Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
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我々は、VAMP7-pHluorinプラスミドを提供したティエリー・ガリ(精神医学・神経科学センター、INSERM)を大いに認める。統計分析に関するアドバイスとGOUD研究所のメンバーに対して、実りある議論を行なったTarn Duongに感謝します。著者らは、細胞・組織イメージング施設(PICT-IBiSA@Burg、PICT-EM@Burg、PICT-IBiSA@Pasteur)と、フランス国立研究インフラフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーであるニコンイメージングセンター、インスティトゥートキュリー(パリ)を大いに認めている。H.L.は、協会がラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガン(ARC)を注ぎ、P.M.はマリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第666003年に基づく欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから資金を受け取りました。この研究は、感染ERA(ANR-14-IFEC-0002-04)、ラベックス・セルティスフィバイオ(ANR-10-LBX-0038)、アイデックス・パリ・サイエンシズ・エ・レットレス(ANR-10-IDEX-0001-0001-02 PSL)、およびセンター・ナショナル・ド・ラ・レンチェルチェ・シビッテ・シヴィティー・シヴィティー・シヴィティー・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィット・シヴィット・アンド・イチビティ・ナショナル・ナショナル・デ・ラ・リチェルチェ・シビフィー・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー・アンド・イン・シビティー・ナショナル・ナショナル・ド・ラ・リチェルチェリ・シビッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー

1. 微小パターン化細胞の調製
<ol><li>細胞のトランスフェクション<ol>
<li>トランスフェクションの1日前に、種子2.5 x 106 hTERT-RPE1細胞を12ウェルプレート(2 x 2 cm)の1ウェルに培地1mLで入れる。</li>
		<li>トランスフェクションの日に、トランスフェクション混合物をVAMP7-pHluorinプラスミド(100 μLバッファー、0.8 μgのDNA、トランスフェクション混合物3 μL)で調製します。10分間インキュベート?...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

リング状の微小パターン正規化細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFM生細胞イメージングによるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントをモニタリングし、エキソサイトーシスイベントの空間パラメータの厳密な統計解析を行った。変換されたリプリーのK関数と最も近い近傍距離に基づく統計的検定を採用し、リソソームからの分泌はランダムなプロセス8<...

エキソサイトーシスは、小胞が血漿膜と融合し、その内容を放出する普遍的な細胞プロセスである。小胞は、完全に血漿膜(完全な融合)と融合するか、限られた時間(キスアンドラン)1の間に開いたままの融合細孔を作成することができます。例えば、新たに合成されたタンパク質は、ゴルジ複合体から来る小胞から細胞外媒体に放出される。この生合成、前向きの経路は、原始であり、特に多細胞生物において、シグナル伝達ペプチド(例えば、ホルモン、神経伝達物質)および細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン)を分泌すること、ならびに膜貫通タンパク質を細胞膜に通行させる。さらに、分泌物は異なるエンドーソームから起こり得る:1)膜貫通タンパク質を再利用するために、エンドーソームをリサイクルする。2)エキソソームを放出する多面体(MVB)。3)タンパク質分解酵素の放出のためのリソソーム。内膜分泌は、神経突起の成長、疑似ポディア形成、血漿膜修復、およびATP依存性シグナル伝達2にとって重要であることが示されている。
単細胞レベルでの興奮性の研究のために、いくつかの技術が採用されている。パッチクランプは、多種多様な生細胞3で高い時間分解能を持つ単一の興奮性イベントの検出を可能にする。ただし、このメソッドは、exocytosis イベントのローカライズに関する情報も、どのコンパートメントから発生するのかを提供しません。電子顕微鏡法は、高い空間分解能を持つexocyticイベントを直接可視化することを可能にし、免疫標識と組み合わせて、関係するコンパートメントおよび分子の特異性に関する情報を提供する。このアプローチの欠点は、プロセスのダイナミクスに関する情報の欠如と、ハイスループットの調査を実行できないことです。全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)のような光顕微鏡法は、エバネッセントフィールドを利用してカバースリップ付近(100nm)の蛍光体を照射し、エキソサイトーシス事象を研究するための良好な時間的および空間的分解能を提供する。しかし、この方法は接着細胞とのみ互換性があり、細胞の腹側/劣った部分にのみ適用できます。
注目に、原形質膜は、制限された領域にのみ存在する接着複合体に基づいて有意な不均一性を明らかにする。この異質性は、例えば、異なるリガンド4の取り込みを制限する。同様に、最近、ゴルジ複合体からの分泌が、形質膜5の「ホットスポット」に集中することが報告されている。さらに、特定の貨物が焦点接着関連のエキソサイトーシス6によって分泌されるということが知られている。したがって、エキソサイトーシスイベントが空間内にランダムに分布しているのか、あるいはそれらが形質膜の特定の領域に集中しているのかという問題に特に注意する必要があります。リプリーのK関数に基づくいくつかの統計ツールは、これらの質問77、8、98,9を探求するために提案されています。当社のアプローチは、これらのツールをマイクロパターニングと組み合わせて、細胞形状および形質膜の不均一性を制御します。接着領域と非接着領域を区別する手段を提供することに加えて、この技術は異なる細胞および条件間の比較を可能にし、統計的分析の力を高める。
ここでは、リング状の微小パターン正規化hTert-RPE1細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFMライブ細胞イメージングによって監視されるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントの空間分布を研究するために、さまざまな統計学的ツールを用います。リソソームからの分泌はランダムなプロセス88,9ではなく、9エキソサイトーシスイベントがクラスタリングを示すことを確認した。なお、エキソサイトーシスの事象は非接着領域にも集まっており、接着分子が、形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示している。それにもかかわらず、細胞接着はクラスタリングを増強した。一貫して、我々の分析は、接着剤と非接着領域の境界に位置する興奮性の豊かな領域を同定した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

pHluorinタグ付き可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質REceptor(v-SNARE)ベシクル関連膜タンパク質7(VAMP7)の生画像化は、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)によるリソマルコンパートメントからの分泌を探索する簡単な方法である。微小パターン化された表面での細胞培養を利用して細胞形状を正常化し、分泌パターンの空間解析を行う様々な統計ツールを用いた。RipleyのK関数と近傍距離(NND)に基づく統計的検定を用いて、リソソームからの分泌はランダムなプロセスではなく、有意なクラスタリングを示していることを確認した。なお、我々の分析は、エキソサイトーシス事象が非接着領域にも集まっていることを明らかにし、接着分子が形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示した。それでも、細胞接着はクラスタリングを強化することがわかりました。これらのマイクロパターンの円形ジオメトリは、接着領域と非接着領域を正確に定義したほか、極座標を使用して解析を簡素化します。我々は、Exocitosisイベントの極座標に対するカーネル密度推定(KDE)および累積分布関数を用いて、興奮性細胞化の豊かな領域を同定した。リング状のマイクロパターンセルでは、接着領域と非接着領域の境界でクラスタリングが行われた。我々の分析は、統計的ツールを使用して多様な生物学的プロセスの空間分布を調査する方法を示しています。

エキソサイトーシスイベントの時空間的特徴を、hTert-RPE1細胞のVAMP7-pHluorin1010,1111で可視化したリソソームから分析した。hTert-RPE1細胞は、マイクロパターニングによく採用された非形質細胞であり、以前のマイクロパターンベースの研究44,1414で広く使用されてきた。VAMP7は、そのN末端でスーパーエクリプ?...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

微小パターン化細胞上のリソソームエキサイトーシスのライブイメージングは、このプロセスの空間的定量化を可能にする。マイクロパターンを用いたモルフォロジーの正規化は、細胞プロセスの空間分布に関する一般的なルールを明らかにする優れたツールです。

微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

このプロトコルは、TOF顕微鏡によるライブイメージングを用いて細胞分泌を調査する方法を示し、クラスタリングイベントや高活性領域を検出するためのツールを提供します。このプロトコルを用いて、細胞分裂を正常化し、特殊な分泌事象を促進するマイクロパターン表面上の細胞培養を生成することができる。細胞は免疫調節において重要な役割を果たす様々な高分子を分泌する。癌では、規制緩和された分泌は、侵入を促進するタンパク質分解酵素の放出に影響を与える。分泌の定量化により、がんの劣化分泌や抗原提示などの動的プロセスをよりよく理解することができます。当社のイメージングおよび分析プロトコルは簡単ですが、マイクロパターンの一部に広がる単一の細胞の生成が必要です。このビデオでは、マイクロパターンカバーリップ上の細胞を培養する方法と、容量統計ツールを使用して分泌事象を可視化および分析する方法を紹介します。マイクロパターニング用のカバーリップを調製するには、直径25ミリメートルのガラスカバーリップを深紫外線下で5分間殺菌します。カバーリップが活性化されている間に、ポリリジングラフトポリエチレングリコールの1つの30マイクロリットルの滴を、湿気の多いチャンバー内のパラフィンフィルムにカバースリップごとに加えます。活性化の終了時に、カバーリップ活性化面側を下の滴の上に置き、湿気の多いチャンバーを覆い、室温で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、カバーリップを蒸留水で2回洗います。カバースリップが乾燥している間に、水晶のフォトマスクを蒸留水で1回、アルコールで1回洗います。フォトマスクを濾過空気流で乾燥させ、フォトマスククロムコーティングサイドを深紫外線まで5分間露出させます。イルミネーションの最後に、各フォトマスクのクロムコーティングされた側に10マイクロリットルの水を加え、各カバースリップのポリエチレングリコール側を水滴の上に置きます。余分な水を取り除いた後、脱水を避けるためにスライドの上にフィルムカバーを置きます。フォトマスクのクロムコーティングされていない側面をさらに5分間深い紫外線にさらす後、フォトマスクに余分な水を加えてカバーリップを取り除きます。このステップは、表面にマイクロパターンの刻印を生成します。次に、層流フードの下で1時間、湿気の多いチャンバーのパラフィン膜上の細胞外マトリックスタンパク質溶液にカバーリップをインキュベートします。調製したマイクロパターン表面にセルシードを行う場合、インキュベーションの終わりに、カバーリップを磁気カバースリップホルダーマイクロパターン側に上に置き、すぐにカバーリップにパターンメディアを追加します。シールを追加した後、カバースリップホルダーに追加のパターン媒体を充填する前に、磁気デバイスでカバーリップを固定します。その後、ガラスの蓋でホルダーを閉じます。細胞の準備ができたら、5回の50回のトランスフェクトされた不死化網膜色素上皮細胞をカバースリップに加え、細胞培養インキュベーターで10分間ホルダーに細胞をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、1つのピペットを使用して古い培地を吸引し、2番目のピペットを使用して洗浄ごとに新鮮な培地で細胞を5回洗浄し、非付着細胞および残りのウシ胎児血清を除去します。最後の洗浄後、ホルダーを3時間インキュベーターに戻し、完全な細胞の広がるようにします。エキソサイトーシスイベントを画像化するには、カバースリップホルダーを全内部反射蛍光顕微鏡の下に置き、完全に広がるVAMP7-pHluorinを発現する細胞を探します。VAMP7-pHluorinエキソサイトーシスイベントの可視化を可能にする全内部反射蛍光角度までレーザーの角度を変更し、エキソサイトーシス速度とタイムスケールと互換性のある周波数で5分間の取得を行います。エキサイトーシスの座標を取得するには、フィジーで取得したexocytosisイベントムービーを開き、外側に広がる明るい信号の出現によって、手動でエキソサイトーシスイベントを識別します。点ツールを使用して exocytosis イベントの中心をマークし、解析と測定を使用して、X 座標と Y 座標、および時間座標を測定します。1 つのセルの測定値を 1 つのテキスト ファイルに保存します。スプレッドシートでテキスト ファイルを開き、スライス x 列と y 座標列以外の列をすべて削除します。次に、楕円形のツールと測定を使用して、中心と直径を測定し、各セルの x 座標と y 座標とフェレットの直径を取得します。すべてのセルの測定値を 1 つのテキスト ファイルに保存します。スプレッドシートでテキスト ファイルを開き、x と y 座標とフェレットの直径列以外の列をすべて削除します。次に、各セルの半径の測定値を追加し、各セルのフェレットの直径から半径を取得します。直線ツールを使用して、各セルのマイクロパターンリングの厚さを測定します。この測定値を 1 つのテキスト ファイル内のすべてのセルに保存し、接着の長さをセルの半径で割って正規化された接着の長さを計算します。単一セル空間解析の場合は、まず RStudio のパッケージをインストールし、RStudio にパッケージをロードします。ESA 関数を使用してパッケージを実行します。ユーザーインターフェイスが開き、データセット TXT ファイルのディレクトリと出力プロットのディレクトリを選択します。スクリプトは自動的に開始し、解析を実行し、対応するプロットのPDFファイルと数値結果を含むTXTファイルを提供します。細胞の内部では、プローブ内の床はリソソームの低pHによって消し止めされるが、興奮の間、プロトン放出によりpHが増加するにつれてpフルオリンがシグナルを発し始める。pHluorinシグナルは、リソソーム陽子の速い放出を表すエキソサイトーシス中のピークを示し、続いて、原形質膜におけるプローブの2D拡散を表す指数シグナル減衰を示す。典型的には、ヒト網膜網膜色素沈着細胞は、平均エキソサイトーシス率0.28ヘルツの重要なリソソーム分泌活性を示す。カーネル密度推定によってエキソサイトーシスの2D分布を可視化し、局所密度の違いを明らかにすることが可能です。完全な空間的ランダム性から、クラスタリング、分散、またはクラスタリングと分散の混合物という 3 つの逸脱が考えられます。リプリーのK関数は、これらの偏差を評価するために使用することができます。なお、非接着領域におけるエキソサイトーシス事象は、接着分子が、形質膜における分泌ホットスポットを誘導する唯一の構造ではないことを示すクラスター化も行われている。代表細胞の弾性率に従ってエキソサイトーシス事象のヒストグラムをプロットすると、接着剤と非接着領域の境界周辺のピークが明らかになります。対の分析は、表面密度が非接着領域よりも接着領域において低いことを示し、細胞周辺におけるエキソサイトーシスの強い減少に起因する可能性がある。マイクロパターン上の細胞接着と統計解析を組み合わせることで、分泌などの複雑な細胞プロセスが宇宙でどのように制御されているかを特定する機能が容易になります。分泌活性のクラスタリングの根源となる分子メカニズムを決定するには、将来の作業が必要です。

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

クローン原性アッセイ：付着細胞

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

運動の時空間マッピングで<em&gt;エクスビボ</em腸の&gt;準備

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

細胞分裂と拡張の動解析：成長とサンプリング発達ゾーンの細胞基礎での定量化<em&gt;トウモロコシ</em&gt;葉

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...