deze afwijkingen te beoordelen. Van nota, exocytose gebeurtenissen in de niet-lijm gebied zijn ook geclusterd waaruit blijkt dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die secretoire hotspots induceren bij plasmamembranen. Het uitzetten van het histogram van exocytosegebeurtenissen volgens de modulus voor een representatieve cel onthult een piek rond de grens tussen de lijm- en niet-kleefgebieden.Gekoppelde analyse toont aan dat de oppervlaktedichtheid lager is in het hechtingsgebied dan in het niet-hechtingsgebied, mogelijk als gevolg van de sterke afname van exocytose aan de celperiferie. Het combineren van celhechting op micropatronen met statistische analyse vergemakkelijkt de mogelijkheid om aan te geven hoe complexe cellulaire processen zoals afscheiding in de ruimte worden gereguleerd. Meer toekomstig werk is nodig om te bepalen welk moleculair mechanisme dat ten grondslag ligt aan de clustering van secretoire activiteit.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Monogene Assay: hechtende cellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Het kwantificeren van de Frequentie van Tumor voortplantende cellen met behulp van beperkte verdunning Cell Transplantation in syngene zebravis

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporele Mapping van Motiliteit in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Bereidingen van de darmen

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...