Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Vi erkänner i högkly sätt Thierry Galli (Centrum för psykiatri och neurovetenskap, INSERM) för att tillhandahålla VAMP7-pHluorin plasmid. Vi tackar Tarn Duong för råd om statistisk analys och medlemmar av GOUD-laboratoriet för givande diskussioner. Författarna erkänner i hög utläggning av cell- och vävnadsavbildningsfaciliteten (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg och PICT-IBiSA @Pasteur) och Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem av den franska nationella forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. fick stöd av Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) och P.M. fick finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 666003. Detta arbete stöddes av bidrag från INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) och Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), samt Centre National de la Recherche Scientifique och Institut Curie.

1. Beredning av mikromönsterceller
<ol><li>Transfektion av celler<ol>
<li>En dag före transfektion, utsäde 2,5 x 106 hTERT-RPE1 celler i en brunn av en 12 brunnsplatta (2 x 2 cm) i 1 mL medium.</li>
		<li>På dagen för transfektion, förbereda transfektionsblandningen med VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffert, 0,8 μg DNA, 3 μL transfection blandning). Inkubera i 10 min. OBS: VAMP7 är en lysosomal v-SNARE, smält med en luminal pHluorin tagg. pHluorinsonden släcks av lågt pH, men under exocytos ...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Vi övervakade exocytosis händelser från lysosomalt fack genom TIRFM levande cell imaging av VAMP7-pHluorin i ring-formad micropattern-normaliserade celler och utfört en rigorös statistisk analys av de rumsliga parametrarna för exocytosis händelser. Anställa den omvandlade Ripley's K funktion och ett statistiskt test baserat på närmaste granne avstånd, bekräftade vi att utsöndring från lysosomes är inte en slumpmässig process8,9. Båda statistiska ...

Exocytos är en universell cellulär process där en vesikel säkringar med plasmamembranet och släpper dess innehåll. Vesikel kan antingen smälta samman helt med plasmamembranet (full fusion) eller skapa en fusion por som håller öppet under en begränsad tid (kiss-and-run)1. Till exempel frigörs nyligen syntetiserade proteiner i det extracellulära mediet från vesiklar som kommer från Golgi-komplexet. Denna biosyntetiska, anterograde väg är primordial, särskilt i flercelliga organismer, att utsöndra signalering peptider (t.ex., hormoner, signalsubstanser) och extracellulära matriskomponenter (t.ex., kollagen), samt att trafficmembrane proteiner till plasmamembranet. Dessutom kan sekret uppstå från olika endosomes: 1) återvinning endosomes för att återanvända transmembrane proteiner; 2) multivesikulära kroppar (MVBs) att släppa exosomer; och 3) lysosomer för frisättning av proteolytiska enzymer. Endosomal sekretion har visat sig vara viktigt för neurit utväxt, pseudopodia bildning, plasma membran reparation, och ATP-beroende signalering2.
För att studera exocytos på singelcellsnivå har flera tekniker använts. Patch-clamp möjliggör detektering av enstaka exocytos händelser med en hög tidsmässig upplösning i en mängd olika levande celler3. Denna metod ger dock inte information om lokalisering av exocytos händelser, inte heller från vilket fack det sker. Elektronmikroskopi tillåter direkt visualisering av exocytic händelser med hög rumslig upplösning, och i kombination med immunolabeling ger information om specificiteten i de inblandade avdelningar och molekyler. En nackdel med detta tillvägagångssätt är bristen på information om dynamiken i processen, liksom dess oförmåga att utföra studier med hög genomströmning. Lätta mikroskopi metoder såsom total inre reflektion fluorescens mikroskopi (TIRFM), som utnyttjar evanescent fältet för att belysa fluoroforer i närheten av täcken (100 nm), ger god tidsmässiga och rumsliga upplösning för att studera exocytosis händelser. Denna metod är dock endast kompatibel med anhängare celler och kan endast appliceras på den ventrala / sämre delen av celler.
Notera, plasmamembranet avslöjar betydande heterogenitet baserat på självhäftande komplex som endast finns i begränsade områden. Denna heterogenitet begränsar till exempel utnyttjandet av olika ligander4. På samma sätt har det nyligen rapporterats att utsöndring från Golgi-komplexet koncentreras till "hot spots" i plasmamembranet5. Dessutom är det känt att vissa laster utsöndras genom fokal-vidhäftning-associerade exocytos6. Således bör särskild uppmärksamhet ägnas åt frågan om exocytos händelser är slumpmässigt fördelade i rymden, eller om de är koncentrerade till specifika områden av plasmamembranet. Flera statistiska verktyg baserade på Ripleys K funktion har föreslagits att utforska dessa frågor7,8,9. Vårt tillvägagångssätt kombinerar dessa verktyg med mikromönster för att styra cellform och plasmamembran heterogenitet. Förutom att ge ett sätt att skilja mellan självhäftande och nonadhesiva områden, möjliggör denna teknik också jämförelse över olika celler och förhållanden och ökar kraften i statistiska analyser.
Här använder vi en mängd statistiska verktyg för att studera den rumsliga fördelningen av exocytos händelser från lysosomalt fack övervakas av TIRFM levande cell imaging av VAMP7-pHluorin i ringformade micropattern-normaliserade hTert-RPE1 celler. Det bekräftades att utsöndring från lysosomes är inte en slumpmässig process8,9 och att exocytosis händelser uppvisar klustring. Att notera fann vi att exocytosis händelser är också klustrade i nonadhesive områden, vilket tyder på att vidhäftning molekyler är inte de enda strukturer som kan framkalla sekretoriska hotspots vid plasmamembranet. Ändå gjorde celladhesion förbättra klustring. Konsekvent, vår analys identifierat berikade områden av exocytosis som var belägna vid gränsen mellan de självhäftande och nonadhesive områden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

Live imaging av pHluorin taggade Löslig N-etylmaleimid-känslig-faktor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associerade membran protein 7 (VAMP7) av total inre reflektion fluorescens mikroskopi (TIRFM) är ett enkelt sätt att utforska utsöndring från lysosomalt fack. Dra nytta av cellodling på micropatterned ytor att normalisera cellform, en mängd statistiska verktyg var anställd för att utföra en rumslig analys av sekretoriska mönster. Använda Ripleys K-funktion och ett statistiskt test baserat på närmaste granne avstånd (NND), bekräftade vi att sekretion från lysosomes är inte en slumpmässig process men visar betydande klustring. Att notera, vår analys visade att exocytosis händelser är också klustrade i nonadhesion områden, vilket tyder på att vidhäftning molekyler är inte de enda strukturer som kan inducera sekretoriska hotspots vid plasmamembranet. Ändå fann vi att celladhesion förbättrar klustring. Förutom exakt definierade självhäftande och nonadhesiva områden, tillåter den cirkulära geometrin hos dessa mikromönster användningen av polära koordinater, vilket förenklar analyser. Vi använde KDE (Kernel Density Estimation) och den kumulativa fördelningsfunktionen på polära koordinater för exocytoshändelser för att identifiera berikade områden av exocytos. I ringformade mikromönsterceller inträffade klustring vid gränsen mellan de självhäftande och icke-vidhäftande områdena. Vår analys illustrerar hur statistiska verktyg kan användas för att undersöka rumsliga fördelningar av olika biologiska processer.

De spatiotemporal egenskaperna hos exocytosis händelser analyserades från lysosomes visualiseras av VAMP7-pHluorin10,11 i hTert-RPE1 celler. hTert-RPE1 celler är icke-transformerade celler som antar väl till micropatterning och har använts i stor utsträckning i tidigare mikromönster-baseradestudier 4,14. VAMP7 är en lysosomal v-SNARE15 som var märkta med super ekliptikan p...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Live imaging av lysosomal exocytosis på micropatterned celler tillåter en rumslig kvantifiering av denna process. Morfologi normalisering med hjälp av mikromönster är ett enastående verktyg för att avslöja allmänna regler om den rumsliga fördelningen av cellulära processer.

Kvantifiera Spatiotemporal parametrar för cellulära Exocytosis i mikromönster celler

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Det här protokollet demonstrerar hur du undersöker cellsekretion med hjälp av live-avbildning av TOF-mikroskopi och tillhandahåller verktyg för att upptäcka klustringshändelser eller regioner med hög aktivitet. Med hjälp av detta protokoll kan vi generera cellkulturer på mikromönsterytor som normaliserar celldelning och därmed underlättar de speciella intervallen av sekretoriska händelser. Celler utsöndra en mängd olika makromolekyler som spelar viktiga roller i immunreglering.Vid cancer påverkar avreglerad utsöndring frisättningen av proteolytiska enzymer som underlättar invasionen. Kvantifieringen av utsöndring kommer att göra det möjligt för oss att bättre förstå försämrad utsöndring i cancer och andra dynamiska processer som har antigen presentation. Även om vår bildbehandling och analys protokoll är okomplicerad, det kräver generering av enstaka celler som är väl spridda på en bit av micropattern.I den här videon kommer vi att demonstrera hur man odlar celler på mikromönster och hur man visualiserar och analyserar sekretoriska händelser med hjälp av spacial statistiska verktyg. För att förbereda coverslips för mikromönster, aktivera etanol steriliserade 25 millimeter diameter glasklinor under djupt ultraviolett ljus i fem minuter. Medan täcken aktiveras, tillsätt en 30 microliter droppe polylysintransplantat polyetylenglykol per coverslip på en bit paraffin film i en fuktig kammare.Placera täcksliparna aktiverade ytsidan ner på dropparna och täck den fuktiga kammaren under en timmes inkubation vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, tvätta täckskydden två gånger i destillerat vatten. Medan täcken torkar, tvätta en kvarts fotomask en gång med destillerat vatten och en gång med alkohol.Torka fotomasken med filtrerat luftflöde och exponera fotomasken krombelagd sida upp till djupt ultraviolett ljus i fem minuter. I slutet av belysningen, tillsätt en 10 mikroliter droppe vatten på den krombelagda sidan av varje foto mask och placera polyetylenglykol sidan av varje coverslip på varje droppe vatten. När du har tagit bort eventuellt överflödigt vatten, placera en film täcka över bilderna för att undvika uttorkning.Exponera fotomaskernas icke-krombelagda sidor för djupt ultraviolett ljus i ytterligare fem minuter innan du lägger till överflödigt vatten i fotomaskerna för att ta bort täcken. Detta steg kommer att producera mikromönster avtryck på ytan. Sedan inkubera täcken i en extracellulär matrisproteinlösning på paraffinfilm i en fuktig kammare i en timme under en laminär flödeshuva.För cellsådd på den förberedda mikromönsterytan, i slutet av inkubationen, placera täcken i en magnetisk täckpappershållare mikromönster sida upp och omedelbart lägga mönster medium till täcken. Efter att ha lagt till tätningen, immobiliserar du täcksliparna med den magnetiska enheten innan du fyller på täckpappershållaren med ytterligare mönstermedium. Stäng sedan hållaren med ett glaslock.När cellerna är klara, tillsätt 5 gånger 10 till den 5: e av transfected förevigade retinal pigment epitelceller till coverslips och inkubera cellerna i hållaren i 10 minuter i cellkulturen inkubatorn. I slutet av inkubationen, använd en pipetten för att aspirera det gamla mediet medan du använder en andra pipett för att tvätta cellerna fem gånger med färskt medium per tvätt för att avlägsna de icke-bifogade cellerna och eventuellt kvarvarande fetalt bovint serum. Efter den sista tvätten, returnera hållaren till inkubatorn i tre timmar för att tillåta full cell spridning.För att avbilda exocytosis händelser, placera coverslip innehavaren under en total inre reflektion fluorescens mikroskop, och söka efter en cell som uttrycker VAMP7-pHluorin som är fullt utspödd. Ändra laserns vinkel tills en total inre reflektion fluorescens vinkel som gör att visualiseringen av VAMP7-pHluorin exocytosis händelser nås och utföra en fem minuters förvärv med en frekvens som är förenlig med exocytosis hastighet och tidsskala. För att erhålla de exocytosis koordinaterna, öppna den förvärvade exocytos händelse filmen i Fiji och manuellt identifiera händelserna exocytosis genom uppkomsten av en ljus signal som sprider sig utåt.Använd punktverktyget för att markera mitten av händelsen exocytos och använda analysera och mäta för att mäta x och y-koordinaterna samt den tidsmässiga koordinaten. Spara måtten på en cell i en textfil. Öppna textfil i ett kalkylblad och ta bort alla kolumnerna för segmentet x och y-koordinater.Därefter använder ovalverktyget och mäter för att mäta centrum och diameter och för att erhålla x och y-koordinaterna och Ferets diameter på varje cell. Spara alla cellers mått i en textfil. Öppna textfilen i ett kalkylblad och ta bort alla utom x- och y-koordinaten och Ferets diameterkolumner.Lägg sedan till radiemätningen för varje cell, sedan erhålla radien från Feret diameter för varje cell. Använd verktyget för rak linje för att mäta tjockleken på mikromönsterringen i varje cell. Spara denna mätning för alla celler i en textfil och dividera sedan vidhäftningslängden med cellradien för att beräkna den normaliserade vidhäftningslängden.För single cell spatial analysis, först installera paketet med RStudio och ladda paketet i RStudio. Kör paketet med funktionen ELEKTRISKA UNDERENHET. Ett användargränssnitt kommer att öppnas, välj sedan katalogen för datamängden TXT filer och en katalog för utdata tomter.Skriptet kommer automatiskt att starta och utföra analysen, vilket ger PDF-filer av motsvarande tomter och TXT filer som innehåller de numeriska resultaten. Inuti cellen är golvet i sond släckt av lysosomens låga pH-värde, men under exocytos börjar pHluorin avge en signal när pH-värdet ökar på grund av protonutgivning. pHluorin signalen uppvisar en topp under exocytosis som representerar den snabba frisättningen av lysosomal protoner, följt av en exponentiell signal sönderfall som representerar 2D diffusion av sonden vid plasma membranet.Typiskt, transfect förevigade mänskliga retinal pigmenterad epitelial celler visar en viktig lysosomal sekretion verksamhet med en genomsnittlig exocytosis hastighet av 0,28 Hertz. det är möjligt att visualisera 2D-fördelningen av exocytosis genom kärnan densitet uppskattning att avslöja skillnader i lokala densiteter. Det finns tre möjliga avvikelser från fullständig rumslig slumpmässighet:klustring, spridning, eller en blandning av klustring och spridning.Ripleys K-funktion kan användas för att bedöma dessa avvikelser. Att notera, exocytosis händelser i icke-självhäftande området är också klustrade vilket indikerar att vidhäftning molekyler är inte de enda strukturer som inducerar sekretoriska hotspots vid plasmamembran. Plottning histogram av exocytosis händelser enligt modulus för en representativ cell avslöjar en topp runt gränsen mellan lim och icke-självhäftande områden.Parat analys visar att ytdensiteten är lägre i vidhäftningsområdet än i området icke-vidhäftning, potentiellt på grund av den kraftiga minskningen av exocytos vid cellens periferi. Att kombinera celladhesion på mikromönster med statistisk analys underlättar förmågan att sätta fingret på hur komplexa cellulära processer som utsöndring regleras i rymden. Mer framtida arbete behövs för att avgöra vilken molekylär mekanism som ligger bakom klustring av sekretorisk aktivitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mätning exocytos i de nervceller Använda FM-märkning

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Kvantifiering Jäst Span Kronologisk Life av utväxt av Aged celler

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imaging exocytos i näthinnan bipolär Celler med TIRF Mikroskopi

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Klonogena analysen: Vidhäftande Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Kvantifiera frekvens av tumör-förökningsmaterial celler med Begränsa Transplantation Utspädning Cell i syngena Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kartläggning av motilitet i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Förberedelser tarm

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematisk analys av celldelning och Expansion: kvantifiera Cellular grundval av tillväxt och provtagning Develop zoner i<em&gt; Zea mays</em&gt; blad

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analys av Cytokinetic händelser i fissionsjäst

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...