Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Wir würdigen Thierry Galli (Center of Psychiatry and Neurosciences, INSERM) für die Bereitstellung des VAMP7-pHluorin-Plasmids. Wir danken Tarn Duong für die Beratung zur statistischen Analyse und den Mitgliedern des GOUD-Labors für fruchtbare Diskussionen. Die Autoren würdigen die Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg und PICT-IBiSA @Pasteur) und das Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), Mitglied der französischen Nationalen Forschungsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. wurde von der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) unterstützt und P.M. erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 666003. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), dem Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) und Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) sowie dem Centre National de la Recherche Scientifique und Institut.

1. Herstellung von mikrogemusterten Zellen
<ol><li>Transfektion von Zellen<ol>
<li>Einen Tag vor der Transfektion 2,5 x 106 hTERT-RPE1-Zellen in einen Brunnen einer 12-Well-Platte (2 x 2 cm) in 1 ml Medium.</li>
		<li>Am Tag der Transfektion die Transfektionsmischung mit VAMP7-pHluorin-Plasmid (100 l Puffer, 0,8 g DNA, 3 l Transfektionsgemisch) vorbereiten. 10 min inkubieren. HINWEIS: VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE, das mit einem luminalen pHluorin-Tag verschmolzen ist. Die pHluorin-Sonde wird durch ni...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. 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X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Wir überwachten Exozytose-Ereignisse aus dem lysosomalen Fach durch TIRFM-Livezellbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten Zellen und führten eine strenge statistische Analyse der räumlichen Parameter von Exozytoseereignissen durch. Unter Verwendung der transformierten Ripley-Funktion K und eines statistischen Tests auf der Grundlage der nächsten Nachbardistanz bestätigten wir, dass die Sekretion von Lysosomen kein zuzufälliger Prozess ist8,<sup cla...

Exozytose ist ein universeller zellulärer Prozess, bei dem ein Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt und seinen Inhalt freisetzt. Das Vesikel kann entweder vollständig mit der Plasmamembran (Vollfusion) verschmelzen oder eine Fusionspore erzeugen, die während einer begrenzten Zeit offen bleibt (Kiss-and-Run)1. So werden beispielsweise neu synthetisierte Proteine aus Vesikeln, die aus dem Golgi-Komplex stammen, in das extrazelluläre Medium freigesetzt. Dieser biosynthetische, anterograde Weg ist vor allem bei mehrzelligen Organismen primordial, um Signalpeptide (z. B. Hormone, Neurotransmitter) und extrazelluläre Matrixkomponenten (z. B. Kollagen) sowie den Verkehr von Transmembranproteinen an die Plasmamembran zu sezernieren. Zusätzlich können Sekrete aus verschiedenen Endosomen auftreten: 1) Recycling von Endosomen zur Wiederverwendung von Transmembranproteinen; 2) mehrschichtige Körper (MVBs) zur Freisetzung von Exosomen; und 3) Lysosomen zur Freisetzung von proteolytischen Enzymen. Die endosomale Sekretion hat sich als wichtig für das Neuritenwachstum, die Pseudopodienbildung, die Plasmamembranreparatur und die ATP-abhängige Signalisierung2erwiesen.
Um die Exozytose auf Einzelzellebene zu untersuchen, wurden mehrere Techniken eingesetzt. Patch-Clamp ermöglicht die Detektion einzelner Exozytose-Ereignisse mit einer hohen zeitlichen Auflösung in einer Vielzahl von lebenden Zellen3. Diese Methode liefert jedoch keine Informationen über die Lokalisierung von Exozytose-Ereignissen, noch aus welchem Fach sie auftritt. Die Elektronenmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung exozytischer Ereignisse mit hoher räumlicher Auflösung und liefert in Kombination mit Der Immunolabeling Informationen über die Spezifität der beteiligten Kompartimente und Moleküle. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist der Mangel an Informationen über die Dynamik des Prozesses sowie seine Unfähigkeit, Hochdurchsatzstudien durchzuführen. Lichtmikroskopische Ansätze wie die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die das evaneszierende Feld nutzt, um Fluorophore in der Nähe des Deckslips (100 nm) zu beleuchten, bieten eine gute zeitliche und räumliche Auflösung, um Exozytose-Ereignisse zu untersuchen. Diese Methode ist jedoch nur mit anhaftenden Zellen kompatibel und kann nur auf den ventralen/unteren Zellteil angewendet werden.
Bemerkenswert ist, dass die Plasmamembran eine signifikante Heterogenität auf der Grundlage von Klebstoffkomplexen aufzeigt, die nur in eingeschränkten Bereichen vorhanden sind. Diese Heterogenität schränkt z.B. die Aufnahme verschiedener Ligandenein 4. In ähnlicher Weise wurde kürzlich berichtet, dass die Sekretion aus dem Golgi-Komplex an "Hotspots" in der Plasmamembran5konzentriert ist. Darüber hinaus ist bekannt, dass bestimmte Ladungen durch fokaladad-assoziierte Exozytose6abgesondert werden. Daher sollte besonderes Augenmerk auf die Frage zu richten, ob Exozytoseereignisse zufällig im Weltraum verteilt sind oder ob sie auf bestimmte Bereiche der Plasmamembran konzentriert sind. Mehrere statistische Instrumente, die auf Ripleys K-Funktion basieren, wurden vorgeschlagen, um diese Fragen zu untersuchen7,8,9. Unser Ansatz kombiniert diese Werkzeuge mit Mikromusterung zur Steuerung der Zellform und der Heterogenität der Plasmamembran. Diese Technik bietet nicht nur die Möglichkeit, zwischen Klebstoff- und Nichtklebstoffbereichen zu unterscheiden, sondern ermöglicht auch den Vergleich zwischen verschiedenen Zellen und Bedingungen und erhöht die Leistungsfähigkeit statistischer Analysen.
Hier verwenden wir eine Vielzahl statistischer Werkzeuge, um die räumliche Verteilung von Exozytose-Ereignissen aus dem lysosomalen Fach zu untersuchen, das durch TIRFM-Livezellenbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten hTert-RPE1-Zellen überwacht wird. Es wurde bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozessist 8,,9 und dass Exozytose-Ereignisse Clustering aufweisen. Bemerkenswert erweise gilt, dass Exozytose-Ereignisse auch in nicht-klebenden Bereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretore Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch hat die Zellhaftung das Clustering verbessert. Konsequenterweise identifizierte unsere Analyse angereicherte Bereiche der Exozytose, die sich an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen befanden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Die Live-Bildgebung des pHluorin-markierten Soluble N-Ethylmaleimid-sensitive-Faktor Attachment-Proteins REceptor (v-SNARE) Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) durch totale interne Reflexionfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ist eine einfache Möglichkeit, die Sekretion aus dem lysosomalen Fach zu erforschen. Unter Ausnutzung der Zellkultur auf mikrogemusterten Oberflächen, um die Zellform zu normalisieren, wurden eine Vielzahl statistischer Werkzeuge eingesetzt, um eine räumliche Analyse von sekretohierten Mustern durchzuführen. Mit Ripleys K-Funktion und einem statistischen Test basierend auf der nächsten Nachbarentfernung (NND) haben wir bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozess ist, sondern signifikante Clustering zeigt. Bemerkenswert erweise hat unsere Analyse ergeben, dass Exozytose-Ereignisse auch in Nonadhesionsbereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretole Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch haben wir festgestellt, dass die Zellhaftung das Clustering verbessert. Neben genau definierten Klebe- und Nicht-Klebstoffbereichen ermöglicht die kreisförmige Geometrie dieser Mikromuster die Verwendung von Polarkoordinaten und vereinfacht analysen. Wir verwendeten Kernel Density Estimation (KDE) und die kumulative Verteilungsfunktion auf Polarkoordinaten von Exozytoseereignissen, um angereicherte Bereiche der Exozytose zu identifizieren. In ringförmigen Mikromusterzellen kam es an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen zu Clustering. Unsere Analyse zeigt, wie statistische Werkzeuge eingesetzt werden können, um räumliche Verteilungen verschiedener biologischer Prozesse zu untersuchen.

Die räumlich zeitlichen Eigenschaften von Exozytose-Ereignissen wurden anhand von Lysosomen analysiert, die durch VAMP7-pHluorin10,11 in hTert-RPE1-Zellen visualisiert wurden. hTert-RPE1-Zellen sind nicht transformierte Zellen, die sich gut an Mikromustern ereignen und in früheren Mikromuster-basierten Studien4,14ausgiebig verwendet wurden. VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE15, da...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.

Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Dieses Protokoll veranschaulicht, wie die Zellsekretion mithilfe der Live-Bildgebung durch die TOF-Mikroskopie untersucht wird, und stellt Tools zum Erkennen von Clustering-Ereignissen oder Regionen mit hoher Aktivität bereit. Mit diesem Protokoll können wir Zellkulturen auf Mikromusteroberflächen erzeugen, die die Zellteilung normalisieren und so die speziellen Bereiche von Sekretorischen Ereignissen erleichtern. Zellen sezernieren eine Vielzahl von Makromolekülen, die eine wichtige Rolle bei der Immunregulation spielen.Bei Krebs wirkt sich die deregulierte Sekretion auf die Freisetzung proteolytischer Enzyme aus, die die Invasion erleichtern. Die Quantifizierung der Sekretion wird es uns ermöglichen, die degradierte Sekretion bei Krebs und anderen dynamischen Prozessen wie Antigendarstellung besser zu verstehen. Obwohl unser Bildgebungs- und Analyseprotokoll einfach ist, erfordert es die Erzeugung einzelner Zellen, die gut auf einem Stück Mikromuster verteilt sind.In diesem Video zeigen wir, wie Zellen auf Mikromuster-Coverlips kulturiert werden und wie sekretore Ereignisse mithilfe von räumlichen statistischen Werkzeugen visualisiert und analysiert werden. Um Abdeckungen für die Mikromusterung vorzubereiten, aktivieren Sie für fünf Minuten ethanolsterilisierte Glasabdeckungen mit einem Durchmesser von 25 Millimetern unter tiefem ultraviolettem Licht. Während die Abdeckungen aktiviert werden, fügen Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen Polylysin-Transplantat Polyethylenglykol pro Deckelrutsch auf ein Stück Paraffinfolie in einer feuchten Kammer hinzu.Am Ende der Aktivierung die betätigte Decklippenseite auf die Tropfen legen und die feuchte Kammer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur bedecken. Am Ende der Inkubation die Deckel zweimal in destilliertem Wasser waschen. Während die Abdeckungen trocknen, waschen Sie einmal eine Quarz-Fotomaske mit destilliertem Wasser und einmal mit Alkohol.Trocknen Sie die Fotomaske mit gefiltertem Luftstrom und setzen Sie die Fotomaske verchromte Seite für fünf Minuten bis zu tiefem ultraviolettem Licht aus. Am Ende der Beleuchtung einen 10-Mikroliter-Tropfen Wasser auf die verchromte Seite jeder Fotomaske geben und die Polyethylenglykolseite jedes Deckelrutsches auf jeden Tropfen Wasser legen. Nachdem Sie überschüssiges Wasser entfernt haben, legen Sie eine Filmabdeckung über die Dias, um Eine Austrocknung zu vermeiden.Setzen Sie die nicht verchromten Seiten der Fotomasken weitere fünf Minuten tief ultraviolettem Licht aus, bevor Sie den Fotomasken überschüssiges Wasser hinzufügen, um die Abdeckungen zu entfernen. Dieser Schritt erzeugt die Mikromusterabdrücke auf der Oberfläche. Dann die Coverlips in einer extrazellulären Matrixproteinlösung auf Paraffinfolie in einer feuchten Kammer für eine Stunde unter einer laminaren Strömungshaube inkubieren.Für die Zellaussaat auf der vorbereiteten Mikromusteroberfläche legen Sie am Ende der Inkubation die Abdeckungen in eine magnetische Deckblatthalter-Mikromusterseite nach oben und fügen Sie den Abdeckungen sofort mustermedium hinzu. Nach dem Hinzufügen der Dichtung die Abdeckungen mit dem Magnetgerät immobilisieren, bevor Sie den Deckelhalter mit zusätzlichem Mustermedium befüllen. Schließen Sie dann den Halter mit einem Glasdeckel.Wenn die Zellen bereit sind, fügen Sie 5 mal 10 zum 5. der transfizierten verewigten retinalen Pigmentepithelzellen zu den Abdeckungen hinzu und inkubieren Sie die Zellen im Halter für 10 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Pipette, um das alte Medium zu aspirieren, während Sie eine zweite Pipette verwenden, um die Zellen fünfmal mit frischem Medium pro Waschmittel zu waschen, um die nicht angeschlossenen Zellen und alle verbleibenden fetalen Rinderserum zu entfernen. Nach der letzten Wäsche, geben Sie den Halter für drei Stunden zum Inkubator zurück, um eine vollständige Zellausbreitung zu ermöglichen.Um Exozytose-Ereignisse abzubilden, platzieren Sie den Deckelschlupfhalter unter ein gesamtes internes Reflexionsfluoreszenzmikroskop und suchen Sie nach einer Zelle, die VAMP7-pHluorin exzessiiert, die vollständig verbreitet ist. Ändern Sie den Winkel des Lasers, bis ein gesamtinterner Reflexionsfluoreszenzwinkel erreicht ist, der die Visualisierung von VAMP7-pHluorin-Exozytose-Ereignissen ermöglicht, und führen Sie eine fünfminütige Erfassung bei einer Frequenz durch, die mit der Exozytoserate und der Zeitskala kompatibel ist. Um die Exozytose-Koordinaten zu erhalten, öffnen Sie den erworbenen Exozytose-Ereignisfilm auf Fidschi und identifizieren Sie die Exozytose-Ereignisse manuell durch das Auftreten eines hellen Signals, das sich nach außen ausbreitet.Verwenden Sie das Punktwerkzeug, um den Mittelpunkt des Exozytoseereignisses zu markieren, und verwenden Sie Analysieren und Messen, um die x- und y-Koordinaten sowie die zeitliche Koordinate zu messen. Speichern Sie die Messungen einer Zelle in einer Textdatei. Öffnen Sie die Textdatei in einer Kalkulationstabelle, und entfernen Sie alle Spalten mit der Zeit bis auf die Segmente x und y-Koordinaten.Verwenden Sie als Nächstes das ovale Werkzeug und messen Sie, um den Mittelpunkt und den Durchmesser zu messen und die x- und y-Koordinaten und den Feret-Durchmesser jeder Zelle zu erhalten. Speichern Sie die Messungen aller Zellen in einer Textdatei. Öffnen Sie die Textdatei in einer Kalkulationstabelle, und entfernen Sie alle Spalten außer der x- und y-Koordinate sowie der Durchmesservon Feret.Fügen Sie dann die Radiusmessung für jede Zelle hinzu, und erhalten Sie dann den Radius aus dem Feret-Durchmesser für jede Zelle. Verwenden Sie das gerade Linienwerkzeug, um die Dicke des Mikromusterrings jeder Zelle zu messen. Speichern Sie diese Messung für alle Zellen in einer Textdatei, und teilen Sie dann die Haftlänge durch den Zellradius, um die normalisierte Haftlänge zu berechnen.Installieren Sie für die räumliche Einzelzellanalyse zuerst das Paket von RStudio, und laden Sie es in RStudio. Führen Sie das Paket mit der ESA-Funktion aus. Eine Benutzeroberfläche wird geöffnet und dann das Verzeichnis für die Dataset-TXT-Dateien und ein Verzeichnis für die Ausgabediagramme ausgewählt.Das Skript startet und führt die Analyse automatisch durch und stellt PDF-Dateien der entsprechenden Plots und TXT-Dateien mit den numerischen Ergebnissen bereit. Im Inneren der Zelle wird der Boden in der Sonde durch den niedrigen pH-Wert des Lysosoms abgeschreckt, aber während der Exozytose beginnt pHluorin ein Signal auszusenden, wenn der pH-Wert aufgrund der Protonenfreisetzung zunimmt. Das pHluorin-Signal weist während der Exozytose einen Höhepunkt auf, der die schnelle Freisetzung von lysosomalen Protonen darstellt, gefolgt von einem exponentiellen Signalzerfall, der die 2D-Diffusion der Sonde an der Plasmamembran darstellt.Typischerweise zeigen transfezierte verewigte menschliche retinale pigmentierte Epithelzellen eine wichtige lysosomale Sekretionsaktivität mit einer durchschnittlichen Exozytoserate von 0,28 Hertz. Es ist möglich, die 2D-Verteilung der Exozytose durch Kerneldichteschätzung zu visualisieren, um Unterschiede in der lokalen Dichte aufzudecken. Es gibt drei mögliche Abweichungen von der vollständigen räumlichen Zufälligkeit: Clustering, Dispersion oder eine Mischung aus Clustering und Dispersion.Ripleys K-Funktion kann verwendet werden, um diese Abweichungen zu bewerten. Bemerkenswert ist, dass Exozytose-Ereignisse im nicht-klebenden Bereich ebenfalls gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretore Hotspots an Plasmamembranen induzieren. Das Aufzeichnen des Histogramms von Exozytoseereignissen nach dem Modul für eine repräsentative Zelle zeigt einen Höhepunkt um die Grenze zwischen den klebenden und nicht klebenden Bereichen.Die gepaarte Analyse zeigt, dass die Oberflächendichte im Haftbereich geringer ist als im Nicht-Haftbereich, was möglicherweise auf die starke Abnahme der Exozytose an der Zellperipherie zurückzuführen ist. Die Kombination von Zellhaftung auf Mikromustern mit statistischen Analysen erleichtert die Möglichkeit, zu bestimmen, wie komplexe zelluläre Prozesse wie Sekretion im Raum reguliert werden. Es bedarf weiterer zukünftiger Arbeiten, um zu bestimmen, welcher molekulare Mechanismus der Clusterbildung geheimer Aktivität zugrunde liegt.

Research

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Biology

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