Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
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Reconocemos mucho a Thierry Galli (Centro de Psiquiatría y Neurociencias, INSERM) por proporcionar el plásmido VAMP7-pHluorin. Agradecemos a Tarn Duong por el asesoramiento sobre análisis estadístico y a los miembros del laboratorio GOUD para debates fructíferos. Los autores reconocen en gran medida el Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg y PICT-IBiSA @Pasteur) y Nikon Imaging Center, Institut Curie (París), miembro de la France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. recibió el apoyo de la Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) y P.M. recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Sk-odowska-Curie no 666003. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) e Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), así como el Centre National de la Rechecher Scientif y Curique Institut.

1. Preparación de células micropatrnadas
<ol><li>Transfección de células<ol>
<li>Un día antes de la transfección, la semilla 2,5 x 106 hTERT-RPE1 células en un pocero de una placa de 12 pozos (2 x 2 cm) en 1 ml de medio.</li>
		<li>El día de la transfección, preparar la mezcla de transfección con plásmido VAMP7-pHluorin (100 l de tampón, 0,8 g de ADN, 3 l de mezcla de transfección). Incubar durante 10 min. NOTA: VAMP7 es un lysosomal v-SNARE, fusionado con una etiqueta de pHluorin luminal. La...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. 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P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Monitoreamos los eventos de exocitosis desde el compartimento lisosomal por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células normalizadas con micropatrón en forma de anillo y realizamos un análisis estadístico riguroso de los parámetros espaciales de los eventos de exocitosis. Empleando la función K transformada de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana, confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio8,,<s...

La exocitosis es un proceso celular universal en el que una vesícula se fusiona con la membrana plasmática y libera su contenido. La vesícula puede fusionarse totalmente con la membrana plasmática (fusión completa) o crear un poro de fusión que permanece abierto durante un tiempo limitado (beso y carrera)1. Por ejemplo, las proteínas recién sintetizadas se liberan en el medio extracelular a partir de vesículas que provienen del complejo Golgi. Esta vía biosintética y anterograda es primordial, especialmente en organismos multicelulares, para secretar péptidos de señalización (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores) y componentes de matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), así como para traficar proteínas transmembranas a la membrana plasmática. Además, las secreciones pueden ocurrir de diferentes endosomas: 1) reciclar endosomas con el fin de reutilizar las proteínas transmembranas; 2) cuerpos multivesiculares (MVB) para liberar exosomas; y 3) lisosomas para la liberación de enzimas proteolíticas. Se ha demostrado que la secreción endosomal es importante para el crecimiento de la neurita, la formación de pseudopodias, la reparación de la membrana plasmática y la señalización dependiente de ATP2.
Para estudiar la exocitosis a nivel de una sola célula, se han empleado varias técnicas. Patch-clamp permite la detección de eventos de exocitosis individuales con una alta resolución temporal en una amplia variedad de células vivas3. Sin embargo, este método no proporciona información sobre la localización de eventos de exocitosis, ni desde qué compartimiento se produce. La microscopía electrónica permite la visualización directa de eventos excíticos con alta resolución espacial, y en combinación con el inmunoetiquetado proporciona información sobre la especificidad de los compartimentos y moléculas involucrados. Una desventaja de este enfoque es la falta de información sobre la dinámica del proceso, así como su incapacidad para realizar estudios de alto rendimiento. Los enfoques de microscopía ligera, como la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), que explota el campo evanescente para iluminar los fluoróforos en las proximidades del cubreobjetos (100 nm), proporciona una buena resolución temporal y espacial para estudiar eventos de exocitosis. Sin embargo, este método sólo es compatible con las células adherentes y sólo se puede aplicar a la parte ventral/inferior de las células.
Cabe destacar que la membrana plasmática revela una heterogeneidad significativa basada en complejos adhesivos que están presentes sólo en áreas restringidas. Esta heterogeneidad restringe, por ejemplo, la captación de diferentes ligandos4. Del mismo modo, recientemente se ha informado de que la secreción del complejo Golgi se concentra en "puntos calientes" en la membrana plasmática5. Además, se sabe que ciertas cargas se secretan a través de la exocitosis asociada a la adhesión focal6. Por lo tanto, se debe prestar especial atención a la cuestión de si los eventos de exocitosis se distribuyen aleatoriamente en el espacio, o si se concentran en áreas específicas de la membrana plasmática. Se han propuesto varias herramientas estadísticas basadas en la función K de Ripley para explorar estas preguntas7,,8,,9. Nuestro enfoque combina estas herramientas con micropatrón para controlar la forma celular y la heterogeneidad de la membrana plasmática. Además de proporcionar un medio para distinguir entre áreas adhesivas y no adhesivas, esta técnica también permite la comparación entre diferentes células y condiciones y aumenta el poder de los análisis estadísticos.
Aquí empleamos una variedad de herramientas estadísticas para estudiar la distribución espacial de eventos de exocitosis desde el compartimiento lisosomal monitoreado por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células hTert-RPE1 normalizadas en forma de anillo. Se confirmó que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio8,9 y que los eventos de exocitosis exhiben agrupación. Cabe destacar que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas no nadhesivas, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Sin embargo, la adhesión celular mejoró la agrupación en clústeres. Consistentemente, nuestro análisis identificó áreas enriquecidas de exocitosis que se encontraban en la frontera entre las áreas adhesivas y no nadhesivas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Las imágenes en vivo de la proteína de membrana asociada al pHluorin etiquetada Soluble N-etillmaleimida-factor Accesorio REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana asociada al Vesículo 7 (VAMP7) por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) es una manera sencilla de explorar la secreción del compartimento lisosomal. Aprovechando el cultivo celular en superficies micropatrieras para normalizar la forma celular, se emplearon una variedad de herramientas estadísticas para realizar un análisis espacial de los patrones secretores. Usando la función K de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana (NND), confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio, sino que muestra clustering significativo. Cabe destacar que nuestro análisis reveló que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas de no adherencia, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Aún así, descubrimos que la adhesión celular mejora la agrupación en clústeres. Además de las áreas adhesivas y nodhesivas definidas con precisión, la geometría circular de estos micropatrón permite el uso de coordenadas polares, simplificando los análisis. Utilizamos la estimación de densidad de núcleo (KDE) y la función de distribución acumulativa en coordenadas polares de eventos de exocitosis para identificar áreas enriquecidas de exocitosis. En las células de micropatrón en forma de anillo, la agrupación se produjo en el borde entre las áreas adhesivas y nodhesivas. Nuestro análisis ilustra cómo se pueden emplear herramientas estadísticas para investigar las distribuciones espaciales de diversos procesos biológicos.

Las características espaciotemporales de los eventos de exocitosis se analizaron a partir de lisosomas visualizados por VAMP7-pHluorin10,,11 en células hTert-RPE1. Las células hTert-RPE1 son células notransformadas que adoptan bien a la micropatrón y se han utilizado ampliamente en estudios anteriores basados en micropatrón4,,14. VAMP7 es un lisosomal v-SNARE15 que fue etique...

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Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Las imágenes en vivo de la exocitosis lisosomal en células micropatrnadas permiten una cuantificación espacial de este proceso. La normalización de la morfología utilizando micropatrón es una herramienta excepcional para descubrir reglas generales sobre la distribución espacial de los procesos celulares.

Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Este protocolo demuestra cómo investigar la secreción celular utilizando imágenes en vivo por microscopía TOF y proporciona herramientas para detectar eventos de agrupación o regiones de alta actividad. Usando este protocolo, podemos generar cultivos celulares en superficies de micropatrón que normalizan la división celular y así facilitar los rangos especiales de eventos secretores. Las células secretan una variedad de macromoléculas que desempeñan un papel importante en la regulación inmune.En el cáncer, la secreción desregulada afecta la liberación de enzimas proteolíticas que facilitan la invasión. La cuantificación de la secreción nos permitirá comprender mejor la secreción degradada en el cáncer y otros procesos dinámicos como la presentación del antígeno. Aunque nuestro protocolo de diagnóstico por imágenes y análisis es sencillo, requiere la generación de células únicas que estén bien extendidas en una pieza de micropatrón.En este video, demostraremos cómo cultivar células en portadas de micropatrón y cómo visualizar y analizar eventos secretores utilizando herramientas estadísticas espaciales. Para preparar cubreobjetos para micropatrón, active los cubreobjetos de vidrio esterilizados con etanol de 25 milímetros de diámetro bajo luz ultravioleta profunda durante cinco minutos. Mientras se activan los cubreobjetos, agregue una gota de 30 microlitro de polietilenglicol por injerto de polilitros en un trozo de película de parafina dentro de una cámara húmeda.Al final de la activación, coloque los cubreobjetos activados en el lado de la superficie hacia abajo sobre las gotas y cubra la cámara húmeda durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los cubreobjetos dos veces en agua destilada. Mientras los cubreobjetos se secan, lave una máscara fotográfica de cuarzo una vez con agua destilada y una vez con alcohol.Seque la máscara fotográfica con flujo de aire filtrado y exponga el lado cromado de la máscara fotográfica recubierto de lado a la luz ultravioleta profunda durante cinco minutos. Al final de la iluminación, agregue una gota de 10 microlitro de agua en el lado cromado de cada máscara de foto y coloque el lado de polietilenglicol de cada cubrelobjetos en cada gota de agua. Después de eliminar el exceso de agua, coloque una cubierta de película sobre los portaobjetos para evitar la deshidratación.Exponga los lados recubiertos no cromados de las máscaras fotográficas a la luz ultravioleta profunda durante cinco minutos adicionales antes de añadir exceso de agua a las máscaras fotográficas para eliminar los cubreobjetos. Este paso producirá las impresiones de micropatrón en la superficie. A continuación, incubar los cubreobjetos en una solución de proteína de matriz extracelular en película de parafina en una cámara húmeda durante una hora bajo una campana de flujo laminar.Para la siembra celular sobre la superficie de micropatrón preparada, al final de la incubación, coloque los cubreobjetos en un soporte de tapa magnética de micropatrón hacia arriba y agregue inmediatamente un medio de patrón a los cubreobjetos. Después de añadir el sello, inmovilice los cubreobjetos con el dispositivo magnético antes de llenar el soporte de cubreobjetos con un medio de patrón adicional. A continuación, cierre el soporte con una tapa de vidrio.Cuando las células estén listas, agregue 5 veces 10 a la 5a de las células epiteliales de pigmento de retina inmortalizados trans infectadas a los cubreobjetos e incubar las células en el soporte durante 10 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, utilice una pipeta para aspirar el medio viejo mientras utiliza una segunda pipeta para lavar las células cinco veces con medio fresco por lavado para eliminar las células no unidas y cualquier suero bovino fetal residual. Después del último lavado, devuelva el soporte a la incubadora durante tres horas para permitir la propagación de la célula completa.Para tomar imágenes de eventos de exocitosis, coloque el soporte de cubreobjetos bajo un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total y busque una célula que exprese VAMP7-pHluorin que esté completamente extendida. Cambie el ángulo del láser hasta que se alcance un ángulo de fluorescencia de reflexión interna total que permita la visualización de eventos de exocitosis VAMP7-pHluorin y realice una adquisición de cinco minutos a una frecuencia compatible con la velocidad de exocitosis y la escala de tiempo. Para obtener las coordenadas de la exocitosis, abra la película de eventos de exocitosa adquirida en Fiji e identifique manualmente los eventos de exocitosis por la aparición de una señal brillante que se extiende hacia el exterior.Utilice la herramienta de punto para marcar el centro del evento de exocitosis y utilice analizar y medir para medir las coordenadas x e y, así como la coordenada temporal. Guarde las medidas de una celda en un archivo de texto. Abra el archivo de texto en una hoja de cálculo y elimine todas las columnas de coordenadas x e y excepto las del sector.A continuación, utilice la herramienta ovalada y mida para medir el centro y el diámetro y para obtener las coordenadas x e y y el diámetro de Feret de cada celda. Guarde las medidas de todas las celdas en un archivo de texto. Abra el archivo de texto en una hoja de cálculo y elimine todas las columnas de coordenadas x e y y de Feret.Luego agregue la medición de radio para cada celda, luego obtenga el radio del diámetro del Feret para cada celda. Utilice la herramienta de línea recta para medir el grosor del anillo de micropatrón de cada celda. Guarde esta medición para todas las celdas en un archivo de texto y, a continuación, divida la longitud de adhesión por el radio de celda para calcular la longitud de adhesión normalizada.Para el análisis espacial de una sola celda, instale primero el paquete de RStudio y cargue el paquete en RStudio. Ejecute el paquete con la función ESA. Se abrirá una interfaz de usuario y, a continuación, seleccione el directorio de los archivos TXT del conjunto de datos y un directorio para los trazados de salida.El script se iniciará y realizará automáticamente el análisis, proporcionando archivos PDF de las gráficas correspondientes y archivos TXT que contienen los resultados numéricos. Dentro de la célula, el suelo en la sonda es sofocado por el bajo pH del lisosoma, pero durante la exocitosis, la pHluorin comienza a emitir una señal a medida que el pH aumenta debido a la liberación de protones. La señal de pHluorin exhibe un pico durante la exocitosis que representa la liberación rápida de protones lisosomales, seguido de una descomposición de la señal exponencial que representa la difusión 2D de la sonda en la membrana plasmática.Típicamente, las células epiteliales pigmentadas de retina humanas transfectizadas demuestran una actividad importante de secreción lisosomal con una tasa media de exocitosis de 0,28 Hercios. Es posible visualizar la distribución 2D de la exocitosis por estimación de densidad del núcleo para revelar diferencias en las densidades locales. Hay tres posibles desviaciones de la aleatoriedad espacial completa: agrupación en clústeres, dispersión o una mezcla de agrupamiento y dispersión.La función K de Ripley se puede utilizar para evaluar estas desviaciones. Cabe destacar que los eventos de exocitosis en el área no adhesiva también se agrupan indicando que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que inducen puntos críticos secretores en las membranas plasmáticas. Trazar el histograma de eventos de exocitosis de acuerdo con el módulo de una célula representativa revela un pico alrededor del borde entre las áreas adhesivas y no adhesivas.El análisis emparejado demuestra que la densidad de la superficie es menor en el área de adhesión que en el área de no adhesión, potencialmente debido a la fuerte disminución de la exocitosis en la periferia celular. La combinación de la adhesión celular en micropatrón con el análisis estadístico facilita la capacidad de identificar cómo se regulan en el espacio los procesos celulares complejos, como la secreción. Se necesita más trabajo futuro para determinar qué mecanismo molecular subyacen a la agrupación de la actividad secretora.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Cuantificar cronológico levadura Duración de la vida por consecuencia de células envejecidas

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

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Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

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Mapeo espacio-temporal de la motilidad en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparaciones de los intestinos

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Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

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Análisis cinemático de la división celular y la expansión: La cuantificación de la base celular del crecimiento y el desarrollo en las zonas de muestreo<em&gt; Zea mays</em&gt; Las hojas

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

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A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

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