Name: quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Biz büyük ölçüde Thierry Galli (Psikiyatri ve Nörobilim merkezi, INSERM) VAMP7-pHluorin plazmid sağlamak için kabul. Tarn Duong'a istatistiksel analiz ler ve goud laboratuvarı üyeleri nezdinde ki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Yazarlar büyük ölçüde Hücre ve Doku Görüntüleme Tesisi (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg ve PICT-IBiSA @Pasteur) ve Nikon Görüntüleme Merkezi, Institut Curie (Paris), Fransız Ulusal Araştırma Altyapısı Fransa-BiyoGörüntüleme (ANR10-INBS-04) üyesi kabul. H.L. Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) tarafından desteklendi ve P.M. Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 666003 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon aldı. Bu çalışma, INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) ve Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) yanı sıra Centre National de la Recherche Scientique and Curie'nin bağışları ile desteklenmiştir.

1. Mikro desenli hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Hücrelerin transfeksiyonu<ol>
<li>Transfeksiyondan bir gün önce, tohum 2.5 x 106 hTERT-RPE1 hücrelerini 1 mL orta 12 kuyuplakadan (2 x 2 cm) bir kuyuya yerleştirin.</li>
		<li>Transfeksiyon gününde, transfeksiyon karışımını VAMP7-pHluorin plazmid (100 μL tampon, 0.8 g DNA, 3 μL transfection karışımı) ile hazırlayın. 10 dakika kuluçka. NOT: VAMP7 bir lysosomal v-SNARE, luminal pHluorin etiketi ile erimiş. PHluorin probu düşük pH i...

<ol>
	<li>Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders.">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling.">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li><li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions.">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li><li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex.">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li><li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics.">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914 (2013).</li><li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+"Hotspots"+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells.">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li><li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change.">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li><li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+(Ti-Vamp)+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth.">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane.">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li><li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).</li><li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li><li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments.">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li><li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures.">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li><li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy.">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311 (2018).</li><li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+kernel+estimators+for+density+functions.">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics &amp; Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li></ol>

Ring şeklindeki mikrodesen-normalleşmiş hücrelerde VAMP7-pHluorin'in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile lisozomal kompartmandan ekzositoz olaylarını izledik ve ekzositoz olaylarının uzamsal parametrelerinin titiz bir istatistiksel analizini yaptık. Dönüştürülmüş Ripley's K fonksiyonu ve en yakın komşu mesafesine göre istatistiksel bir test istihdam, biz lizozomlardan salgı rastgele bir işlem8olmadığını doğruladı8 ,9. Her iki istat...

Eksozisoz, vezikülün plazma zarı ile kaynaşıp içeriğini serbest bıraktırdığı evrensel bir hücresel süreçtir. Vezikül ya plazma membran (tam füzyon) ile tamamen sigorta veya sınırlı bir süre boyunca açık kalır bir füzyon gözenek oluşturmak (kiss-and-run)1. Örneğin, yeni sentezlenen proteinler Golgi kompleksinden gelen veziküllerden hücre dışı ortama salınır. Bu biyosentetik, anterograd yolu ilkel, özellikle çok hücreli organizmalarda, sinyal peptidler salgılamak için (örneğin, hormonlar, nörotransmitterler) ve ekstrasellüler matriks bileşenleri (örneğin, kollajen), yanı sıra plazma membran trafik transmembran proteinleri. Ayrıca, salgıları farklı endozomlarda oluşabilir: 1) transmembran proteinleri yeniden kullanmak için geri dönüşüm endozoslar; 2) çok vezizküler cisimler (MVBs) ekzozomlar serbest bırakmak için; ve 3) proteolitik enzimlerin salınımı için lizozomlar. Endozomal salgının neurite büyüme, psödopodi oluşumu, plazma membran onarımı ve ATP'ye bağlı sinyalizasyon2için önemli olduğu gösterilmiştir.
Tek hücre düzeyinde eksofisoz çalışması için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Patch-clamp canlı hücrelerin geniş bir yelpazede yüksek zamansal çözünürlük ile tek eksozis olaylarının tespiti için izin verir3. Ancak, bu yöntem eksozis olaylarının yerelleştirilmesi veya hangi bölmeden oluştuğu hakkında bilgi sağlamaz. Elektron mikroskobu, ekszositik olayların yüksek uzamsal çözünürlükte doğrudan görüntülenmesine olanak sağlar ve immünetiketleme ile birlikte ilgili bölmelerin ve moleküllerin özgüllüğü hakkında bilgi sağlar. Bu yaklaşımın bir dezavantajı sürecin dinamikleri hakkında bilgi eksikliği yanı sıra yüksek iş itimat ları gerçekleştirmek için yetersizlik olduğunu. Coverslip (100 nm) civarındaki floroforları aydınlatmak için evanescent alanını kullanan total internal yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) gibi ışık mikroskobu yaklaşımları, eksositoz olaylarını incelemek için iyi zamansal ve mekansal çözünürlük sağlar. Ancak, bu yöntem sadece yapışık hücrelerle uyumludur ve sadece hücrelerin ventral/alt kısmına uygulanabilir.
Dikkat dikkat, plazma membran sadece kısıtlı alanlarda mevcut yapışkan kompleksleri dayalı önemli heterojenite ortaya koymaktadır. Bu heterojenlik, örneğin, farklı ligandsalımınıkısıtlar 4 . Benzer şekilde, son zamanlarda Golgi kompleksinden salgı plazma membran"sıcaknoktalar" 5 yoğunlaşmıştır bildirilmiştir. Ayrıca bazı kargoların fokal-yapışma ile ilişkili eksozitoz6ile salgılandırılan bilinmektedir. Bu nedenle eksositoz olaylarının uzayda rastgele dağılıp dağıtılmadığı veya plazma zarının belirli bölgelerinde yoğunlanıp yoğunlaşmadığı sorusuna özel bir dikkat edilmelidir. Ripley's K fonksiyonudayalı çeşitli istatistiksel araçlar bu soruları keşfetmek için önerilmiştir7,8,9. Yaklaşımımız hücre şekli ve plazma membran heterojenliğini kontrol etmek için mikro desenleme ile bu araçları birleştirir. Yapışkan ve yapışkan olmayan alanları ayırt etmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, bu teknik aynı zamanda farklı hücreler ve koşullar arasında karşılaştırma sağlar ve istatistiksel analizlerin gücünü artırır.
Burada, RING şekilli mikro desenli hTert-RPE1 hücrelerinde VAMP7-pHluorin'in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile izlenen lysosomal kompartmandan ekzositoz olaylarının mekansal dağılımını incelemek için çeşitli istatistiksel araçlar uyguluyoruz. Bu izozomlardan salgı rastgele bir süreç8,,9 değildir ve ekzositoz olayları kümelenme sergi doğrulandı. Eksozis olaylarının da adhesif olmayan bölgelerde kümelenmiş olduğunu ve adezyon moleküllerinin plazma zarında salgı layıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapı olmadığını gördük. Yine de, hücre yapışması kümeleme geliştirmek yaptı. Analizlerimiz sürekli olarak yapışkan ve yapışkan olmayan bölgeler arasındaki sınırda bulunan zenginleştirilmiş eksofis alanları tespit etti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1512px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Chamlide Magnetic Chamber</td>
			<td style="width:259px;">Chamlide</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:803px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibrinogen</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td style="width:207px;">F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">hTert RPE1 cell line</td>
			<td style="width:259px;">https://www.atcc.org</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">ImageJ</td>
			<td style="width:259px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">JetPRIME Transfection reagent</td>
			<td style="width:259px;">Polyplus</td>
			<td style="width:207px;">114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Gibco</td>
			<td style="width:207px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Photomask</td>
			<td style="width:259px;">Delta Mask</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">PLL-g-PEG solution</td>
			<td style="width:259px;">Surface Solutions</td>
			<td style="width:207px;">PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">R Software</td>
			<td style="width:259px;">https://www.r-project.org/</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">Trypsin (TrypLE Express 1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">UV ozone oven</td>
			<td style="width:259px;">Jelight Company Inc</td>
			<td style="width:207px;">342-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:244px;">VAMP7-pHFluorin plasmid</td>
			<td style="width:259px;">n/a</td>
			<td style="width:207px;">n/a</td>
			<td style="width:803px;">Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. 
			J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. 
			Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. 
			Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spatiotemporal parameters of cellular exocytosis in micropatterned cells

PHluorin etiketli Çözünür N-etilmaleimid-duyarlı faktör Ek protein ReEceptor (v-SNARE) Vezikül ilişkili membran protein 7 (VAMP7) toplam iç yansıma floresan mikroskop (TIRFM) tarafından canlı görüntüleme lisosomal bölmesi salgıyı keşfetmek için basit bir yoldur. Hücre şeklini normalleştirmek için mikro desenli yüzeylerdeki hücre kültüründen yararlanarak, salgı desenlerinin mekansal analizini yapmak için çeşitli istatistiksel araçlar kullanılmıştır. Ripley'in K fonksiyonunu ve en yakın komşu mesafesine (NND) dayalı istatistiksel bir test kullanarak, lizozomlardan salgılanmanın rastgele bir süreç olmadığını, ancak önemli kümelenmeler gösterdiğini doğruladık. Analizlerimiz eksozis olaylarının da yapışmaz bölgelerde kümelenmiş olduğunu ortaya çıkararak, plazma zarında salgılayıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapının yapışma molekülleri olmadığını göstermektedir. Yine de, hücre yapışmanın kümeleme artırır bulundu. Tam olarak tanımlanmış yapışkan ve yapışkan olmayan alanlara ek olarak, bu mikro desenlerin dairesel geometrisi kutupsal koordinatların kullanılmasına olanak sağlar ve analizleri basitleştirir. Eksozisin zenginleştirilmiş alanlarını belirlemek için Çekirdek Yoğunluk Tahmini (KDE) ve eksozis olaylarının polar koordinatlarında kümülatif dağılım fonksiyonunu kullandık. Halka şeklindeki mikro desenli hücrelerde, yapıştırıcı ve yapışkan olmayan alanlar arasındaki sınırda kümelenme meydana geldi. Analizlerimiz, çeşitli biyolojik süreçlerin mekansal dağılımlarını araştırmak için istatistiksel araçların nasıl kullanılabildiğini göstermektedir.

Ekzositoz olaylarının spatiotemporal özellikleri VAMP7-pHluorin10,11 hTert-RPE1 hücrelerinde görüntülenen lizozomlardan analiz edildi. hTert-RPE1 hücreleri mikro desenleme iyi benimsemek ve yaygın önceki mikrodesen tabanlı çalışmalarda kullanılmıştır dönüştürülmemiş hücrelerdir4,14. VAMP7, N-terminus'unda süper ekliptik pHluorin ile etiketlenmiş ve lizoomun lümeninde bulunan bi...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells at JoVE.com

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.

Mikro Desenli Hücrelerde Hücresel Eksositozun Spatiotemporal Parametrelerinin Ölçülmesi

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Bu protokol, TOF mikroskobu ile canlı görüntüleme kullanılarak hücre salgılanmasının nasıl araştırılabildiğini gösterir ve kümeleme olaylarını veya yüksek aktivite bölgelerini tespit etmek için araçlar sağlar. Bu protokolü kullanarak, hücre bölünmesini normalleştiren ve böylece özel salgı olayları aralıklarını kolaylaştıran mikro desen li yüzeylerde hücre kültürleri oluşturabiliriz. Hücreler bağışıklık regülasyonunda önemli rol oynayan çeşitli makromoleküller salgılarlar.Kanserde, deregulated salgıin invazyonu kolaylaştıran proteolitik enzimlerin salınımını etkiler. Salgının nicelleştirilmesi, kanserde bozulmuş salgıyı ve antijen sunumu olan diğer dinamik süreçleri daha iyi anlamamızı sağlayacaktır. Görüntüleme ve analiz protokolümüz basit olmasına rağmen, bir mikro desen parçasıüzerinde iyi yayılan tek hücrelerin üretilmesi gerekir.Bu videoda, mikro desen kapakları üzerindeki hücrelerin nasıl kültürlendirilebildiğini ve salgı olaylarını aralıklı istatistiksel araçlar kullanarak nasıl görselleştirilip analiz edebileceğimizi göstereceğiz. Mikro desenleme için kapaklar hazırlamak için, etanol sterilize 25 milimetre çapında cam kapakları derin ultraviyole ışık altında beş dakika aktif hale getirin. Kapaklar aktif hale getirilirken, kapak başına 30 mikrolitrelik polilizin greft polietilen glikol damlası, nemli bir oda içinde bir parafin filminin üzerine ekleyin.Aktivasyonun sonunda, kapaklar aktif yüzey tarafını damlaların üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için nemli hazneyi kapatın. Kuluçka sonunda, kapakları iki kez distile suda yıkayın. Kapaklar kururken, bir kere de distile su ve alkol ile bir kez kuvars fotoğraf maskesi yıkayın.Filtrelenmiş hava akışı ile fotoğraf maskesi kuru ve beş dakika boyunca derin ultraviyole ışığa kadar fotoğraf maskesi krom kaplı tarafı ortaya. Aydınlatma sonunda, her fotoğraf maskesikrom kaplı tarafına 10 mikrolitre lik su damlası ekleyin ve her bir kapak sıvısının polietilen glikol tarafını her bir damla suyun üzerine yerleştirin. Herhangi bir fazla su çıkardıktan sonra, dehidratasyon önlemek için slaytlar üzerinde bir film kapağı yerleştirin.Kapak dudaklarını çıkarmak için fotoğraf maskelerine fazla su eklemeden önce fotoğraf maskelerinin krom kaplı olmayan kenarlarını beş dakika daha derin ultraviyole ışığa maruz bırakın. Bu adım yüzeyde mikro desen izleri üretecektir. Daha sonra bir laminar akış kaputu altında bir saat boyunca nemli bir odada parafin film üzerinde bir ekstrasellüler matris protein çözeltisi kapakları kuluçka.Hazırlanan mikrodesen yüzeyine hücre tohumlama için, kuluçka sonunda, bir manyetik coverslip tutucu mikrodesen tarafı içine kapakları yerleştirin ve hemen coverlips desen orta ekleyin. Mührü ekledikten sonra, kapak tutucusunu ek desen ortamıyla doldurmadan önce kapak dudaklarını manyetik cihazla hareketsiz hale getirin. Sonra bir cam kapak ile tutucu kapatın.Hücreler hazır olduğunda, transfeced immortalized retinal pigment epitel hücrelerinin 5 için 5 kat ekleyin kapakları ve hücre kültürü kuluçka 10 dakika boyunca tutucu hücreleri kuluçka. Kuluçka sonunda, bağlı olmayan hücreleri ve herhangi bir artık fetal sığır serumkaldırmak için yıkama başına taze orta ile hücreleri beş kez yıkamak için ikinci bir pipet kullanırken eski orta aspire etmek için bir pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, tam hücre yayılmasını sağlamak için üç saat boyunca kuvöz için tutucu iade.Eksozis olaylarını görüntülemek için, kapak tutucuyu toplam bir iç yansıma floresan mikroskobu altına yerleştirin ve tamamen yayılmış VAMP7-pHluorin'ü ifade eden bir hücre arayın. VAMP7-pHluorin eksozis olaylarının görüntülenmesine olanak tanıyan toplam iç yansıma floresan açısına ulaşınve eksoz oranı ve zaman ölçeği ile uyumlu bir frekansta beş dakikalık bir kazanım gerçekleştirene kadar lazerin açısını değiştirin. Eksoz koordinatlarını elde etmek için, Fiji'de edinilmiş eksozis olay filmini açın ve dışa doğru yayılan parlak bir sinyal görünümüyle eksozis olaylarını manuel olarak tanımlayın.Eksoz olayının merkezini işaretlemek için nokta aracını kullanın ve x ve y-koordinatlarının yanı sıra zamansal koordinatı ölçmek için analiz ve ölçü kullanın. Bir hücrenin ölçümlerini tek bir metin dosyasına kaydedin. Metin dosyasını elektronik tabloda açın ve dilim x ve y-koordinat sütunları hariç tüm sütunları kaldırın.Daha sonra, merkezi ve çapı ölçmek ve x ve y-koordinatları ve her hücrenin Feret çapı elde etmek için oval aracı ve ölçü kullanın. Tüm hücrelerin ölçümlerini tek bir metin dosyasına kaydedin. Metin dosyasını elektronik tabloda açın ve x ve y-koordinatı ve Feret'in çap sütunları hariç tüm sütunları kaldırın.Sonra her hücre için yarıçap ölçümü ekleyin, sonra her hücre için Feret çapı yarıçapı elde. Her hücrenin mikro desen halkasının kalınlığını ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Bu ölçümü tek bir metin dosyasındaki tüm hücreler için kaydedin ve normalleştirilmiş yapışma uzunluğunu hesaplamak için yapışma uzunluğunu hücre yarıçapına bölün.Tek hücreli uzamsal analiz için, önce RStudio paketini yükleyin ve paketi RStudio'ya yükleyin. PAKETI ESA işlevi yle çalıştırın. Bir kullanıcı arabirimi açılır, ardından veri kümesi TXT dosyalarının dizinini ve çıktı çizimlerinin dizini'ni seçer.Komut dosyası, ilgili çizimlerin ve sayısal sonuçları içeren TXT dosyalarının PDF dosyalarını sağlayarak, otomatik olarak başlatılacaktır ve çözümleme gerçekleştirecektir. Hücre içinde, sondadaki zemin lizomun düşük pH'ı ile söndürülür, ancak ekzositoz sırasında pH proton salınımına bağlı olarak pH arttıkça sinyal vermeye başlar. PHluorin sinyali, ekzozomal protonların hızlı salınımını temsil eden ekzositoz sırasında bir tepe gösterir ve ardından plazma zarında sondanın 2D difüzyonunu temsil eden üstel sinyal bozunumu gösterir.Tipik olarak transfect ölümsüzleştirilmiş insan retinal pigmentli epitel hücreleri ortalama 0.28 Hertz ekzositoz oranı ile önemli bir izosomal sekresyon aktivitesi gösterir. Yerel yoğunluktaki farklılıkları ortaya çıkarmak için eksozozun çekirdek yoğunluğu tahminine göre 2B dağılımını görselleştirmek mümkündür. Tam mekansal rastgelelikten üç olası sapma vardır: kümeleme, dağılım veya kümeleme ve dağılım karışımı.Ripley'in K işlevi bu sapmaları değerlendirmek için kullanılabilir. Dikkat, yapışkan olmayan alanda eksositoz olayları da yapışma molekülleri plazma membranlarında salgı noktaları neden tek yapılar olmadığını belirten kümelenmiştir. Eksozis olaylarının histogramının temsili bir hücre için modüle göre çizilmesi, yapışkan ve yapışkan olmayan bölgeler arasındaki sınır çevresinde bir zirve yi ortaya koymaktadır.Eşleştirilmiş analizler, adezyon alanında yüzey yoğunluğunun yapışma olmayan alana göre daha düşük olduğunu göstermektedir, potansiyel olarak hücre çevresinde eksozisozun güçlü bir şekilde azalmasınedeniyle. Hücre yapışmasının mikro desenler üzerinde istatistiksel analizle birleştirilmesi, salgı lama gibi karmaşık hücresel süreçlerin uzayda nasıl düzenlendiğini saptamayı kolaylaştırır. Salgı aktivitesinin kümeleminin altında yatan moleküler mekanizmayı belirlemek için gelecekte daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Hareketliliği zamanmekansal Haritalama içinde<em&gt; Ex Vivo</emBağırsakların&gt; Hazırlıklar

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying<em&gt; Zea mays</em&gt; Yapraklar

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...