Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Riconosciamo molto Thierry Galli (Centro di Psichiatria e Neuroscienze, INSERM) per aver fornito il plasmide VAMP7-pHluorin. Ringraziamo Tarn Duong per i consigli sull'analisi statistica e i membri del laboratorio GOUD per le discussioni fruttuose. Gli autori riconoscono molto il Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg e PICT-IBiSA @Pasteur) e il Nikon Imaging Center, Institut Curie (Parigi), membro dell'Infrastruttura Nazionale francese di ricerca Francia-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. è stato sostenuto dall'Associazione pour la Recherche sur le Cancer (ARC) e P.M. ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 666003 dell'Unione europea. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), il Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-003) Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), così come il Centre National de la Recherche Scientifique e Institut Curie.

1. Preparazione di cellule micromodelli
<ol><li>Trasfezione delle cellule<ol>
<li>Un giorno prima della trasfezione, seme 2,5 x10 6 hTERT-RPE1 cellule in un pozzo di una piastra 12 pozzo (2 x 2 cm) in 1 mL di media.</li>
		<li>Il giorno della trasfezione, preparare la miscela di trasfezione con plasmide VAMP7-pHluorin (100 L di tampone, 0,8 g di DNA, 3 L di miscela di trasfezione). Incubare per 10 min. NOTA: VAMP7 è un lysosomal v-SNARE, fuso con un tag pHluorin luminale. La sonda pHluorin viene sfociata...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Abbiamo monitorato gli eventi di estosi dal compartimento lisosomiale dall'imaging cellulare live TIRFM di VAMP7-pHluorin in cellule normalizzate a micromodello a forma di anello ed abbiamo eseguito una rigorosa analisi statistica dei parametri spaziali degli eventi di esocitosi. Impiegando la funzione K di Ripley trasformata e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina, abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processocasuale 8,9</s...

L'esocitosi è un processo cellulare universale in cui una vescica si fonde con la membrana plasmatica e rilascia il suo contenuto. La vescicola può fondersi totalmente con la membrana plasmatica (fusione completa) o creare un poro di fusione che rimane aperto durante un tempo limitato (bacio e corsa)1. Per esempio, le proteine appena sintetizzate vengono rilasciate nel mezzo extracellulare dalle vesicelle che provengono dal complesso Golgi. Questa via biosintetica e anterograda è primordiale, soprattutto negli organismi multicellulari, per seceare peptidi di segnalazione (ad esempio, ormoni, neurotrasmettitori) e componenti a matrice extracellulare (ad esempio, collagene), così come per il traffico di proteine transmembrane alla membrana plasmatica. Inoltre, le secrezioni possono verificarsi da diversi endsomes: 1) riciclare endosomi al fine di riutilizzare le proteine transmembrane; 2) corpi multiversicolari (MVB) per rilasciare esosomi; e 3) lisosomi per il rilascio di enzimi proteolitici. La secrezione endosomica ha dimostrato di essere importante per la crescita dei neuriti, la formazione di pseudopodi, la riparazione della membrana plasmatica e la segnalazione dipendentedall'ATP 2.
Per studiare l'esocitosi a livello di singola cellula, sono state impiegate diverse tecniche. Patch-clamp consente il rilevamento di singoli eventi di esocitosi con un'alta risoluzione temporale in una vasta gamma di cellule viventi3. Tuttavia, questo metodo non fornisce informazioni sulla localizzazione degli eventi di esocitosi, né dal raggruppamento che si verifica. La microscopia elettronica consente la visualizzazione diretta di eventi esoctici ad alta risoluzione spaziale, e in combinazione con l'immunoetichettazione fornisce informazioni sulla specificità dei compartimenti e delle molecole coinvolte. Uno svantaggio di questo approccio è la mancanza di informazioni sulle dinamiche del processo, nonché la sua incapacità di eseguire studi ad alto rendimento. Approcci di microscopia leggera come la microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM), che sfrutta il campo evanescente per illuminare i fluorofori nelle vicinanze del cos coverslip (100 nm), fornisce una buona risoluzione temporale e spaziale per studiare gli eventi di esocitosi. Tuttavia, questo metodo è compatibile solo con le cellule aderenti e può essere applicato solo alla parte ventrale / inferiore delle cellule.
Da notare, la membrana plasmatica rivela una significativa eterogeneità basata su complessi adesivi che sono presenti solo in aree ristrette. Questa eterogeneità limita, ad esempio, l'adozione di diversi ligandi4. Allo stesso modo, è stato recentemente riferito che la secrezione dal complesso di Golgi è concentrata in "punti caldi" nella membranaplasmatica 5. Inoltre, è noto che alcuni carichi sono secreti attraverso l'esocitosi associata all'adesione focale6. Pertanto, si dovrebbe prestare particolare attenzione alla questione se gli eventi di esocitosi siano distribuiti casualmente nello spazio o se siano concentrati in aree specifiche della membrana plasmatica. Diversi strumenti statistici basati sulla funzione K di Ripley sono stati proposti per esplorare questedomande 7,8,9. Il nostro approccio combina questi strumenti con micromodello per controllare la forma delle cellule e l'eterogeneità della membrana plasmatica. Oltre a fornire un mezzo per distinguere tra aree adesive e non analizzate, questa tecnica consente anche il confronto tra diverse cellule e condizioni e aumenta la potenza delle analisi statistiche.
Qui impieghiamo una varietà di strumenti statistici per studiare la distribuzione spaziale degli eventi di esocitosi dal compartimento lisosomiale monitorato dall'imaging cellulare vivo TIRFM di VAMP7-pHluorin nelle cellule hTert-RPE1 normalizzate a micromodello ad anello. È stato confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processocasuale 8,9 e che gli eventi di esocitosi esibiscono il clustering. Da notare, abbiamo scoperto che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non aesive, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, l'adesione cellulare ha migliorato il clustering. Coerentemente, la nostra analisi ha identificato aree arricchite di esocitosi che si trovavano al confine tra le aree adesive e non aesive.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

L'imaging dal vivo della proteina di membrana associata alla vescicola 7 (VAMP7) con etichetta Soluble N-ethylmaleimide-sensitive Attachment protein REceptor (v-SNARE) Proteina della membrana associata alla vescicolo 7 (VAMP7) dalla microscopia a fluorescenza a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) è un modo semplice per esplorare la secrezione dal compartimento lisosomiale. Sfruttando la coltura cellulare su superfici micromodellate per normalizzare la forma cellulare, sono stati impiegati una varietà di strumenti statistici per eseguire un'analisi spaziale dei modelli secretori. Utilizzando la funzione K di Ripley e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina (NND), abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processo casuale, ma mostra un clustering significativo. Da notare, la nostra analisi ha rivelato che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non di aesione, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, abbiamo scoperto che l'adesione cellulare migliora il clustering. Oltre alle aree adesive e non aesive definite con precisione, la geometria circolare di questi micromodelli consente l'uso di coordinate polari, semplificando le analisi. Abbiamo usato la stima della densità del kernel (KDE) e la funzione di distribuzione cumulativa sulle coordinate polari degli eventi di esocitosi per identificare le aree arricchite di esocitosi. Nelle cellule a micromodello ad anello, il clustering si è verificato al confine tra le aree adesive e non aesive. La nostra analisi illustra come gli strumenti statistici possono essere impiegati per studiare le distribuzioni spaziali di diversi processi biologici.

Le caratteristiche spatiotemporal degli eventi di esocitosi sono state analizzate dai lisosomi visualizzati da VAMP7-pHluorin10,11 nelle cellule hTert-RPE1. Le cellule hTert-RPE1 sono cellule nontransformed che adottano bene al micromodello e sono state ampiamente utilizzate nei precedenti studi basati sumicromodello 4,14. VAMP7 è un lisosomico v-SNARE15 che è stato etichettato c...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

L'imaging vivo dell'esocitosi lisosomica sulle cellule micromodelle consente una quantificazione spaziale di questo processo. La normalizzazione della morfologia tramite micromodelli è uno strumento eccezionale per scoprire le regole generali sulla distribuzione spaziale dei processi cellulari.

Quantificazione dei parametri Spatiotemporal dell'esocitosi cellulare nelle cellule micromodellate

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Questo protocollo illustra come analizzare la secrezione di cellule utilizzando l'imaging dal vivo mediante microscopia TOF e fornisce strumenti per rilevare eventi di clustering o aree ad alta attività. Utilizzando questo protocollo, possiamo generare colture cellulari su superfici micropattern che normalizzano la divisione cellulare e quindi facilitano le gamme speciali di eventi secretori. Le cellule secernono una varietà di macromolecole che svolgono ruoli importanti nella regolazione immunitaria.Nel cancro, la secrezione deregolamentata influisce sul rilascio di enzimi proteolitici che facilitano l'invasione. La quantificazione della secrezione ci permetterà di comprendere meglio la secrezione degradata nel cancro e in altri processi dinamici come la presentazione dell'antigene. Sebbene il nostro protocollo di imaging e analisi sia semplice, richiede la generazione di singole cellule che sono ben distribuite su un pezzo di micropattern.In questo video, dimostreremo come colturare le cellule su coverlips micropattern e come visualizzare e analizzare eventi secretori utilizzando strumenti statistici spettri. Per preparare le coverlips per il micropatterning, attivare le coperture in vetro sterilizzato con etanolo di 25 millimetri sotto la luce ultravioletta profonda per cinque minuti. Durante l'attivazione dei copripavimenti, aggiungere una goccia di 30 microliter di polietilene glicole per coverslip innesto di polilisina su un pezzo di pellicola di paraffina all'interno di una camera umida.Al termine dell'attivazione, posizionare i coperchi attivati lato superficiale verso il basso sulle gocce e coprire la camera umida per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare le coverlips due volte in acqua distillata. Mentre le coverlips si asciugano, lavare una maschera fotografica al quarzo una volta con acqua distillata e una volta con alcol.Asciugare la maschera fotografica con flusso d'aria filtrato ed esporre il lato cromato della maschera fotografica fino alla luce ultravioletta profonda per cinque minuti. Al termine dell'illuminazione, aggiungere una goccia d'acqua di 10 microliter sul lato cromato di ogni maschera fotografica e posizionare il lato glicole polietilene di ogni coverslip su ogni goccia d'acqua. Dopo aver rimosso l'acqua in eccesso, posizionare una copertura del film sugli scivoli per evitare la disidratazione.Esporre i lati rivestiti non cromati delle maschere fotografiche alla luce ultravioletta profonda per altri cinque minuti prima di aggiungere acqua in eccesso alle maschere fotografiche per rimuovere i copriparsi. Questo passaggio produrrà le impronte del micropattern sulla superficie. Quindi incubare le coverlips in una soluzione proteica a matrice extracellulare su pellicola di paraffina in una camera umida per un'ora sotto una cappa di flusso laminare.Per la semina cellulare sulla superficie del micropattern preparata, al termine dell'incubazione, posizionare le coverlips in un lato micropattern del portapelli magnetico verso l'alto e aggiungere immediatamente il supporto del motivo ai copripavimenti. Dopo aver aggiunto la guarnizione, immobilizzare le coverlips con il dispositivo magnetico prima di riempire il portascipelli con un mezzo di motivo aggiuntivo. Quindi chiudere il supporto con un coperchio di vetro.Quando le cellule sono pronte, aggiungere 5 per 10 al 5 ° delle cellule epiteliali del pigmento retinici immortalato trasfettato alle copertine e incubare le cellule nel supporto per 10 minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta per aspirare il vecchio mezzo mentre si utilizza una seconda pipetta per lavare le cellule cinque volte con mezzo fresco per lavaggio per rimuovere le cellule non attaccate e qualsiasi siero bovino fetale residuo. Dopo l'ultimo lavaggio, riportare il supporto nell'incubatrice per tre ore per consentire la diffusione completa della cella.Per l'immagine degli eventi di esocitosi, posizionare il portapenne sotto un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale e cercare una cellula che esprima VAMP7-pHluorina completamente diffusa. Modificare l'angolo del laser fino a raggiungere un angolo totale di fluorescenza di riflessione interna che consenta la visualizzazione degli eventi di esocitosi VAMP7-pHluorina ed eseguire un'acquisizione di cinque minuti a una frequenza compatibile con la velocità di esocitosi e la scala cronologica. Per ottenere le coordinate dell'esocitosi, aprire il filmato dell'evento di esocitosi acquisito nelle Figi e identificare manualmente gli eventi di esocitosi con la comparsa di un segnale luminoso che si diffonde verso l'esterno.Utilizzate lo strumento punto per contrassegnare il centro dell'evento di esocitosi e utilizzate l'analisi e la misura per misurare le coordinate x e y e la coordinata temporale. Salvare le misure di una cella in un file di testo. Aprire un file di testo in un foglio di calcolo e rimuovere tutte le colonne delle coordinate x e y tranne la sezione.Quindi, utilizzare lo strumento ovale e misurare per misurare il centro e il diametro e ottenere le coordinate x e y e il diametro di Feret di ogni cella. Salvare le misure di tutte le celle in un unico file di testo. Aprite il file di testo in un foglio di calcolo e rimuovete tutte le colonne di diametro delle coordinate x e y tranne x e y.Quindi aggiungere la misurazione del raggio per ogni cella, quindi ottenere il raggio dal diametro del Feret per ogni cella. Utilizzate lo strumento linea retta per misurare lo spessore dell'anello di micropattern di ogni cella. Salvare questa misurazione per tutte le celle in un unico file di testo, quindi dividere la lunghezza dell'adesione per il raggio della cella per calcolare la lunghezza di adesione normalizzata.Per l'analisi spaziale a cella singola, installare innanzitutto il pacchetto di RStudio e caricare il pacchetto in RStudio. Eseguire il pacchetto con la funzione ESA. Si aprirà un'interfaccia utente, quindi la directory per i file TXT del dataset e una directory per i grafici di output.Lo script inizierà ed eseguirà automaticamente l'analisi, fornendo file PDF dei grafici corrispondenti e file TXT contenenti i risultati numerici. All'interno della cellula, il pavimento in sonda viene spento dal basso pH del gliosoma, ma durante l'esocitosi, la pHluorina inizia a emettere un segnale all'aumentare del pH a causa del rilascio di protoni. Il segnale di pHluorina mostra un picco durante l'esocitosi che rappresenta il rilascio rapido di protoni lisosomiali, seguito da un decadimento esponenziale del segnale che rappresenta la diffusione 2D della sonda nella membrana plasmatica.Tipicamente, le cellule epiteliali pigmentate della retina immortalate dall'uomo dimostrano un'importante attività di secrezione lisosomiale con un tasso medio di esocitosi di 0,28 Hertz. È possibile visualizzare la distribuzione 2D dell'esocitosi per stima della densità del kernel per rivelare differenze nelle densità locali. Ci sono tre possibili deviazioni dalla casualità spaziale completa: clustering, dispersione o una miscela di clustering e dispersione.La funzione K di Ripley può essere usata per valutare queste deviazioni. Da notare che gli eventi di esocitosi nell'area non adesiva sono anche raggruppati indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che inducono hotspot secretori nelle membrane plasmatiche. Tracciare l'istogramma degli eventi di esocitosi in base al modulo per una cella rappresentativa rivela un picco intorno al confine tra le aree adesive e non adesive.L'analisi accoppiata dimostra che la densità superficiale è inferiore nell'area di adesione rispetto all'area di non adesione, potenzialmente a causa della forte diminuzione dell'esocitosi alla periferia cellulare. Combinare l'adesione cellulare su micropattern con l'analisi statistica facilita la capacità di individuare come processi cellulari complessi come la secrezione sono regolati nello spazio. Sono necessari ulteriori lavori futuri per determinare quale meccanismo molecolare sia alla base del raggruppamento dell'attività secretoria.

Research

JoVE Journal

Biology

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