Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

우리는 크게 VAMP7-pHluorin 플라스미드를 제공하는 티에리 갈리 (정신과 및 신경 과학센터, INSERM)를 인정합니다. 통계 분석과 GOUD 연구소 회원에 대한 조언을 구하여 유익한 토론을 해주신 것에 감사드립니다. 저자는 크게 세포 및 조직 이미징 시설 인정 (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg 및 PICT-IBiSA @Pasteur) 및 니콘 이미징 센터, Institut Curie (파리), 프랑스 국립 연구 인프라 프랑스 -BioImaging의 회원 프랑스 -BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L.은 협회부어 라 레체쉬 르 암 (ARC)에 의해 지원되었고 P.M.은 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 666003에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원받았습니다. 이 작품은 감염 ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), 라벡스 셀티스피비오 (ANR-10-LBX-0038) 및 이덱스 파리 과학 에 레트레스 (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)뿐만 아니라 센터 국립 디 라 리피티크에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 마이크로 패턴 세포의 준비
<ol><li>세포의 전환<ol>
<li>1일 전, 종자 2.5 x 106 hTERT-RPE1 세포를 12웰 플레이트(2 x 2cm)의 1mL배지로 1개의 우물로 넣습니다.</li>
		<li>경질 당일, VAMP7-pHluorin 플라스미드(완충제 100μL, DNA 0.8 μg, 3 μL 의 트랜스페션 혼합물)로 트랜스페션 혼합물을 준비한다. 10 분 동안 인큐베이션하십시오. 참고: VAMP7은 리소좀 v-SNARE로, 발광 플루오린 태그와 융합되어 있습니다. pHl...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

우리는 반지 모양의 마이크로패턴 정규화 된 세포에서 VAMP7-pHluorin의 TIRFM 라이브 셀 이미징에 의해 리소소말 구획에서 외세포증 이벤트를 모니터링하고 외세포증 이벤트의 공간 매개 변수에 대한 엄격한 통계 분석을 수행했습니다. 변형된 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리에 따른 통계 시험을 통해 리소좀으로부터의 분비가 무작위 공정8,,9가아...

외세포증은 소포가 플라즈마 멤브레인과 융합되어 그 함량을 방출하는 보편적 인 세포 과정입니다. 소포는 플라즈마 멤브레인 (전체 융합)과 완전히 융합하거나 제한된 시간 동안 열려있는 융합 모공을 만들 수 있습니다 (키스 앤 런)1. 예를 들면, 새로 합성된 단백질은 골지 복합체에서 온 소포에서 세포외 배지로 풀어 놓입니다. 이 생합성, 전방 급료 경로는 원시, 특히 다세포 유기체에서 신호 펩티드 (예를 들어, 호르몬, 신경 전달 물질) 및 세포 외 매트릭스 구성 요소 (예를 들어, 콜라겐)를 분비뿐만 아니라 플라즈마 막에 대막 단백질을 트래픽. 추가적으로, 분비물은 다른 내분모에서 생길 수 있습니다: 1) 막 단백질을 재사용하기 위하여 내모를 재활용; 2) 다중 혈관 몸 (MVBs) 엑소좀을 방출; 및 3) 프로테오리틱 효소의 방출을 위한 리소좀. 내뇌 분비는 중성염 아웃성장, 의사포디아 형성, 혈장 막 수리 및 ATP 의존신호2에중요한 것으로 나타났다.
단일 세포 수준에서 외세포증을 연구하기 위해 여러 가지 기술이 사용되었습니다. 패치 클램프는 다양한 살아있는 세포3에서높은 시간적 해상도로 단일 외세포증 이벤트를 검출할 수 있게 한다. 그러나 이 방법은 외세포증 이벤트의 국소화에 대한 정보도, 어떤 구획이 발생하는지에 대한 정보를 제공하지 않는다. 전자 현미경 검사는 높은 공간 해상도를 가진 외세포 사건의 직접 시각화를 허용하고, 면역 라벨링과 함께 관련된 구획 및 분자의 특이성에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 단점은 프로세스의 역학에 대한 정보의 부족뿐만 아니라 높은 처리량 연구를 수행 할 수 없다는 것입니다. 커버슬립(100nm) 부근에서 형광을 비추기 위해 에반에센드 필드를 이도하는 총 내부 반사 형광 현미경 검사법(TIRFM)과 같은 경현미경접근법은 외세포증 사건을 연구하기 위한 좋은 시간적 및 공간 적 해상도를 제공한다. 그러나 이 방법은 부착 된 세포와만 호환되며 세포의 복부 / 열등한 부분에만 적용 할 수 있습니다.
참고로, 플라즈마 멤브레인은 제한된 영역에만 존재하는 접착제 복합체를 기반으로 상당한 이질성을 드러냅니다. 이 이질성은 예를 들어, 다른 리간드4의섭취를 제한합니다. 유사하게, 최근에는 골기 복합체로부터의 분비가 혈장 막5의"핫스팟"에 집중되어 있는 것으로 보고되고 있다. 더욱이, 특정 화물은 초점 접착 관련 엑소시토시스6을통해 분비되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 외세포증 이벤트가 공간에 무작위로 분포되는지, 아니면 혈장 막의 특정 부위에 집중되는지 여부에 대한 질문에 특별한 주의를 기울여야 한다. Ripley의 K 함수를 기반으로 한 여러 통계 도구는 이러한 질문을 탐구하기 위해 제안되었습니다7,,8,,9. 우리의 접근은 세포 모양 및 플라즈마 막 이질성을 통제하기 위하여 마이크로패터닝과 이 공구를 결합합니다. 접착제와 미적 영역을 구별하는 수단을 제공하는 것 외에도 이 기술은 다른 세포및 조건에 걸쳐 비교할 수 있으며 통계 분석의 힘을 증가시킵니다.
여기서는 TIRFM 라이브 셀 이미징이 모니터링하는 리소냐구획으로부터의 외세포증 이벤트의 공간 분포를 링 모양의 마이크로패턴-정규화 hTert-RPE1 세포에서 연구하기 위해 다양한 통계 도구를 사용합니다. 리소좀으로부터의 분비액은 무작위 과정이아님을확인하였고,,외세포증 이벤트는 클러스터링을 나타낸다. 참고로, 우리는 외세포증 사건이 또한 미각 부위에 클러스터되어 있다는 것을 것을을 발견했습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력은 클러스터링을 향상시켰습니다. 일관되게, 우리의 분석은 접착제와 nonadhesive 지역 사이 국경에 있는 외세포증의 풍부한 지역을 확인했습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

pHluorin 태그 용불성 N-ethylmalimide-민감한 인자 부착 단백질 REceptor (v-SNARE) 총 내부 반사 형광 현미경 검사법 (TIRFM)에 의해 소포 관련 멤브레인 단백질 7 (VAMP7)의 라이브 이미징은 리소말 구획에서 분비를 탐구하는 간단한 방법입니다. 마이크로패턴 표면에서 세포 배양을 활용하여 세포 형상을 정상화하기 위해 다양한 통계 도구를 사용하여 분비 패턴의 공간 분석을 수행했습니다. 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리(NND)를 기반으로 한 통계 테스트를 사용하여 리소좀의 분비가 무작위 과정이 아니라 상당한 클러스터링을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 참고로, 우리의 분석은 외세포증 사건이 또한 미적혈 부위에 클러스터된다는 것을 밝혔습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력이 클러스터링을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 정확하게 정의된 접착제 및 미적 영역 외에도 이러한 미세 패턴의 원형 형상을 사용하면 극좌표를 사용하여 해석을 단순화할 수 있습니다. 엑소세포증 의 극성 좌표에 커널 밀도 추정(KDE)과 누적 분포 기능을 사용하여 외세포증의 농축 영역을 식별했습니다. 링 모양의 마이크로패턴 세포에서 접착제와 무나정 영역 사이의 경계에서 클러스터링이 발생했습니다. 우리의 분석은 다양한 생물학적 과정의 공간 분포를 조사하기 위해 통계 도구를 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

외세포증 이벤트의 현면 특성은 hTert-RPE1 세포에서 VAMP7-pHluorin10,,11에 의해 시각화된 리소좀으로부터 분석되었다. hTert-RPE1 세포는 마이크로패터닝에 잘 채택되고 이전 마이크로패턴 기반 연구에서 광범위하게 사용된 비변형세포4,,14이다. VAMP7은 리소솜 v-SNARE15로, N-terminus에서 슈퍼 이클립틱 p...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.

마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

이 프로토콜은 TOF 현미경검사법에 의한 라이브 이미징을 사용하여 세포 분비를 조사하는 방법을 보여 주며 군집 이벤트 또는 높은 활성 영역을 검출하는 도구를 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 세포 분열을 정상화하고 따라서 분비 이벤트의 특별한 범위를 용이하게 마이크로 패턴 표면에 세포 배양을 생성 할 수 있습니다. 세포는 면역 조절에서 중요한 역할을 하는 다양한 거대 분자를 분비합니다.암에서, 규제 된 분비 침략을 촉진 하는 단백질 분해 효소의 방출에 영향을 미칩니다. 분비의 정량화는 우리가 암및 항원 프리젠 테이션이 있는 그밖 동적 프로세스에 있는 저하된 분비를 더 잘 이해할 수 있게 해줄 것입니다. 우리의 화상 진찰 및 분석 프로토콜은 간단하더라도, 마이크로 패턴의 조각에 잘 퍼지는 단 하나 세포의 생성을 요구합니다.이 비디오에서는 마이크로패턴 커버립에서 세포를 배양하는 방법과 간격 통계 도구를 사용하여 비밀 이벤트를 시각화하고 분석하는 방법을 시연합니다. 마이크로패터닝을 위해 커버립을 준비하려면 에탄올을 살균하여 25mm 직경의 유리 커버립을 깊은 자외선 아래에서 5분간 활성화하십시오. 커버립이 활성화되는 동안 커버슬립당 폴리에틸렌 글리콜30 마이크로리터 드롭을 습한 챔버 내파라핀 필름에 넣습니다.활성화가 끝나면 커버립활성화 표면면을 낙하에 내려놓고 습한 챔버를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 커버립을 증류수로 두 번 씻으실 수 있습니다. 커버립이 건조되는 동안 석영 포토 마스크를 증류수로 한 번, 술로 한 번 씻으십시오.여과 된 공기 흐름으로 포토 마스크를 건조하고 5 분 동안 깊은 자외선에 깊은 자외선에 크롬 코팅 사진 마스크 크롬을 노출. 조명의 끝에서, 각 사진 마스크의 크롬 코팅 측에 물 10 마이크로 리터 드롭을 추가하고 각 커버 슬립의 폴리에틸렌 글리콜 측면을 물 방울에 배치합니다. 여분의 물을 제거 한 후, 탈수를 방지하기 위해 슬라이드 위에 필름 커버를 배치합니다.사진 마스크의 비크롬 코팅 측면을 깊은 자외선에 노출시키고 5분 간 추가로 포토 마스크에 여분의 물을 추가하여 커버립을 제거합니다. 이 단계는 표면에 마이크로 패턴 인쇄물을 생성합니다. 그런 다음 라미나르 플로우 후드 아래에서 1시간 동안 습한 챔버에서 파라핀 필름에 세포외 매트릭스 단백질 용액으로 커버립을 배양한다.준비된 마이크로패턴 표면에 셀 파종의 경우, 인큐베이션의 끝에 커버립을 자기 커버슬립 홀더 마이크로패턴 측에 넣고 즉시 패턴 매체를 커버립에 추가합니다. 씰을 추가한 후 커버슬립 홀더를 추가 패턴 매체로 채우기 전에 자기 장치로 커버립을 고정합니다. 그런 다음 유리 뚜껑으로 홀더를 닫습니다.세포가 준비되면, 감염된 불멸의 망막 색소 상피 세포의 5분의 5에 5회 10번을 추가하고 세포 배양인에서 10분 동안 홀더내의 세포를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 두 번째 파이펫을 사용하여 세척당 신선한 배지로 세포를 5회 세척하는 동안 오래된 배지를 흡인하기 위해 파이펫 을 사용하여 부착되지 않은 세포와 잔류 태아 소 혈청을 제거하십시오. 마지막 세척 후, 전체 세포 확산을 허용하기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에 홀더를 반환합니다.외세포증 이벤트를 이미지하기 위해, 커버슬립 홀더를 총 내부 반사 형광 현미경 아래에 놓고 완전히 퍼지는 VAMP7-pHluorin을 발현하는 세포를 검색한다. VAMP7-pHluorin 외세포증 이벤트의 시각화가 가능할 때까지 레이저의 각도를 변경하고 외세포 속도 및 시간대와 호환되는 주파수에서 5분 간의 수집을 수행한다. 외세포증 좌표를 얻으려면 피지에서 획득된 엑소시토시스 이벤트 영화를 열고 바깥쪽으로 퍼지는 밝은 신호의 모양으로 엑소시토시스 이벤트를 수동으로 식별합니다.포인트 도구를 사용하여 외세포증 이벤트의 중심을 표시하고 분석 및 측정을 사용하여 x 및 y 좌표뿐만 아니라 측두측 좌표를 측정합니다. 한 텍스트 파일에 한 셀의 측정값을 저장합니다. 스프레드시트에서 텍스트 파일을 열고 슬라이스 x 및 y 좌표 열을 제외한 모든 부분을 제거합니다.다음으로 타원형 도구를 사용하여 측정하여 중심과 직경을 측정하고 각 셀의 x 및 y 좌표 및 Feret의 직경을 얻습니다. 모든 셀의 측정값을 한 텍스트 파일에 저장합니다. 스프레드시트에서 텍스트 파일을 열고 x 및 y 좌표 및 Feret의 지름 열을 제외한 모든 것을 제거합니다.그런 다음 각 셀에 대한 반지름 측정을 추가한 다음 각 셀에 대한 Feret 직경에서 반경을 가져옵니다. 직선 도구를 사용하여 각 셀의 마이크로패턴 링의 두께를 측정합니다. 한 텍스트 파일의 모든 셀에 대해 이 측정값을 저장한 다음 접착 길이를 셀 반경으로 나누어 정규화된 접착 길이를 계산합니다.단일 셀 공간 분석을 위해 먼저 RStudio 패키지를 설치하고 RStudio에 패키지를 로드합니다. ESA 함수로 패키지를 실행합니다. 사용자 인터페이스가 열리고 데이터 집합 TXT 파일의 디렉터리와 출력 플롯에 대한 디렉토리를 선택합니다.스크립트는 자동으로 분석을 시작하고 수행하여 해당 플롯및 숫자 결과가 포함된 TXT 파일의 PDF 파일을 제공합니다. 세포 내부, 프로브의 바닥은 리소좀의 낮은 pH에 의해 담금질되지만, 외세포증 동안, pHluorin은 양성자 방출로 인해 pH가 증가함에 따라 신호를 방출하기 시작한다. pHluorin 신호는 리소소말 양성자의 빠른 방출을 나타내는 외세포증 동안 피크를 나타내고, 플라즈마 멤브레인에서 프로브의 2D 확산을 나타내는 지수 신호 붕괴가 뒤따릅니다.전형적으로, 임신 불멸의 인간 망막 색소 상피 세포는 0.28 Hertz의 평균 외세포율을 가진 중요한 리소말 분비 활성을 보여줍니다. 커널 밀도 추정에 의해 외세포증의 2D 분포를 시각화하여 로컬 밀도의 차이를 나타낼 수 있다. 클러스터링, 분산 또는 클러스터링 및 분산의 혼합물과 같은 완전한 공간 임의성에서 세 가지 가능한 편차가 있습니다.리플리의 K 함수를 사용하여 이러한 편차를 평가할 수 있습니다. 참고로, 비접착영역에서의 외세포증 이벤트는 또한 접착 분자가 혈장 막에서 분비 핫스팟을 유도하는 유일한 구조가 아니라는 것을 나타내는 클러스터링된다. 대표적인 셀에 대한 계수에 따라 외세포증 사건의 히스토그램을 플로팅하면 접착제와 비 접착 영역 사이의 경계 주변의 피크가 드러난다.쌍분석결과, 비유착 영역보다 접착 영역에서 표면 밀도가 낮으며, 잠재적으로 세포 주변의 외세포증의 강한 감소로 인한 것으로 나타났습니다. 마이크로패턴에 대한 세포 접착력과 통계 분석을 결합하면 분비와 같은 복잡한 세포 프로세스가 공간에서 어떻게 조절되는지 파악할 수 있습니다. 분비 활동의 클러스터링의 기초가 되는 분자 메커니즘을 결정하기 위해서는 더 많은 미래의 작업이 필요합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

연구

생물학

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

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운동성의 시공간 매핑<em&gt; 전의 VIVO</em내장의&gt; 준비

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

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세포 분열 및 확장의 운동 학적 분석 : 성장과 샘플링 발달 영역의 세포 기초의 정량화<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; 잎

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...