Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

אנו מכירים מאוד תיירי גאלי (המרכז לפסיכיאטריה ומדעי המוח, INSERM) למתן פלסמיד VAMP7-pHluorin. אנו מודים לטארן דואונג על ייעוץ בנושא ניתוח סטטיסטי וחברי מעבדת GOUD לדיונים פוריים. המחברים מכירים מאוד את מתקן הדמיית תאים ורקמות (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg ו PICT-IBiSA @Pasteur) ואת ניקון הדמיה מרכז, המכון קירי (פריז), חבר תשתית המחקר הלאומי הצרפתי צרפת-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. נתמך על ידי האגודה לשפוך la Recherche sur le Cancer (ARC) ו P.M. קיבל מימון מתכנית המחקר והחדשנות אופק של האיחוד האירופי 2020 תחת מארי Skłodowska-Curie מענק הסכם מס ' 666003. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) ו-Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), כמו גם המרכז הלאומי דה לה רשרש סיינטיפיק ומשקיע קירי.

1. הכנת תאים מיקרו-פטרניים
<ol><li>תעבירת תאים<ol>
<li>יום אחד לפני transfection, זרע 2.5 x 106 hTERT-RPE1 תאים לתוך באר אחת של 12 צלחת באר (2 x 2 ס"מ) ב 1 מ"ל של בינוני.</li>
		<li>ביום של transfection, להכין את תערובת transfection עם VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL של חוצץ, 0.8 μg של ה-DNA, 3 μL של תערובת טרנספד). דגירה במשך 10 דקות. הערה: VAMP7 הוא v-SNARE lys...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

עקבנו אחר אירועי אקסוציטוזיס מהתא הליזומלי על ידי TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאים מיקרו-פטרן בצורת טבעת מנורמל וביצע ניתוח סטטיסטי קפדני של הפרמטרים המרחביים של אירועי אקסוציטוזיס. מתוך שימוש בתפקוד ה-K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר, אישרנו כי הפרשה מlysosomes אי...

אקסוציטוזיס הוא תהליך תאי אוניברסלי שבו שלוק מתפתל עם קרום הפלזמה ומשחרר את תכולתו. שלבית יכול להתמזג לחלוטין עם קרום פלזמה (היתוך מלא) או ליצור נקבובית היתוך שנשאר פתוח בזמן מוגבל (נשיקה וריצה)1. לדוגמה, חלבונים מסונתזים חדשים משתחררים למדיום החוץ-תאי מהשלוקים שהגיעו ממתחם Golgi. מסלול זה biosynthetic, anterograde הוא קדמוני, במיוחד אורגניזמים רב תאיים, כדי להפריס פפטידים איתות (למשל, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים) ורכיבי מטריצה חוץ תאית (למשל, קולגן), כמו גם את התנועה חלבוני טרנסמברנה לממברנה פלזמה. בנוסף, הפרשות יכולות להתרחש אנדוזומים שונים: 1) מיחזור אנדוזומים על מנת לעשות שימוש חוזר חלבונים transmembrane; 2) גופים רב-ווריקולריים (MVBs) לשחרור אקסוזומים; ו-3) ליזומה לשחרור אנזימים פרוטאוליטיים. הפרשה אנדו-פלומטית כבר הראה להיות חשוב עבור גידול נורייט, היווצרות פסאודופודיה, תיקון קרום פלזמה, ואיתות תלוי ATP2.
כדי ללמוד אקסוציטוזיס ברמת תא יחיד, מספר טכניקות הועסקו. מהדק תיקון מאפשר זיהוי של אירועי אקסוציטוזיס יחיד עם רזולוציה זמנית גבוהה במגוון רחב של תאים חיים3. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע על התאמה למיקום אחר של אירועי אקסוציטוזיס, ולא מאיזה תא היא מתרחשת. מיקרוסקופאלקטרונים מאפשרת הדמיה ישירה של אירועים אקסוציטיים ברזולוציה מרחבית גבוהה, ובשילוב עם חיסונים מספקת מידע על הספציפיות של התאים והמולקולות המעורבים. חיסרון בגישה זו הוא חוסר המידע על הדינמיקה של התהליך, כמו גם חוסר יכולתו לבצע מחקרים בתפוקה גבוהה. גישות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM), אשר מנצל את השדה evanescent כדי להאיר פלואורופורים בקרבת כיסוי (100 טנ"מ), מספק רזולוציה זמנית ומרחבית טובה כדי ללמוד אירועי אקסוציטוזיס. עם זאת, שיטה זו תואמת רק לתאים דבקים ותוחל רק על החלק האוורירי/נחות של התאים.
הערה, קרום הפלזמה חושף הטרוגניות משמעותית המבוססת על תסביכי דבק הנוכחיים רק באזורים מוגבלים. הטרוגניות זו מגבילה, למשל, את ספיגת ליגנדיםשונים 4. באופן דומה, לאחרונה דווח כי הפרשה ממתחם Golgi מרוכזת "נקודות חמות" קרום פלזמה5. יתר על כן, ידוע כי מטענים מסוימים מופרשים באמצעות exocytosis הקשורים למוקדהדבקה 6. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולמת לשאלה אם אירועי אקסוציטוזיס מופצים באופן אקראי בחלל, או אם הם מרוכזים באזורים מסוימים של קרום הפלזמה. מספר כלים סטטיסטיים המבוססים על פונקציית K של ריפלי הוצעו לחקור אתהשאלות האלה 7,8,9. הגישה שלנו משלבת כלים אלה עם micropatterning כדי לשלוט בצורת התא והטרוגניות קרום פלזמה. בנוסף למתן אמצעי להבחין בין אזורים דביקים ולא דביקים, טכניקה זו גם מאפשרת השוואה בין תאים ותנאים שונים ומגבירה את כוחם של ניתוחים סטטיסטיים.
כאן אנו מעסיקים מגוון של כלים סטטיסטיים כדי ללמוד את ההתפלגות המרחבית של אירועי אקסוציטוזיס מתא lysosomal בפיקוח TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאי hTert-RPE1 מיקרו-פטורן בצורת טבעת. אושר כי הפרשת ליזומים אינה תהליך אקראי8-,9, ושאירועי אקסוציטוזיס מציגים קיבוץ באשכולות. שימו לב, מצאנו כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים לא דביקים, מה שמצביע על כך שמולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות של הפרשה בממברנה פלזמה. אף על פי כן, הדבקת תאים אכן שפרו את התקבצות האשכולות. באופן עקבי, הניתוח שלנו זיהה אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס שהיו ממוקמים בגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

הדמיה חיה של pHluorin מתויג מסיס N-ethylmaleimide-רגיש-גורם חיבור חלבון REceptor (v-SNARE) Vesicle הקשורים קרום חלבון 7 (VAMP7) על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) היא דרך פשוטה לחקור הפרשה מהתא lysosomal. ניצול של תרבות התא על משטחים micropatterned כדי לנרמל את צורת התא, מגוון רחב של כלים סטטיסטיים הועסקו כדי לבצע ניתוח מרחבי של דפוסי הפרשה. באמצעות פונקציית K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר (NND), אישרנו כי הפרשה מlysosomes אינה תהליך אקראי, אבל מראה קיבוץ באשכולות משמעותי. שימו לב, הניתוח שלנו גילה כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים שאינם הדבקה, המציין כי מולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות הפרשה על קרום הפלזמה. ובכל זאת, מצאנו שהדבקת תאים משפרת את התקבצות האשכולות. בנוסף לאזורים דביקים ולא דביקים מוגדרים במדויק, הגיאומטריה המעגלית של מיקרו-פטרנים אלה מאפשרת שימוש בקואורדינטות קוטביות, ומפשטת את הניתוחים. השתמשנו הערכת צפיפות ליבה (KDE) ואת פונקציית ההתפלגות המצטברת על קואורדינטות קוטביות של אירועי אקסוציטוזיס כדי לזהות אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס. בתאי מיקרו-פטרן בצורת טבעת, התקבצות אירעה בגבול בין האזורים הדביקים לאזורים שאינם דביקים. הניתוח שלנו ממחיש כיצד ניתן להשתמש בכלים סטטיסטיים כדי לחקור הפצות מרחביות של תהליכים ביולוגיים מגוונים.

המאפיינים spatiotemporal של אירועי אקסוציטוזיס נותחו lysosomes חזותי על ידי VAMP7-pHluorin10,,11 בתאי hTert-RPE1. hTert-RPE1 תאים הם תאים לא טרנספורמיים לאמץ היטב micropatterning, שימשו בהרחבה במחקרים מבוססימיקרו-פטרן קודמים 4,14. VAMP7 הוא lysomal v-SNARE15 כי ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

הדמיה חיה של אקסוציטוזיס ליזומלי על תאים מיקרו-פטרניים מאפשרת כימות מרחבית של תהליך זה. נורמליזציה מורפולוגית באמצעות מיקרו-פטרנים היא כלי יוצא מן הכלל לחשיפת כללים כלליים לגבי ההפצה המרחבית של תהליכים סלולריים.

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

פרוטוקול זה מדגים כיצד לחקור הפרשת תאים באמצעות הדמיה חיה על ידי מיקרוסקופיית TOF ומספק כלים לזיהוי אירועי קיבוץ באשכולות או אזורים של פעילות גבוהה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים ליצור תרבות תאים על משטחים micropattern לנרמל חלוקת תאים ובכך להקל על הטווחים המיוחדים של אירועי הפרשה. תאים מפרישים מגוון של מקרומולקולים המ ממלאים תפקידים חשובים בוויסות המערכת החיסונית.בסרטן, הפרשה ללא פיקוח משפיעה על שחרורם של אנזימים פרוטאוליטיים המאפשרים פלישה. כימות הפרשה יאפשר לנו להבין טוב יותר הפרשה מושפלת בסרטן ותהליכים דינמיים אחרים כגון הצגת אנטיגן. למרות פרוטוקול ההדמיה והניתוח שלנו הוא פשוט, זה דורש את הדור של תאים בודדים כי הם התפשטו היטב על פיסת micropattern.בסרטון זה, נדגים כיצד לתרבת תאים על כיסויי מיקרופטרן וכיצד לדמיין ולנתח אירועי הפרשה באמצעות כלים סטטיסטיים מרחביים. כדי להכין כיסויים עבור micropatterning, להפעיל אתנול מעוקר 25 מילימטר קוטר כיסויי זכוכית תחת אור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות. בעוד הכיסויים מופעלים, להוסיף טיפה אחת 30 microliter של פוליאתילן שתל פוליאתילן גליקול לכל כיסוי על פיסת סרט פרפין בתוך תא לח.בסוף ההפעלה, מניחים את הכיסויים המופעלים בצד המשטח אל הטיפות ומכסים את התא הלח עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הכיסויים פעמיים במים מזוקקים. בזמן שהכיסויים מתייבשים, שטפו מסכת צילום קוורץ פעם אחת עם מים מזוקקים ופעם אחת עם אלכוהול.יבש את מסכת הצילום עם זרימת אוויר מסוננת ולחשוף את הצד מצופה כרום מסכת צילום עד אור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות. בסוף התאורה, מוסיפים טיפת מים של 10 מיקרוליטר על הצד מצופה הכרום של כל מסכת צילום ומניחים את צד הפוליאתילן גליקול של כל כיסוי על כל טיפת מים. לאחר הסרת כל מים עודפים, מניחים כיסוי הסרט מעל המגלשות, כדי למנוע התייבשות.חשוף את הצדדים הצפויים שאינם כרום של מסכות התמונה לאור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות נוספות לפני הוספת מים עודפים למסכות הצילום כדי להסיר את הכיסויים. שלב זה יפיק את הטבעות המיקרופטרן על פני השטח. ואז להדגיר את הכיסויים בתווית חלבון מטריצה חוץ תאית על סרט פרפין בתא לח במשך שעה אחת מתחת למכסה המנוע לזרימה למינארית.עבור זריעת תא על פני השטח micropattern מוכן, בסוף הדגירה, למקם את הכיסויים לתוך צד micropattern מחזיק כיסוי מגנטי למעלה מיד להוסיף דפוס בינוני כדי coverslips. לאחר הוספת החותם, יש לשתק את הכיסויים עם ההתקן המגנטי לפני מילוי מחזיק הכיסויים במדיום תבנית נוסף. ואז לסגור את המחזיק עם מכסה זכוכית.כאשר התאים מוכנים, להוסיף 5 פעמים 10 כדי 5 של תאי אפיתל פיגמנט מונצח מונצחים transffected לתאי אפיתל כדי coverslips ו דגירה התאים במחזיק במשך 10 דקות באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה, השתמש פיפטה אחת כדי לשאוף את המדיום הישן תוך שימוש פיפטה שנייה לשטוף את התאים חמש פעמים עם מדיום טרי לכל לשטוף כדי להסיר את התאים שאינם מחוברים וכל סרום חזיר עוברי שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, להחזיר את המחזיק לאנקובטור במשך שלוש שעות כדי לאפשר התפשטות תא מלא.כדי לדמיין אירועי אקסוציטוזיס, מקם את מחזיק הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת, וחפש תא המבטא VAMP7-pHluorin המתפשט במלואו. לשנות את הזווית של הלייזר עד זווית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית הכוללת המאפשרת הדמיה של VAMP7-pHluorin אקסוציטוזיס אירועים הוא הגיע ולבצע רכישה של חמש דקות בתדר התואם את קצב exocytosis ואת ציר הזמן. כדי להשיג את קואורדינטות אקסוציטוזיס, לפתוח את הסרט אירוע אקסוציטוזיס שנרכש בפיג'י ולזהות באופן ידני את אירועי אקסוציטוזיס על ידי הופעת אות בהיר המתפשט החוצה.השתמש בכלי הנקודה כדי לסמן את מרכז אירוע האקסוציטוזיס ולהשתמש לנתח ולמדוד כדי למדוד את x ו y-קואורדינטות, כמו גם את קואורדינטת הזמן. שמור את המידות של תא אחד בקובץ טקסט אחד. פתח קובץ טקסט בגיליון אלקטרוני והסר את כל העמודות מלבד הפרוסה x וקואורדינטות y.לאחר מכן, השתמש בכלי הסגלגל ולמדוד כדי למדוד את המרכז ואת הקוטר כדי לקבל את x ו y-קואורדינטות ואת הקוטר של Feret של כל תא. שמור את המידות של כל התאים בקובץ טקסט אחד. פתח את קובץ הטקסט בגיליון אלקטרוני והסר את כל העמודות בקואורדינטות x ו- y וקוטר של Feret.לאחר מכן הוסיפו את מדידת הרדיוס עבור כל תא, ולאחר מכן השגו את הרדיוס מקוטר הפראט עבור כל תא. השתמש בכלי הקו הישר כדי למדוד את עובי טבעת המיקרופטרן של כל תא. שמור מדידה זו עבור כל התאים בקובץ טקסט אחד ולאחר מכן חלק את אורך ההיתוך ברדיוס התא כדי לחשב את אורך ההיתוך המנורמל.לניתוח מרחבי של תא יחיד, התקן תחילה את החבילה של RStudio וטען את החבילה ב- RStudio. הפעל את החבילה באמצעות הפונקציה ESA. ממשק משתמש ייפתח ולאחר מכן בחר את הספריה עבור קבצי ערכת הנתונים TXT ומדריך נתונים עבור התוויות הפלט.הסקריפט יתחיל ויבצע באופן אוטומטי את הניתוח, ויספק קובצי PDF של החלקות המתאימות וקבצי TXT המכילים את התוצאות המספריות. בתוך התא, הרצפה בבדיקה הוא מרווה על ידי ה- pH הנמוך של lysosome, אבל במהלך אקסוציטוזיס, pHluorin מתחיל לפלוט אות כמו pH עולה עקב שחרור פרוטון. אות pHluorin מפגין שיא במהלך אקסוציטוזיס המייצג את השחרור המהיר של פרוטונים ליזוזומליים, ואחריו ריקבון אות אקספוננציאלי המייצג את הדיפוזיה הדו-מימדית של הגשוש בממברנה של הפלזמה.בדרך כלל, תאי אפיתל מונצחים מונצחים של רשתית אנושית מדגימים פעילות הפרשת ליזומלית חשובה עם קצב אקסוציטוזיס ממוצע של 0.28 הרץ. ניתן לדמיין את ההתפלגות הדו-מימדית של אקסוציטוזיס על ידי הערכת צפיפות הקרנל כדי לחשוף הבדלים בצפיפות המקומית. קיימות שלוש סטיות אפשריות מ אקראיות מרחבית מוחלטת: קיבוץ באשכולות, פיזור או תערובת של קיבוץ באשכולות ופיזור.ניתן להשתמש בפונקציית K של ריפלי כדי להעריך את הסטיות האלה. שימו לב, אירועי אקסוציטוזיס באזור שאינו דבק מקובצים גם הם ומצביעים על כך שמולקולות הידבקות אינן המבנים היחידים המניעים נקודות חמות הפרשתיות בממברנות פלזמה. התוויית ההיסטוגרמה של אירועי אקסוציטוזיס על פי המודולוס לתא מייצג מגלה שיא סביב הגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים.ניתוח מזווג מראה כי צפיפות פני השטח נמוכה יותר באזור ההיצמדות מאשר באזור שאינו הידבקות, פוטנציאל בשל ירידה חזקה של אקסוציטוזיס בפריפריה התא. שילוב הידבקות תאים במיקרופטרנים עם ניתוח סטטיסטי מקל על היכולת לאתר במדויק עד כמה תהליכים תאיים מורכבים כגון הפרשה מוסדרים בחלל. דרושה עבודה עתידית נוספת כדי לקבוע איזה מנגנון מולקולרי עומד בבסיס קיבוץ האשכולות של פעילות הפרשה.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

כימות תדירות הגידול מתפשט תאים באמצעות הגבלת השתלת דילול ב Syngeneic דג הזברה

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

מיפוי Spatiotemporal של תנועתיות ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תכשירים מהמעיים

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; Zea Mays</em&gt; מותיר

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...