Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Reconhecemos muito Thierry Galli (Centro de Psiquiatria e Neurociências, INSERM) por fornecer o plasmídeo VAMP7-pHluorin. Agradecemos a Tarn Duong por conselhos sobre análise estatística e membros do laboratório goud por discussões frutíferas. Os autores reconhecem muito as Instalações de Imagem celular e tecidual (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg e PICT-IBiSA @Pasteur) e Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), membro da Infraestrutura Nacional de Pesquisa Francesa France-BioImaging (ANR10-INBS-04). A H.L. foi apoiada pela Associação pour la Recherche sur le Cancer (ARC) e a P.M. recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie nº 666003. Este trabalho foi apoiado por subvenções da INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), do Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) e Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), bem como o Centre National de la Recherche Scientifique e Institut Curie.

1. Preparação de células micropatteradas
<ol><li>Transfecção de células<ol>
<li>Um dia antes da transfecção, as células semente 2,5 x 106 hTERT-RPE1 em um poço de uma placa de 12 poços (2 x 2 cm) em 1 mL de média.</li>
		<li>No dia da transfecção, prepare a mistura de transfecção com plasmídeo vamp7-pHluorin (100 μL de tampão, 0,8 μg de DNA, 3 μL de mistura de transfecção). Incubar por 10 minutos. NOTA: VAMP7 é um v-SNARE lysosômico, fundido com uma tag pHluorin luminal. A sonda p...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. 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P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Monitoramos eventos de exocitose do compartimento lisosômico por tirfm imagem celular viva de VAMP7-pHluorin em células normalizadas em forma de anel e realizamos uma análise estatística rigorosa dos parâmetros espaciais dos eventos de excitose. Empregando a função K da Ripley transformada e um teste estatístico baseado na distância mais próxima do vizinho, confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório8,,9. Ambas as análise...

Exocitose é um processo celular universal no qual uma vesícula se funde com a membrana plasmática e libera seu conteúdo. A vesícula pode se fundir totalmente com a membrana plasmática (fusão total) ou criar um poro de fusão que permanece aberto durante um tempo limitado (beijo-e-corrida)1. Por exemplo, proteínas recém-sintetizadas são liberadas no meio extracelular a partir de vesículas provenientes do complexo golgi. Este caminho biossintético, anterograde é primordial, especialmente em organismos multicelulares, para segregar peptídeos de sinalização (por exemplo, hormônios, neurotransmissores) e componentes de matriz extracelular (por exemplo, colágeno), bem como para traficar proteínas transmembranas para a membrana plasmática. Além disso, secreções podem ocorrer a partir de diferentes endossóis: 1) reciclagem de endósmosos a fim de reutilizar proteínas transmembranas; 2) corpos multivesiculares (MVBs) para liberação de exosóis; e 3) lysososomes para a liberação de enzimas proteolíticas. A secreção endossomal tem se mostrado importante para o crescimento de neurite, formação de pseudopodia, reparação da membrana plasmática e sinalização dependente de ATP2.
Para estudar a exocitese no nível de célula única, várias técnicas foram empregadas. Patch-clamp permite a detecção de eventos de exocitose única com uma alta resolução temporal em uma grande variedade de células vivas3. No entanto, este método não fornece informações sobre a localização de eventos de exocistose, nem de qual compartimento ocorre. A microscopia eletrônica permite a visualização direta de eventos exocióticos com alta resolução espacial, e em combinação com o imunolabeling fornece informações sobre a especificidade dos compartimentos e moléculas envolvidas. Uma desvantagem dessa abordagem é a falta de informação sobre a dinâmica do processo, bem como sua incapacidade de realizar estudos de alto rendimento. A microscopia leve, como a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), que explora o campo evanescente para iluminar fluoroforos nas proximidades do deslizamento de cobertura (100 nm), proporciona boa resolução temporal e espacial para estudar eventos de exocistose. No entanto, este método só é compatível com células aderentes e só pode ser aplicado na parte ventral/inferior das células.
Note-se que a membrana plasmática revela heterogeneidade significativa baseada em complexos adesivos que estão presentes apenas em áreas restritas. Essa heterogeneidade restringe, por exemplo, a absorção de diferentes ligantes4. Da mesma forma, foi recentemente relatado que a secreção do complexo golgi está concentrada em "pontos quentes" na membrana plasmática5. Além disso, sabe-se que certas cargas são secretadas através da exocistose focal associada à adesão6. Assim, deve-se prestar atenção especial à questão de saber se os eventos de exocitose são distribuídos aleatoriamente no espaço, ou se estão concentrados em áreas específicas da membrana plasmática. Várias ferramentas estatísticas baseadas na função K de Ripley foram propostas para explorar essas questões7,,8,,9. Nossa abordagem combina essas ferramentas com micropatterning para controlar a forma celular e heterogeneidade da membrana plasmática. Além de fornecer um meio de distinguir entre áreas adesivas e não adesivas, essa técnica também permite a comparação entre diferentes células e condições e aumenta o poder das análises estatísticas.
Aqui utilizamos uma variedade de ferramentas estatísticas para estudar a distribuição espacial de eventos de excitose a partir do compartimento lisosômico monitorado por imagens de células vivas TIRFM de VAMP7-pHLuorin em células hTert-RPE1 em forma de anel. Foi confirmado que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório8,,9 e que eventos de exocitose exibem agrupamento. Note-se que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas não adesivas, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. No entanto, a adesão celular melhorou o agrupamento. Consistentemente, nossa análise identificou áreas enriquecidas de exocitose que estavam localizadas na fronteira entre as áreas adesivas e não adesivas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Imagem ao vivo da pHluorin marcada como fator solúvel N-ethylmaleimida-fator anexo Proteína de apego REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana associada à vesícula 7 (VAMP7) por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) é uma maneira simples de explorar a secreção do compartimento lysosomal. Aproveitando a cultura celular em superfícies micropatteradas para normalizar a forma celular, uma variedade de ferramentas estatísticas foram empregadas para realizar uma análise espacial de padrões secretos. Usando a função K de Ripley e um teste estatístico baseado na distância do vizinho mais próximo (NND), confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório, mas mostra agrupamento significativo. Note-se que nossa análise revelou que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas de não adesão, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. Ainda assim, descobrimos que a adesão celular aumenta o agrupamento. Além das áreas adesivas e não adesivas precisamente definidas, a geometria circular desses micropatterns permite o uso de coordenadas polares, simplificando as análises. Utilizamos a Estimativa de Densidade do Kernel (KDE) e a função de distribuição cumulativa em coordenadas polares de eventos de exocitose para identificar áreas enriquecidas de exocitose. Em células de micropattern em forma de anel, o agrupamento ocorreu na borda entre as áreas adesivas e não adesivas. Nossa análise ilustra como ferramentas estatísticas podem ser empregadas para investigar distribuições espaciais de diversos processos biológicos.

As características esposteis dos eventos de exocitose foram analisadas a partir de lysososomes visualizados por VAMP7-pHluorin10,11 em células hTert-RPE1. as células hTert-RPE1 são células não transformadas que adotam bem a micropatterning e têm sido amplamente utilizadas em estudos anteriores baseados em micropattern4,14. VAMP7 é um v-SNARE15 lisosômico que foi marcado co...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.

Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Este protocolo demonstra como investigar a secreção celular usando imagens vivas pela microscopia TOF e fornece ferramentas para detectar eventos de clustering ou regiões de alta atividade. Usando este protocolo, podemos gerar culturas celulares em superfícies de micropattern que normalizam a divisão celular e, assim, facilitam as faixas especiais de eventos secretos. As células secretam uma variedade de macromoléculas que desempenham papéis importantes na regulação imunológica.No câncer, a secreção desregulamentada afeta a liberação de enzimas proteolíticas que facilitam a invasão. A quantificação da secreção nos permitirá entender melhor a secreção degradada no câncer e outros processos dinâmicos como a apresentação de antígenos. Embora nosso protocolo de imagem e análise seja simples, requer a geração de células únicas que estão bem espalhadas em um pedaço de micropattern.Neste vídeo, vamos demonstrar como cultivar células em capas de micropattern e como visualizar e analisar eventos secretos usando ferramentas estatísticas espaciais. Para preparar tampas para micropatterning, ative o etanol esterilizado de 25 milímetros de diâmetro de tampas de vidro sob luz ultravioleta profunda por cinco minutos. Enquanto as tampas estão sendo ativadas, adicione uma gota de 30 microliteres de polietileno glicol por deslizamento de cobertura em um pedaço de filme de parafina dentro de uma câmara úmida.No final da ativação, coloque as manchas ativadas lado da superfície para baixo sobre as gotas e cubra a câmara úmida para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as tampas duas vezes em água destilada. Enquanto as tampas estão secando, lave uma máscara de quartzo uma vez com água destilada e uma vez com álcool.Seque a máscara fotográfica com fluxo de ar filtrado e exponha o lado cromado cromado da máscara fotográfica até a luz ultravioleta profunda por cinco minutos. No final da iluminação, adicione uma gota de 10 microliter de água no lado cromado revestido de cada máscara fotográfica e coloque o lado de polietileno glicol de cada mancha em cada gota de água. Depois de remover qualquer excesso de água, coloque uma tampa de filme sobre os slides para evitar a desidratação.Exponha as laterais revestidas não cromadas das máscaras fotográficas à luz ultravioleta profunda por mais cinco minutos antes de adicionar água em excesso às máscaras fotográficas para remover os clipes de cobertura. Esta etapa produzirá as impressões de micropattern na superfície. Em seguida, incubar as tampas em uma solução de proteína de matriz extracelular em filme de parafina em uma câmara úmida por uma hora sob um capô de fluxo laminar.Para a semeadura celular na superfície de micropattern preparada, no final da incubação, coloque as tampas em um lado micropattern portador de tampa magnética para cima e adicione imediatamente o meio padrão às tampas. Depois de adicionar o selo, imobilize as tampas com o dispositivo magnético antes de encher o suporte de deslizamento de tampas com meio de padrão adicional. Em seguida, feche o suporte com uma tampa de vidro.Quando as células estiverem prontas, adicione 5 vezes 10 ao 5º do pigmento de retina imortalizado transfectado células epiteliais aos deslizamentos e incubar as células no suporte por 10 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, use uma pipeta para aspirar o meio antigo enquanto usa uma segunda pipeta para lavar as células cinco vezes com meio fresco por lavagem para remover as células não anexadas e qualquer soro bovino fetal residual. Após a última lavagem, devolva o suporte à incubadora por três horas para permitir a propagação completa da célula.Para os eventos de exocistose de imagem, coloque o titular do deslizamento de tampas sob um microscópio de fluorescência de reflexão interna total e procure por uma célula expressando VAMP7-pHluorin que está totalmente espalhada. Altere o ângulo do laser até que um ângulo total de fluorescência de reflexão interna que permita a visualização de eventos de exocitose VAMP7-pHluorin seja alcançado e realize uma aquisição de cinco minutos em uma frequência compatível com a taxa de exocitose e escala de tempo. Para obter as coordenadas da exocitose, abra o filme de evento de exocitose adquirido em Fiji e identifique manualmente os eventos de exocitose pelo aparecimento de um sinal brilhante que se espalha para fora.Use a ferramenta de ponto para marcar o centro do evento de exocistose e use análise e medida para medir as coordenadas x e y, bem como a coordenada temporal. Salve as medidas de uma célula em um arquivo de texto. Abra o arquivo de texto em uma planilha e remova todas, exceto as colunas fatia x e y-coordinate.Em seguida, use a ferramenta oval e meça para medir o centro e o diâmetro e para obter as coordenadas x e y e o diâmetro de Feret de cada célula. Salve as medidas de todas as células em um arquivo de texto. Abra o arquivo de texto em uma planilha e remova todas, exceto as colunas x e y-coordinate e feret de diâmetro.Em seguida, adicione a medição do raio para cada célula e, em seguida, obtenha o raio do diâmetro do Feret para cada célula. Use a ferramenta de linha reta para medir a espessura do anel de micropattern de cada célula. Guarde esta medição para todas as células em um arquivo de texto e, em seguida, divida o comprimento de adesão pelo raio celular para calcular o comprimento de adesão normalizado.Para análise espacial de célula única, instale primeiro o pacote de RStudio e carregue o pacote no RStudio. Execute o pacote com a função ESA. Uma interface de usuário será aberta e, em seguida, selecionará o diretório para os arquivos TXT de conjunto de dados e um diretório para os gráficos de saída.O script iniciará e executará automaticamente a análise, fornecendo arquivos PDF das parcelas correspondentes e arquivos TXT contendo os resultados numéricos. Dentro da célula, o piso da sonda é saciado pelo pH baixo do lysosome, mas durante a exocitose, a pHLuorin começa a emitir um sinal à medida que o pH aumenta devido à liberação de prótons. O sinal de phluorina exibe um pico durante a exocitese que representa a liberação rápida de prótons liossômicos, seguido por uma decadência exponencial de sinal que representa a difusão 2D da sonda na membrana plasmática.Tipicamente, as células epiteliais pigmentadas da retina humana imortalizadas demonstram uma importante atividade de secreção liossômica com uma taxa média de excitose de 0,28 Hertz. É possível visualizar a distribuição 2D da exocitose pela estimativa de densidade do kernel para revelar diferenças nas densidades locais. Existem três possíveis desvios da aleatoriedade espacial completa: agrupamento, dispersão ou uma mistura de agrupamento e dispersão.A função K de Ripley pode ser usada para avaliar esses desvios. Note-se que os eventos de exocitose na área não adesiva também são agrupados indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que induzem pontos de acesso secretos em membranas plasmáticas. Traçar o histograma dos eventos de exocitose de acordo com o módulo para uma célula representativa revela um pico ao redor da fronteira entre as áreas adesivas e não adesivas.A análise emparelhada demonstra que a densidade da superfície é menor na área de adesão do que na área de não adesão, potencialmente devido à forte diminuição da exoctose na periferia celular. A combinação da adesão celular em micropatters com análise estatística facilita a capacidade de identificar como processos celulares complexos, como a secreção, são regulados no espaço. Mais trabalhos futuros são necessários para determinar qual mecanismo molecular que está por trás do agrupamento da atividade secreta.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Quantificar Yeast Life Span cronológica por conseqüência de células envelhecidas

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Clonogênica Ensaio: células aderentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Quantificar a freqüência de Tumor-propagação células usando Transplante de Células Limitando diluição em singênicos Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Mapeamento espacial e temporal da motilidade em<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparações dos intestinos

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Análise cinemática da Divisão Celular e Expansão: Quantificar a base celular de crescimento e de amostragem de desenvolvimento zonas em<em&gt; Zea mays</em&gt; Folhas

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Análise espacial e temporal da Cytokinetic Eventos na levedura de fissão

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...