Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Vi anerkjenner Thierry Galli (Senter for psykiatri og nevrovitenskap, INSERM) for å gi VAMP7-pHluorin plasmid. Vi takker Tarn Duong for råd om statistisk analyse og medlemmer av GOUD-laboratoriet for fruktbare diskusjoner. Forfatterne anerkjenner i stor grad Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg og PICT-IBiSA @Pasteur) og Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem av den franske nasjonale forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. ble støttet av Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) og P.M. mottok støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale no 666003. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) og Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), samt Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Curie.

1. Tilberedning av mikropatterned celler
<ol><li>Transfection av celler<ol>
<li>En dag før transfection, frø 2,5 x 106 hTERT-RPE1 celler i en brønn av en 12 brønnplate (2 x 2 cm) i 1 ml medium.</li>
		<li>På transfectiondagen, forberede transfection blandingen med VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffer, 0,8 μg DNA, 3 μL transfection blanding). Inkuber i 10 min. MERK: VAMP7 er en lysosomal v-SNARE, smeltet sammen med en luminal pHluorin-kode. pHluorin-sonden slukkes av lav pH, men under eksocytosepr...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Vi overvåket eksocytosehendelser fra det lysosomale rommet ved TIRFM levende celleavbildning av VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserte celler og utførte en streng statistisk analyse av de romlige parametrene for exocytosehendelser. Ved hjelp av den forvandlede Ripleys K-funksjon og en statistisk test basert på nærmeste naboavstand, bekreftet vi at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldigprosess 8,9. Begge statistiske analyser viste overbev...

Exocytosis er en universell cellulær prosess der en vesikkel smelter sammen med plasmamembranen og frigjør innholdet. Vesikkelen kan enten smelte helt sammen med plasmamembranen (full fusjon) eller skape en fusjonspor som holder åpent i en begrenset periode (kyss-og-løp)1. For eksempel frigjøres nylig syntetiserte proteiner i det ekstracellulære mediet fra vesikler som kommer fra Golgi-komplekset. Denne biosyntetiske, anterograde banen er primordial, spesielt i flercellede organismer, å skille ut signalering peptider (f.eks hormoner, nevrotransmittere) og ekstracellulære matrisekomponenter (f.eks kollagen), samt trafikktransmembranproteiner til plasmamembranen. I tillegg kan sekreter forekomme fra forskjellige endosomer: 1) resirkulering endosomer for å gjenbruke transmembrane proteiner; 2) multivesikulære organer (MVB) for å frigjøre eksosomer; og 3) lysosomer for frigjøring av proteolytiske enzymer. Endosomal sekresjon har vist seg å være viktig for neuritt utvekst, pseudopodia dannelse, plasma membran reparasjon, og ATP-avhengig signalering2.
For å studere eksocytose på enkeltcellenivå, har flere teknikker blitt brukt. Patch-clamp gjør det mulig å oppdage enkelt exocytosis hendelser med høy temporal oppløsning i et bredt utvalg av levende celler3. Denne metoden gir imidlertid ikke informasjon om lokalisering av exocytosehendelser, heller ikke fra hvilket rom det oppstår. Elektronmikroskopi tillater direkte visualisering av eksokytiske hendelser med høy romlig oppløsning, og i kombinasjon med immunolabeling gir informasjon om spesifisiteten til rommene og molekylene som er involvert. En ulempe med denne tilnærmingen er mangelen på informasjon om dynamikken i prosessen, samt dens manglende evne til å utføre høy gjennomstrømningsstudier. Lett mikroskopi tilnærminger som total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), som utnytter evanescent feltet for å belyse fluoroforer i nærheten av coverslip (100 nm), gir god timelig og romlig oppløsning for å studere exocytosis hendelser. Denne metoden er imidlertid bare kompatibel med tiltalende celler og kan bare brukes på ventral / dårligere del av celler.
Merk at plasmamembranen avslører betydelig heterogenitet basert på klebende komplekser som bare finnes i begrensede områder. Denne heterogeniteten begrenser for eksempel opptaket av forskjellige ligande4. Tilsvarende har det nylig blitt rapportert at sekresjon fra Golgi-komplekset er konsentrert på "hot spots" i plasmamembranen5. Videre er det kjent at visse laster utskilles gjennom fokal-vedheft-assosiert exocytosis6. Dermed bør spesiell oppmerksomhet rettes mot spørsmålet om eksocytosehendelser fordeles tilfeldig i rommet, eller om de er konsentrert på bestemte områder av plasmamembranen. Flere statistiske verktøy basert på Ripleys K-funksjon har blitt foreslått å utforske dissespørsmålene 7,8,9. Vår tilnærming kombinerer disse verktøyene med mikropattering for å kontrollere celleform og plasmamembran heterogenitet. I tillegg til å gi et middel til å skille mellom lim og ikke-adhemmende områder, tillater denne teknikken også sammenligning på tvers av forskjellige celler og forhold og øker kraften i statistiske analyser.
Her bruker vi en rekke statistiske verktøy for å studere romlig fordeling av eksocytosehendelser fra det lysosomale rommet overvåket av TIRFM levende celleavbildning av VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserte hTert-RPE1-celler. Det ble bekreftet at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldigprosess 8,9 og at exocytosis hendelser viser klynger. Merk at exocytosis hendelser også er gruppert i ikke-adhesive områder, noe som indikerer at vedheftmolekyler ikke er de eneste strukturene som kan indusere sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Likevel forbedret celleadhesjon klynger. Konsekvent identifiserte vår analyse berikede områder av eksocytose som lå ved grensen mellom klebemiddel og ikke-adhesive områder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Levende avbildning av pHluorin merket Løselig N-etylaleimide-sensitive-faktor Vedlegg protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-assosiert membran protein 7 (VAMP7) av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) er en enkel måte å utforske sekresjon fra lysosomale rommet. Ved å dra nytte av cellekultur på mikromønstrede overflater for å normalisere celleformen, ble en rekke statistiske verktøy brukt til å utføre en romlig analyse av sekretoriske mønstre. Ved hjelp av Ripleys K-funksjon og en statistisk test basert på nærmeste naboavstand (NND), bekreftet vi at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldig prosess, men viser betydelig klynger. Av notatet viste vår analyse at eksocytosehendelser også er gruppert i ikke-adhesjonsområder, noe som indikerer at vedheftmolekyler ikke er de eneste strukturene som kan indusere sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Likevel fant vi ut at celleadhesjon forbedrer klynger. I tillegg til nøyaktig definerte klebende og ikke-adhemmende områder, tillater den sirkulære geometrien til disse mikropapirene bruk av polare koordinater, noe som forenkler analyser. Vi brukte Kernel Density Estimering (KDE) og den kumulative fordelingsfunksjonen på polare koordinater av eksocytosehendelser for å identifisere berikede områder av eksocytose. I ringformede mikropatternceller oppstod klynger på grensen mellom klebemiddelet og ikke-adhesive områder. Vår analyse illustrerer hvordan statistiske verktøy kan brukes til å undersøke romlige fordelinger av ulike biologiske prosesser.

De spatiotemporale egenskapene til exocytose hendelser ble analysert fra lysosomer visualisert av VAMP7-pHluorin10,11 i hTert-RPE1 celler. hTert-RPE1-celler er ikke-overførte celler som vedtar godt til mikropattering og har blitt mye brukt i tidligere mikropatternbasertestudier 4,14. VAMP7 er en lysosomal v-SNARE15 som ble merket med super ekliptisk pHluorin ved n-terminus og ligg...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Levende avbildning av lysosomal eksokytose på mikropatterned celler tillater en romlig kvantifisering av denne prosessen. Morfologi normalisering ved hjelp av mikropapirer er et fremragende verktøy for å avdekke generelle regler om romlig distribusjon av cellulære prosesser.

Kvantifisere spatiotemporale parametere av cellulær eksokytose i mikropatternede celler

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Denne protokollen viser hvordan du undersøker cellesekresjon ved hjelp av live imaging av TOF mikroskopi og gir verktøy for å oppdage klyngehendelser eller områder med høy aktivitet. Ved hjelp av denne protokollen kan vi generere cellekulturer på mikropapiroverflater som normaliserer celledeling og dermed letter de spesielle områdene av sekretoriske hendelser. Celler utskiller en rekke makromolekyler som spiller viktige roller i immunregulering.Ved kreft påvirker deregulert sekresjon frigjøring av proteolytiske enzymer som letter invasjon. Kvantifiseringen av sekresjon vil gjøre oss i stand til å bedre forstå degradert sekresjon i kreft og andre dynamiske prosesser som har antigenpresentasjon. Selv om vår bilde- og analyseprotokoll er grei, krever det generering av enkeltceller som er godt spredt på et stykke mikropapir.I denne videoen vil vi demonstrere hvordan vi kan kulturceller på mikropapirdeksler og hvordan man visualiserer og analyserer sekretoriske hendelser ved hjelp av spacial statistiske verktøy. For å forberede dekkslips for mikrobrytning, aktiver etanol sterilisert 25 millimeter diameter glassdeksler under dypt ultrafiolett lys i fem minutter. Mens dekksleppene aktiveres, legger du til en 30 mikroliterdråpe polylysintransplantatpolyetylenglykol per deksler på et stykke parafinfilm i et fuktig kammer.På slutten av aktiveringen plasserer du dekkglassene aktivert overflate ned på dråpene og dekker det fuktige kammeret i en times inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, vask dekslene to ganger i destillert vann. Mens dekkslips tørker, vask en kvarts fotomaske en gang med destillert vann og en gang med alkohol.Tørk fotomasken med filtrert luftstrøm og utsett fotomasken krombelagt side opp til dypt ultrafiolett lys i fem minutter. På slutten av belysningen legger du til en 10 mikroliters dråpe vann på den krombelagte siden av hver fotomaske og plasserer polyetylenglykolsiden av hver dekkslip på hver dråpe vann. Etter å ha fjernet overflødig vann, legg et filmdeksel over lysbildene for å unngå dehydrering.Utsett de ikke-krombelagte sidene av fotomaskene for dypt ultrafiolett lys i ytterligere fem minutter før du legger overflødig vann til fotomaskene for å fjerne dekkslipper. Dette trinnet vil produsere mikropapiravtrykk på overflaten. Inkuber deretter dekkslipsene i en ekstracellulær matriseproteinløsning på parafinfilm i et fuktig kammer i en time under en laminær strømningshette.For cellesåing på den tilberedte mikromønstrede overflaten, på slutten av inkubasjonen, legg dekkslipsene i en magnetisk dekkslipsholder mikromønstret side opp og legg umiddelbart mønstermedium til dekkslipsene. Etter å ha lagt til forseglingen, immobilisere dekkglassene med den magnetiske enheten før du fyller dekkslipholderen med ekstra mønstermedium. Lukk deretter holderen med et glasslokk.Når cellene er klare, legg til 5 ganger 10 til den femte av de trans infiserte udødelige netthinnepigmentepitecellene til dekkslepene og inkubere cellene i holderen i 10 minutter i cellekulturinkubatoren. På slutten av inkubasjonen, bruk en pipette til å aspirere det gamle mediet mens du bruker en annen pipette til å vaske cellene fem ganger med friskt medium per vask for å fjerne de ikke-vedlagte cellene og eventuelle gjenværende fosterbovinserum. Etter siste vask, returner holderen til inkubatoren i tre timer for å tillate full cellespredning.For å bilde exocytosis hendelser, plasser dekkglassholderen under en total intern refleksjon fluorescens mikroskop, og søk etter en celle som uttrykker VAMP7-pHluorin som er fullstendig spredt. Endre vinkelen på laseren til en total intern refleksjon fluorescens vinkel som tillater visualisering av VAMP7-pHluorin exocytosis hendelser er nådd og utføre en fem-minutters oppkjøp med en frekvens kompatibel med exocytosis hastighet og tidsskala. For å få exocytosis koordinatene, åpne den oppkjøpte exocytosis hendelsesfilmen i Fiji og manuelt identifisere exocytosis hendelsene ved utseendet av et lyst signal som sprer seg utover.Bruk poengverktøyet til å markere midten av eksocytosehendelsen og bruk analyser og mål for å måle x- og y-koordinatene samt den timelige koordinaten. Lagre målene for én celle i én tekstfil. Åpne tekstfil i et regneark, og fjern alle unntatt kolonnene del x og y-koordinat.Deretter bruker du det ovale verktøyet og måler for å måle midten og diameteren og for å oppnå x- og y-koordinatene og Ferets diameter på hver celle. Lagre målingene av alle celler i én tekstfil. Åpne tekstfilen i et regneark, og fjern alle unntatt kolonnene x og y-koordinat og Ferets diameter.Legg deretter til radiusmålingen for hver celle, og få deretter radiusen fra Ferets diameter for hver celle. Bruk det rette linjeverktøyet til å måle tykkelsen på mikropapirringen på hver celle. Lagre denne målingen for alle celler i én tekstfil, og del deretter vedheftlengden med celleradiusen for å beregne den normaliserte vedheftslengden.For encellet romlig analyse må du først installere pakken med RStudio og laste inn pakken i RStudio. Kjør pakken med ESA-funksjonen. Et brukergrensesnitt åpnes, og deretter velger du katalogen for datasettet TXT-filer og en katalog for utdataplottene.Skriptet vil automatisk starte og utføre analysen, og gir PDF-filer av de tilsvarende plottene og TXT-filene som inneholder de numeriske resultatene. Inne i cellen slukkes gulvet i sonden av lysosomets lave pH, men under eksocytose begynner pHluorin å avgi et signal etter hvert som pH-en øker på grunn av protonutgivelse. pHluorinsignalet viser en topp under eksocytose som representerer rask frigjøring av lysosomale protoner, etterfulgt av et eksponentielt signalforfall som representerer 2D-diffusjonen av sonden ved plasmamembranen.Vanligvis viser transfekt udødeliggjorte humane retinale pigmenterte epitelceller en viktig lysosomal sekresjonsaktivitet med en gjennomsnittlig eksocytoserate på 0,28 Hertz. Det er mulig å visualisere 2D-distribusjonen av eksocytose ved kjernetetthetsestimering for å avsløre forskjeller i lokale tettheter. Det er tre mulige avvik fra fullstendig romlig tilfeldighet:klynger, spredning eller en blanding av klynger og spredning.Ripleys K-funksjon kan brukes til å vurdere disse avvikene. Merk at eksocytosehendelser i det ikke-klebende området også er gruppert som indikerer at vedheftmolekyler ikke er de eneste strukturene som induserer sekretoriske hotspots ved plasmamembraner. Plotting av histogrammet av eksocytosehendelser i henhold til modulus for en representativ celle avslører en topp rundt grensen mellom klebemiddel og ikke-klebende områder.Sammenstilt analyse viser at overflatetettheten er lavere i vedheftsområdet enn i ikke-vedheftsområdet, potensielt på grunn av den sterke reduksjonen av eksocytose i celle periferien. Ved å kombinere celleadhesjon på mikropapirer med statistisk analyse kan muligheten til å finne ut hvordan komplekse cellulære prosesser som sekresjon reguleres i rommet. Mer fremtidig arbeid er nødvendig for å avgjøre hvilken molekylær mekanisme som ligger til grunn for klynger av sekretorisk aktivitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kartlegging av Motilitet i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Forberedelser av tarmen

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematisk analyse av celledeling og Expansion: Kvantifisering Cellular Grunnlag for Vekst og prøvetaking Utviklingssoner i<em&gt; Zea mays</em&gt; Blader

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse av Cytokinetic Hendelser i Fisjon Gjær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...