Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
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Nous reconnaissons vivement Thierry Galli (Centre de psychiatrie et neurosciences, INSERM) pour avoir fourni le plasmide VAMP7-pHluorin. Nous remercions Tarn Duong pour ses conseils sur l’analyse statistique et les membres du laboratoire GOUD pour les discussions fructueuses. Les auteurs reconnaissent avec beaucoup le Centre d’imagerie cellulaire et tissulaire (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg et PICT-IBiSA @Pasteur) et le Centre d’imagerie Nikon, Institut Curie (Paris), membre de l’Français Infrastructure nationale de recherche France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. a reçu le soutien de l’Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) et P.M. a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie no 666003. Ces travaux ont été soutenus par des subventions de INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), du Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) et de l’Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), ainsi que du Centre National de la Recherche Scientifique et Institut Curie.

1. Préparation de cellules micropatternées
<ol><li>Transfection des cellules<ol>
<li>Un jour avant la transfection, semer 2,5 x 10cellules 6 hTERT-RPE1 en un puits d’une plaque de puits de 12 (2 x 2 cm) dans 1 mL de milieu.</li>
		<li>Le jour de la transfection, préparer le mélange de transfection avec le plasmide VAMP7-pHluorine (100 μL de tampon, 0,8 μg d’ADN, 3 μL de mélange de transfection). Incuber pendant 10 min. NOTE: VAMP7 est un lysosomal v-SNARE, fusionné avec une étiquette pHluori...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Nous avons surveillé les événements d’exocytose du compartiment lysosomal par l’imagerie cellulaire vivante de TIRFM de VAMP7-pHluorin dans les cellules micropatternes-normalisées en forme d’anneau et avons exécuté une analyse statistique rigoureuse des paramètres spatiaux des événements d’exocytose. En utilisant la fonction K de Ripley transformée et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche, nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléa...

L’exocytose est un processus cellulaire universel dans lequel une vésicule fusionne avec la membrane plasmatique et libère son contenu. La vésicule peut soit fusionner totalement avec la membrane plasmatique (fusion complète) ou créer un pore de fusion qui reste ouvert pendant un temps limité (kiss-and-run)1. Par exemple, les protéines nouvellement synthétisées sont libérées dans le milieu extracellulaire à partir de vésicules provenant du complexe golgi. Cette voie biosynthétique et antérograde est primordiale, en particulier dans les organismes multicellulaires, pour sécréter des peptides de signalisation (p. ex., hormones, neurotransmetteurs) et des composants de matrice extracellulaire (p. ex., collagène), ainsi que pour le trafic des protéines transmembrane vers la membrane plasmatique. En outre, les sécrétions peuvent provenir de différents endosomes: 1) le recyclage des endosomes afin de réutiliser les protéines transmembrane; 2) corps multivesiculaires (MVBs) pour libérer les exosomes; et 3) lysosomes pour la libération d’enzymes protéolytiques. La sécrétion endosomale s’est avérée importante pour l’excroissance de neurite, la formation de pseudopodia, la réparation de membrane de plasma, et la signalisation ATP-dépendante2.
Pour étudier l’exocytose au niveau des cellules uniques, plusieurs techniques ont été employées. Patch-clamp permet la détection d’événements d’exocytose unique avec une haute résolution temporelle dans une grande variété de cellules vivantes3. Toutefois, cette méthode ne fournit pas d’information sur la localisation des événements d’exocytose, ni sur le compartiment à partir duquel elle se produit. La microscopie électronique permet une visualisation directe d’événements exocytiques à haute résolution spatiale, et en combinaison avec l’immunolabeling fournit des informations sur la spécificité des compartiments et des molécules impliquées. Un inconvénient de cette approche est le manque d’information sur la dynamique du processus, ainsi que son incapacité à effectuer des études à haut débit. Les approches de microscopie légère telles que la microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM), qui exploite le champ évanescent pour éclairer les fluorophores à proximité du couvercle (100 nm), fournit une bonne résolution temporelle et spatiale pour étudier les événements d’exocytose. Toutefois, cette méthode n’est compatible qu’avec les cellules adhérentes et ne peut être appliquée qu’à la partie ventrale/inférieure des cellules.
Il est à noter que la membrane plasmatique révèle une hétérogénéité significative à base de complexes adhésifs qui ne sont présents que dans les zones réglementées. Cette hétérogénéité limite, par exemple, l’absorption de différents ligands4. De même, il a récemment été signalé que la sécrétion du complexe de Golgi est concentrée à des « oints chaud » dans la membrane plasmatique5. En outre, on sait que certaines cargaisons sont sécrétées par l’exocytose6associée à l’adhérence focale. Il convient donc d’accorder une attention particulière à la question de savoir si les événements d’exocytose sont distribués au hasard dans l’espace, ou s’ils sont concentrés à des zones spécifiques de la membrane plasmatique. Plusieurs outils statistiques basés sur la fonction K de Ripley ont été proposés pour explorer ces questions7,8,9. Notre approche combine ces outils avec le micropatternage pour contrôler la forme cellulaire et l’hétérogénéité des membranes plasmatiques. En plus de fournir un moyen de distinguer entre les zones adhésives et nonadhésives, cette technique permet également de comparer entre différentes cellules et conditions et augmente la puissance des analyses statistiques.
Ici, nous utilisons une variété d’outils statistiques pour étudier la distribution spatiale des événements d’exocytose à partir du compartiment lysosomal surveillé par tirfm imagerie cellulaire vivante de VAMP7-pHluorin dans des cellules hTert-RPE1 en forme de micropatternisé. Il a été confirmé que la sécrétion des lysosomes n’est pas un processus aléatoire8,9 et que les événements d’exocytose présentent le regroupement. Il convient de noter que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones nonadhésives, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécrétoires à la membrane plasmatique. Néanmoins, l’adhérence cellulaire a amélioré le clustering. Notre analyse a permis d’identifier des zones enrichies d’exocytose situées à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

L’imagerie en direct de la protéine 7 (VAMP7) associée à la pHluorine soluble soluble N-éthylmaleimide-sensible-facteur pièce jointe protéine de fixation REceptor (v-SNARE) protéine membranaire associée aux vésicules (VAMP7) par microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM) est un moyen simple d’explorer la sécrétion du compartiment lysosomal. Profitant de la culture cellulaire sur les surfaces micropatternées pour normaliser la forme cellulaire, une variété d’outils statistiques ont été utilisés pour effectuer une analyse spatiale des modèles sécrétoires. En utilisant la fonction K de Ripley et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche (NND), nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléatoire, mais montre un regroupement significatif. Il convient de noter que notre analyse a révélé que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones de nonadhésion, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécréteurs à la membrane plasmatique. Pourtant, nous avons constaté que l’adhérence cellulaire améliore le clustering. En plus des zones adhésives et nonadhésives précisément définies, la géométrie circulaire de ces micropatterns permet l’utilisation de coordonnées polaires, simplifiant les analyses. Nous avons utilisé l’estimation de la densité du noyau (KDE) et la fonction de distribution cumulative sur les coordonnées polaires des événements d’exocytose pour identifier les zones enrichies d’exocytose. Dans les cellules micropatternes en forme d’anneau, le regroupement s’est produit à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives. Notre analyse illustre comment des outils statistiques peuvent être utilisés pour étudier les distributions spatiales de divers processus biologiques.

Les caractéristiques spatiotemporal des événements d’exocytose ont été analysées à partir de lysosomes visualisés par VAMP7-pHluorin10,11 dans les cellules hTert-RPE1. les cellules hTert-RPE1 sont des cellules non transformées qui adoptent bien au micropatternage et ont été largement utilisées dans des études antérieures basées sur des micropatternes4,14. VAMP7 est un lysosomal v-SNARE<su...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

L’imagerie en direct de l’exocytose lysosomale sur les cellules micropatternées permet une quantification spatiale de ce processus. La normalisation de la morphologie à l’aide de micropatterns est un outil exceptionnel pour découvrir des règles générales sur la distribution spatiale des processus cellulaires.

Quantification des paramètres spatiotemporal de l’exocytose cellulaire dans les cellules micropatternées

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Ce protocole montre comment étudier la sécrétion cellulaire à l’aide de l’imagerie en direct par microscopie TOF et fournit des outils pour détecter les événements de clustering ou les régions à forte activité. En utilisant ce protocole, nous pouvons générer des cultures cellulaires sur des surfaces micropatrées qui normalisent la division cellulaire et facilitent ainsi les gammes spéciales d’événements sécrétaires. Les cellules sécrètent une variété de macromolécules qui jouent un rôle important dans la régulation immunitaire.Dans le cancer, la sécrétion déréglementée affecte la libération d’enzymes protéolytiques qui facilitent l’invasion. La quantification de la sécrétion nous permettra de mieux comprendre la sécrétion dégradée dans le cancer et d’autres processus dynamiques tels que la présentation des antigènes. Bien que notre protocole d’imagerie et d’analyse soit simple, il nécessite la génération de cellules individuelles qui sont bien réparties sur un morceau de micropatrin.Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment la culture des cellules sur les coverslips micropattern et comment visualiser et analyser les événements sécrétaires à l’aide d’outils statistiques spacial. Pour préparer des coverslips pour le micropatterning, activez des couvertures en verre stérilisées à l’éthanol de 25 millimètres de diamètre sous une lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes. Pendant que les coverslips sont activés, ajoutez une goutte de 30 microlitres de polyéthylène glycol de greffe de polyéthylène par coverslip sur un morceau de film de paraffine dans une chambre humide.À la fin de l’activation, placez les coverslips activés côté surface vers le bas sur les gouttes et couvrir la chambre humide pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les couvercles deux fois dans de l’eau distillée. Pendant que les coverslips sèchent, lavez un masque photo en quartz une fois avec de l’eau distillée et une fois avec de l’alcool.Séchez le masque photo avec un flux d’air filtré et exposez le côté chromé du masque photo jusqu’à la lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes. À la fin de l’éclairage, ajouter une goutte d’eau de 10 microlitres sur le côté chromé de chaque masque photo et placer le côté polyéthylène glycol de chaque coverslip sur chaque goutte d’eau. Après avoir enlevé tout excès d’eau, placez un couvercle de film sur les toboggans pour éviter la déshydratation.Exposez les côtés non chromés des masques photo à la lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes supplémentaires avant d’ajouter un excès d’eau aux masques photo pour enlever les coverslips. Cette étape produira les empreintes de micropattern sur la surface. Puis incuber les coverslips dans une solution protéique matricielle extracellulaire sur film de paraffine dans une chambre humide pendant une heure sous un capot d’écoulement laminaire.Pour l’ensemencement cellulaire sur la surface micropatreuse préparée, à la fin de l’incubation, placez les coverslips dans un support magnétique de couverture côté micropattern vers le haut et ajoutez immédiatement le milieu de modèle aux coverslips. Après avoir ajouté le joint, immobiliser les coverslips avec le dispositif magnétique avant de remplir le support de coverslip avec le milieu de motif supplémentaire. Ensuite, fermez le support avec un couvercle en verre.Lorsque les cellules sont prêtes, ajouter 5 fois 10 à la 5ème des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées transfectées aux coverslips et incuber les cellules dans le support pendant 10 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, utiliser une pipette pour aspirer l’ancien milieu tout en utilisant une deuxième pipette pour laver les cellules cinq fois avec un milieu frais par lavage pour enlever les cellules non attachées et tout sérum bovin fœtal résiduel. Après le dernier lavage, remettre le support à l’incubateur pendant trois heures pour permettre la propagation complète des cellules.Pour les événements d’exocytose d’image, placez le support de coverslip sous un microscope interne total de fluorescence de réflexion, et recherchez une cellule exprimant VAMP7-pHluorin qui est entièrement écartée. Modifiez l’angle du laser jusqu’à ce qu’un angle de fluorescence de réflexion interne total qui permette la visualisation des événements d’exocytose vamp7-pHluorin soit atteint et effectuez une acquisition de cinq minutes à une fréquence compatible avec le taux d’exocytose et l’échelle de temps. Pour obtenir les coordonnées de l’exocytose, ouvrez le film d’événement d’exocytose acquis aux Fidji et identifiez manuellement les événements d’exocytose par l’apparition d’un signal lumineux qui se propage vers l’extérieur.Utilisez l’outil point pour marquer le centre de l’événement d’exocytose et utilisez l’analyse et la mesure pour mesurer les coordonnées x et y ainsi que la coordonnée temporelle. Enregistrez les mesures d’une cellule dans un fichier texte. Ouvrez le fichier texte dans une feuille de calcul et supprimez toutes les colonnes de la tranche x et de la coordonnée y.Ensuite, utilisez l’outil ovale et mesurez pour mesurer le centre et le diamètre et pour obtenir les coordonnées x et y et le diamètre de Feret de chaque cellule. Enregistrez les mesures de toutes les cellules dans un seul fichier texte. Ouvrez le fichier texte dans une feuille de calcul et supprimez toutes les colonnes de diamètre, sauf x et y, ainsi que les colonnes de diamètre de Feret.Ajoutez ensuite la mesure du rayon pour chaque cellule, puis obtenez le rayon du diamètre du Feret pour chaque cellule. Utilisez l’outil en ligne droite pour mesurer l’épaisseur de l’anneau de micropatrin de chaque cellule. Enregistrez cette mesure pour toutes les cellules dans un fichier texte, puis divisez la longueur d’adhérence par le rayon cellulaire pour calculer la longueur normalisée de l’adhérence.Pour l’analyse spatiale à cellule unique, installez d’abord le paquet de RStudio et chargez le paquet dans RStudio. Exécutez le paquet avec la fonction ESA. Une interface utilisateur s’ouvrira, puis sélectionnera l’annuaire pour les fichiers TXT de l’ensemble de données et un répertoire pour les parcelles de sortie.Le script démarre et effectue automatiquement l’analyse, fournissant des fichiers PDF des parcelles correspondantes et des fichiers TXT contenant les résultats numériques. À l’intérieur de la cellule, le plancher de la sonde est trempé par le pH bas du lysosome, mais pendant l’exocytose, la pHluorine commence à émettre un signal à mesure que le pH augmente en raison de la libération de protons. Le signal de pHluorin montre un pic pendant l’exocytose qui représente la libération rapide des protons lysosomaux, suivi d’une désintégration exponentielle du signal qui représente la diffusion 2D de la sonde à la membrane plasmatique.Typiquement, les cellules épithéliales pigmentées rétiniennes immortalisées transfect démontrent une activité importante de sécrétion lysosomale avec un taux moyen d’exocytose de 0,28 Hertz. Il est possible de visualiser la distribution 2D de l’exocytose par estimation de densité de noyau pour révéler des différences dans les densités locales. Il y a trois déviations possibles du hasard spatial complet : clustering, dispersion, ou un mélange de clustering et de dispersion.La fonction K de Ripley peut être utilisée pour évaluer ces écarts. Il convient de noter que les événements d’exocytose dans la zone non adhésive sont également regroupés indiquant que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui induisent des points chauds sécrétaires aux membranes plasmatiques. Tracer l’histogramme des événements d’exocytose selon le modulus pour une cellule représentative révèle un pic autour de la frontière entre les zones adhésives et non adhésives.L’analyse appariée démontre que la densité de surface est plus faible dans la zone d’adhérence que dans la zone de non-adhérence, potentiellement due à la forte diminution de l’exocytose à la périphérie cellulaire. La combinaison de l’adhérence cellulaire sur les micropatrins avec l’analyse statistique facilite la capacité de déterminer comment les processus cellulaires complexes tels que la sécrétion sont régulés dans l’espace. D’autres travaux futurs sont nécessaires pour déterminer quel mécanisme moléculaire qui sous-tend le regroupement de l’activité sécrétaire.

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