Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Мы высоко ценим Тьерри Галли (Центр психиатрии и неврологии, INSERM) за предоставление плазмид VAMP7-pHluorin. Мы благодарим Тарна Дуонга за консультации по статистическому анализу и членов лаборатории GOUD для плодотворных дискуссий. Авторы высоко признают клетки и ткани Imaging фонда (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg и PICT-IBiSA @Pasteur) и Nikon Imaging Center, Институт Кюри (Париж), член французской национальной исследовательской инфраструктуры Франции-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. была поддержана Ассоциацией за рак (ARC) и P.M. получила финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Мари Склодовска-Кюри No 666003. Эта работа была поддержана грантами INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) и Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), а также Национального центра научных исследований и института.

1. Подготовка микропаттернных клеток
<ol><li>Трансфекция клеток<ol>
<li>За день до трансфекции семя 2,5 х 106 hTERT-RPE1 клетки в один колодец 12 пластины (2 х 2 см) в 1 мл среды.</li>
		<li>В день трансфекции подготовьте трансфекцию смесью с плазмидой VAMP7-pHluorin (100 МКЛ буфера, 0,8 мкг ДНК, 3 МКЛ трансфектной с?...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Мы отслеживали события экзоцитоза из лизосомального отсека с помощью живоклеточной визуализации TIRFM VAMP7-pHluorin в кольцеобразных микропаттерн-нормализованных клетках и проводили строгий статистический анализ пространственных параметров событий экзоцитоза. Используя преобразованную ?...

Экзоцитоз является универсальным клеточным процессом, в котором пузырьки сливаются с плазменной мембраной и высвобождает ее содержимое. Vesicle может либо предохранитель полностью с плазменной мембраны (полный синтез) или создать поры синтеза, который остается открытым в течение ограниченного времени (поцелуй изапустить) 1. Например, недавно синтезированные белки высвобождаются во внеклеточную среду из пузырьков, которые поступают из комплекса Golgi. Этот биосинтетический, антероградный путь изначальный, особенно в многоклеточных организмах, выделяет сигнальные пептиды (например, гормоны, нейротрансмиттеры) и внеклеточные матричные компоненты (например, коллаген), а также для движения трансмембранных белков в плазменную мембрану. Кроме того, выделения могут возникать из различных эндосом: 1) рециркуляции эндосом для повторного использования трансмембранных белков; 2) многозвуковые тела (MVB) для высвобождения экзосом; и 3) лизосомы для высвобождения протеолитических ферментов. Эндосомальная секреция была показана, чтобы быть важным для нейрита нарастания, псевдоподии формирования, плазменной мембраны ремонт, и АТФ-зависимыхсигнализации 2.
Для изучения экзоцитоза на уровне одной клетки, несколько методов были использованы. Патч-зажим позволяет обнаруживать одиночные события экзоцитоза с высоким временным разрешением в широком спектре живых клеток3. Однако этот метод не дает информации ни о локализации событий экзоцитоза, ни о том, из какого отсека он происходит. Электронная микроскопия позволяет напрямую визуализировать экзоцитные события с высоким пространственным разрешением, а в сочетании с иммунолабелированием предоставляет информацию о специфике задействованных отсеков и молекул. Недостатком такого подхода является отсутствие информации о динамике процесса, а также его неспособность проводить высокопутные исследования. Подходы световой микроскопии, такие как полная внутренняя флуоресцентная микроскопия отражения (TIRFM), которая использует эвакуационные поля для освещения флюорофоров в непосредственной близости от крышки (100 нм), обеспечивает хорошее временное и пространственное разрешение для изучения событий экзоцитоза. Однако этот метод совместим только с клетками-адептами и может применяться только к брюшной/нижней части клеток.
Следует отметить, что плазменная мембрана выявляет значительную неоднородность на основе клеевых комплексов, которые присутствуют только в ограниченных зонах. Эта неоднородность ограничивает, например, поглощение различных лигандов4. Кроме того, недавно было сообщено, что секреция из комплекса Golgi сосредоточена в "горячих точках" в плазменноймембране 5. Кроме того, известно, что некоторые грузы секретируются с помощью фокус-адгезии связанных экзоцитоз6. Таким образом, особое внимание следует уделить вопросу о том, случайным образом ли в пространстве распределяются события экзоцитоза, или же они сконцентрированы в определенных областях плазменной мембраны. Несколько статистических инструментов, основанных на функции K Рипли были предложены для изучения этихвопросов 7,8,9. Наш подход сочетает в себе эти инструменты с микропаттернированием для контроля формы клеток и неоднородности плазменной мембраны. Помимо предоставления средств для проведения различия между клеевыми и неклейными областями, этот метод также позволяет проводить сопоставления между различными клетками и условиями и увеличивает мощность статистического анализа.
Здесь мы используем различные статистические инструменты для изучения пространственного распределения событий экзоцитоза из лизосомального отсека, контролируемых живоклеточной визуализацией TIRFM VAMP7-pHluorin в кольцеобразных микропаттерн-нормализованных клетках hTert-RPE1. Было подтверждено, что секреция от лизосом неслучайный процесс 8,9 ичто экзоцитоз события демонстрируют кластеризации. Следует отметить, что события экзоцитоза также группируются в неклейвых областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, деление клеток действительно усиливает кластеризацию. Последовательно наш анализ выявил обогащенные участки экзоцитоза, которые находились на границе между клеевыми и неклейными участками.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Live изображения рГлуорин помечены растворимые N-этилмалеймид чувствительных факторов Присоединения белка REceptor (v-SNARE) Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) путем полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (TIRFM) является простой способ изучить секрецию из лизосомального отсека. Воспользовавшись клеточной культурой на микропаттернированных поверхностях для нормализации формы клеток, для выполнения пространственного анализа секреторных моделей были использованы различные статистические инструменты. Используя функцию K Рипли и статистический тест на основе ближайшего расстояния соседа (NND), мы подтвердили, что секреция от лизосом не является случайным процессом, но показывает значительную кластеризацию. Следует отметить, что наш анализ показал, что экзоцитозные события также группируются в неклезионных областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, мы обнаружили, что деление клеток усиливает кластеризацию. Помимо четко определенных клеевых и неклейвых областей, круговая геометрия этих микропаттернов позволяет использовать полярные координаты, упрощая анализы. Мы использовали оценку плотности ядра (KDE) и кумулятивную функцию распределения полярных координат событий экзоцитоза для выявления обогащенных областей экзоцитоза. В кольцеобразных микропаттерновых клетках кластеризация происходила на границе между клеевыми и неклейными областями. Наш анализ показывает, как статистические инструменты могут быть использованы для исследования пространственного распределения различных биологических процессов.

Spatiotemporal характеристики экзоцитоза события были проанализированы из лизосом визуализированы VAMP7-pHluorin10,11 в hTert-RPE1 клеток. клетки hTert-RPE1 являются нетрансформированными клетками, которые хорошо принимают микропаттернирование и широко используются в предыд...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Прямая визуализация лизосомального экзоцитоза на микропаттернальных клетках позволяет пространственную количественную оценку этого процесса. Нормализация морфологии с использованием микропаттернов является выдающимся инструментом для выявления общих правил пространственного распределения клеточных процессов.

Количественная оценка спатиотемпоральных параметров клеточного экзоцитоза в микропаттернальных клетках

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Этот протокол демонстрирует, как исследовать секрецию клеток с помощью живой визуализации с помощью микроскопии TOF и предоставляет инструменты для обнаружения кластерных событий или регионов повышенной активности. Используя этот протокол, мы можем генерировать клеточные культуры на поверхностях микропаттернов, которые нормализуют деление клеток и тем самым облегчают специальные диапазоны секретных событий. Клетки выделяет различные макромолекулы, которые играют важную роль в иммунной регуляции.При раке дерегулированная секреция влияет на высвобождение протеолитических ферментов, способствующих вторжению. Количественная оценка секреции позволит нам лучше понять деградированных секреции при раке и других динамических процессов, таких имеет антиген презентации. Хотя наш протокол визуализации и анализа прост, он требует генерации одиночных ячеек, которые хорошо распределены по куску микропаттерна.В этом видео мы продемонстрируем, как культуры клеток на micropattern coverslips и как визуализировать и анализировать секретные события с помощью спациальных статистических инструментов. Для подготовки крышки для микропаттернов, активировать этанол стерилизованы 25 миллиметров диаметром стеклянные крышки под глубоким ультрафиолетовым светом в течение пяти минут. В то время как coverslips активируются, добавить один 30 микролитер капли полиэтиленового трансплантата полиэтиленгликоль на крышку на кусок парафиновой пленки во влажной камере.В конце активации поместите крышки активированной поверхности вниз на капли и накройте влажную камеру для часовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть крышки два раза в дистиллированной воде. Пока крышки высыхают, смойте кварцевую фотомышку один раз дистиллированной водой и один раз с алкоголем.Высушите фотомысок с фильтрованным потоком воздуха и подвергайте фотомой маске хромированную сторону до глубокого ультрафиолетового света в течение пяти минут. В конце освещения добавьте 10 микролитровых капель воды на хромированную сторону каждой фотома маски и поместите полиэтиленгликольную сторону каждой крышки на каждую каплю воды. После удаления излишков воды, поместите крышку пленки над слайдами, чтобы избежать обезвоживания.Выставить нехом хромированные покрытием стороны фото маски для глубокого ультрафиолетового света в течение еще пяти минут, прежде чем добавить избыток воды в фото маски для удаления coverslips. Этот шаг будет производить микропаттерн отпечатки на поверхности. Затем инкубировать крышки в внеклеточной матрицы белкового раствора на парафиновой пленке во влажной камере в течение одного часа под капотом ламинарного потока.Для посева клеток на подготовленную поверхность микропаттерна, в конце инкубации, поместите крышки в магнитную крышку держателя микропаттерна вверх и сразу же добавьте среду шаблона к обложкам. После добавления уплотнения, обездвижить крышки с магнитным устройством, прежде чем заполнить держатель крышки с дополнительной средой шаблона. Затем закройте держатель стеклянной крышкой.Когда клетки будут готовы, добавить 5 раз 10 к 5-й из трансфицированных увековеченных пигментных пигментов сетчатки эпителиальных клеток к coverslips и инкубировать клетки в держателе в течение 10 минут в инкубаторе культуры клеток. В конце инкубации используйте одну пипетку для аспирации старой среды, используя вторую пипетку для мытья клеток пять раз со свежей средой на стирку, чтобы удалить неприсоеленные клетки и любую остаточную сыворотку крупного рогатого скота плода. После последней стирки верните держатель в инкубатор на три часа, чтобы обеспечить полное распространение клеток.Для изображения событий экзоцитоза поместите держатель крышки под общий внутренний флуоресцентный микроскоп отражения, и поиск клетки, выражаюной VAMP7-pHluorin, который полностью распространяется. Изменение угла лазера до полного внутреннего отражения флуоресценции угол, который позволяет визуализации VAMP7-pHluorin экзоцитоза событий достигнут и выполнить пятиминутное приобретение на частоте, совместимой с скоростью экзоцитоза и сроки. Чтобы получить координаты экзоцитоза, откройте приобретенный фильм об экзоцитозе на Фиджи и вручную определите события экзоцитоза по появлению яркого сигнала, который распространяется наружу.Используйте точечный инструмент, чтобы отметить центр события экзоцитоза и использовать анализ и измерение для измерения х и у-координат, а также временной координаты. Сохраните измерения одной ячейки в одном текстовом файле. Откройте текстовый файл в электронной таблице и удалите все столбцы, кроме среза x и y-coordinate.Затем используйте овальный инструмент и меру для измерения центра и диаметра и получения х и у-координат и диаметра Фере каждой клетки. Сохраните измерения всех ячеек в одном текстовом файле. Откройте текстовый файл в электронной таблице и удалите все столбцы диаметра x и y-coordinate и Feret.Затем добавьте измерение радиуса для каждой ячейки, а затем получите радиус от диаметра Ферета для каждой клетки. Используйте инструмент прямой линии для измерения толщины кольца микропаттерна каждой ячейки. Сохраните это измерение для всех ячеек в одном текстовом файле, а затем разделите длину адгезии на радиус клетки для расчета нормализованной длины адгезии.Для пространственного анализа одной ячейки сначала установите пакет RStudio и загрузите пакет в RStudio. Вы запустите пакет с функцией ESA. Откроется пользовательский интерфейс, а затем выберите каталог для файлов TXT набора данных и каталог для выходных участков.Скрипт автоматически запустит и выполнит анализ, предоставляя PDF-файлы соответствующих участков и файлы TXT, содержащие численные результаты. Внутри клетки пол в зонде утоляется низким рН лизосомы, но во время экзоцитоза, рГлуорин начинает излучать сигнал, как рН увеличивается из-за протонного выпуска. Сигнал рГлуорин демонстрирует пик во время экзоцитоза, который представляет собой быстрое высвобождение лизосомальных протонов, а затем экспоненциальный распад сигнала, который представляет собой 2D диффузию зонда на плазменной мембране.Как правило, трансфект увековечил человека сетчатки пигментированных эпителиальных клеток демонстрируют важную лизосомальную активность секреции со средней скоростью экзоцитоза 0,28 Герц. Можно визуализировать 2D распределение экзоцитоза путем оценки плотности ядра, чтобы выявить различия в местной плотности. Существует три возможных отклонения от полной пространственной случайности: кластеризация, дисперсия или смесь кластеризации и дисперсии.Функция K Рипли может быть использована для оценки этих отклонений. Следует отметить, что экзоцитозные явления в неклейной области также группируются, что указывает на то, что молекулы адгезии не являются единственными структурами, которые вызывают секреторные горячие точки на плазменных мембранах. Построение гистограммы экзоцитоза событий в соответствии с модулом для репрезентативной ячейки показывает пик вокруг границы между клейкой и неклейной областях.Парный анализ показывает, что плотность поверхности ниже в области адгезии, чем в области неприсолиза, потенциально из-за сильного снижения экзоцитоза на периферии клеток. Сочетание клеточной адгезии на микропаттернах со статистическим анализом облегчает возможность определить, как регулируются сложные клеточные процессы, такие как секреция в пространстве. Необходима более будущая работа, чтобы определить, какой молекулярный механизм, который лежат в основе кластеризации секретоорийной деятельности.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Количественная Дрожжи Хронологический продолжительность жизни на вырост возрасте клетки

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Изображений экзоцитоза в клетки сетчатки Биполярный с Микроскопия TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Количественная Частота опухолей, распространяющихся ячеек с использованием Ограничение трансплантации Разбавление сотовый в сингенных данио рерио

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Пространственно-временная Отображение подвижности в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подготовка кишечника

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Кинематический анализ клеточного деления и расширения: Количественная клеточная основа роста и отбора проб Развивающие зон в<em&gt; Zea Mays</em&gt; Листья

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Пространственно-временная Анализ Cytokinetic События в делящихся дрожжей

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...