Name: cell surface receptor identification using genome-scale crispr/cas9 genetic screens
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens at JoVE.com

这项工作得到了授予GJW的威康信托赠款号206194的支持。我们感谢细胞学核心设施：蜂玲Ng，詹妮弗格雷厄姆，山姆汤普森和克里斯托弗霍尔帮助FACS。

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina.">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149 (2015).</li><li>&#214;zkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks.">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor.">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li><li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. 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作者没有什么可透露的。

介绍了基于CRISPR的筛选策略，用于识别编码细胞识别中涉及的细胞成分的基因。使用CRISPR活化的类似方法也提供了一种基因替代品，可以识别重组蛋白的直接相互作用受体，而无需生成大型蛋白质库26。然而，这种方法的一个主要优点是，它适用于由细胞上本地显示的表面分子介导的相互作用，并且不依赖于受体的过度表达，从而影响受体的结合性。因此，与其他方法不同，该技术对受体的生化性质或细胞生物学没有作任何假设，并且提供了一个机会来研究通常难以使用生化方法（如非常大的蛋白质）或多次穿过膜或与其他蛋白质形成复合物的蛋白质（如甘油、糖脂和磷脂等蛋白质）等分子介导的相互作用。鉴于该方法的基因组规模性质，这种方法不仅具有识别受体的优点，而且具有结合事件所需的额外细胞成分的优点，从而提供对受体细胞生物学的见解。
当使用这种方法来识别孤立蛋白的受体时，这种方法的主要局限性之一是首先确定与蛋白质结合的细胞系的初始要求。这并不总是容易的，识别显示结合表型的细胞行，该表型也允许遗传屏幕，这可能是部署此测定的时间限制步骤。有些细胞系往往与其他细胞系的蛋白质结合更多。这与结合 HS 的蛋白质特别相关，因为这些蛋白质倾向于与显示 HS 侧链的任何细胞系结合，而不考虑本机结合上下文。此外，我们观察到，在细胞系中提高合成酶（即含有HS的蛋白细胞）的调节，导致HS结合蛋白26的结合增加。在选择用于筛查的细胞系时，这可能是需要考虑的一个因素。然而，需要注意的还有，HS的添加剂结合不会干扰对特定受体的结合。这意味着，如果观察到绑定，则可能完全由 HS 进行中介，因为 HS 在此测定中介导的绑定是累加的，而不是共依赖19。在这种情况下，描述的肝素阻断方法可以识别此类行为，而无需执行完整的遗传筛查。
选择细胞系的有用资源是细胞模型Passport，它包含基因组学、转录组学和培养条件信息，用于+1，000个癌细胞系27。根据生物背景，可以根据细胞的表达特征选择细胞。为了帮助选择细胞系，我们根据1，500个预先批注的人类细胞表面糖蛋白28的表达，在细胞模型Passport中聚集了1，000个细胞系（补充图2;每个细胞系的簇信息以及生长条件在补充表2中提供）。测试具有未知功能的蛋白质的结合时，从每个簇中选择一组具有代表性的细胞系以增加覆盖各种受体的机会非常有用。如果可以选择一种选择，建议选择易于培养且易于转导的细胞系。由于这些细胞系将用于基因组规模筛选，因此最好能大量轻松生长，并放任扁病毒转导，因为它是在后续步骤中为CRISPR基因筛查提供sgRNA的最常用方法。
通常，表型选择以单一排序进行。但是，这是由染色细胞群与对照的亮度决定的。对于所需表型的信噪比低或屏幕的目的是识别具有强表型的突变体的情况，可以采用迭代轮选择。当对基于 FACS 的屏幕使用迭代选择方法时，必须考虑分拣过程可能导致细胞死亡，这主要是由于分拣机的纯力。因此，并非所有收集的单元格都将在下一轮排序中表示。
库的复杂性是执行成功的遗传屏幕的一个非常重要的因素，尤其是对于负选择屏幕，因为这些屏幕的耗竭程度只能通过将结果与起始库中的结果进行比较来确定。对于负选择屏幕，通常维护 500-1，000 x 复杂性的库。但是，正选择屏幕对库大小更强，因为在这样的屏幕中，预计只有少量突变体被选定为特定的表型。因此，在此描述的正选择屏幕中，库大小可以减小到 50-100 倍的复杂性，而不会影响屏幕的质量。此外，在这些屏幕中，还可以对给定的单元格行在给定的一天使用控制库，作为当天为给定单元格行排序的所有样本的"常规控制"。这将减少需要生成和排序的控制库的数量。
使用这种方法的另一个重要考虑因素是功能丧失屏幕在确定对体外细胞生长至关重要的基因方面的局限性。屏幕的时机在这方面至关重要，因为突变细胞在培养中保存的时间越长，基本基因突变的细胞变得不可行且不再在突变库中表示的可能性就越大。最近作为项目评分倡议的一部分在300多个细胞系中执行的基因筛选显示，KEGG批注蛋白分泌和N-糖基化途径中的多个基因通常被确定为对一些细胞系至关重要（补充图3）29。29如果要在细胞识别过程中研究增殖和生存能力所需的基因的影响，则可以在设计屏幕时考虑到这一点。在这种情况下，在早期时间点（例如，转染后第 9 天）进行屏幕通常适用。但是，如果该方法用于识别具有强尺寸效应而非一般细胞通路的几个目标，则在以后的时间点（例如，转染后的第 15-16 天）执行屏幕可能比较合适。
筛查结果非常强劲;在过去进行的8个重组蛋白结合屏幕中，细胞表面受体在每种情况下都是19次点击。因此，当使用这种方法识别相互作用伙伴时，人们应该期望在表面上发现导致其呈现的受体和因素，从而具有很高的统计可信度。一旦屏幕执行，并使用单个 gRNA 敲除验证命中，可以使用现有的生化方法（如 AVEXIS4）进行进一步的后续操作，并使用表面质质子共振直接对纯化蛋白进行饱和结合。此处描述的方法适用于所有可能生成可溶性重组结合探针的蛋白质。
总之，这是一种基因组级CRISPR敲除方法，用于识别由细胞表面蛋白质介导的相互作用。这种方法通常适用于识别细胞表面识别所需的细胞通路，在广泛的不同生物背景下，包括生物体自己的细胞（如神经和免疫学识别）之间，以及宿主细胞和病原体蛋白之间。这种方法为为受体识别设计的生化方法提供了一种基因替代，因为它不需要事先对受体的生化性质或细胞生物学进行任何假设，因此它有很大的潜力做出完全意想不到的发现。

细胞表面受体蛋白的细胞外相互作用直接重要的生物过程，如组织组织、宿主病原体识别和免疫调节。研究这些相互作用是更广泛的生物医学界感兴趣的，因为膜受体是系统传递的治疗，如单克隆抗体的可操作的目标。尽管这些互动很重要，但研究这些互动在技术上仍然具有挑战性。这主要是因为膜嵌入受体是两栖的，使它们难以从生物膜分离进行生化操作，并且它们的相互作用被弱相互作用的亲和力（μM-mM范围内的KDs）1典型化。1因此，许多常用的方法不适合检测这种类蛋白质相互作用11，2。2
已经开发出一系列方法，专门研究细胞外受体-配体相互作用，考虑其独特的生化特性3。其中一些方法包括将受体的整个异域作为哺乳动物或昆虫细胞基系统中的可溶性重组蛋白表达，以确保这些蛋白质含有在结构上很重要的翻译后修饰，如甘油和二硫化物键。为了克服低亲和力绑定，异域经常被寡头化，以增加其绑定狂热。Avid蛋白异域已成功地用作结合探针，以识别直接重组蛋白-蛋白质相互作用屏幕44、5、6、75,6,7中的相互作用伙伴。虽然广泛成功，但重组蛋白基方法要求将膜受体的异域作为可溶性蛋白质产生。因此，它仅适用于包含连续细胞外区域（例如单通道 I 型、II 型或 GPI 锚定）的蛋白质，通常不适用于多次跨越膜的受体复合物和膜蛋白。
表达克隆技术，其中补充DNA（cDNAs）库被转染成细胞，并测试结合型获得，也用于识别细胞外蛋白质-蛋白质相互作用8。近年来，大量克隆和测序的cDNA表达质粒的提供，为细胞系过度表达cDNA编码细胞表面受体的方法提供了便利，以筛选重组蛋白的结合，以识别相互作用9,9，10。与基于重组蛋白的方法不同，基于cDNA的过度表达方法提供了识别等离子膜中相互作用的可能性。然而，使用 cDNA 表达结构的成功取决于细胞以正确折叠的形式过度表达蛋白质的能力，但这通常需要细胞辅助因子，如运输机、护工和正确的寡聚物组装。因此，排泄单个cDNA可能不足以实现细胞表面表达。
使用cDNA结构或重组蛋白探针的筛选技术是资源密集型的，需要大量的cDNA或重组蛋白库。最近采用了专门设计的基于质谱的方法来识别不需要组装大型库的细胞外相互作用。然而，这些技术需要对细胞表面进行化学操作，这可以改变细胞表面分子的生化性质，目前仅适用于由糖基化蛋白11、12,12介导的相互作用。目前可用的大多数方法也严重关注蛋白质之间的相互作用，而在很大程度上忽略了膜微环境的贡献，包括糖甘、脂质和胆固醇等分子。
最近使用CRISPR方法开发高效双乙醚靶向，使缺乏定义基因的细胞的基因组库能够以系统和公正的方式筛选出涉及不同背景的细胞成分，包括解剖细胞信号过程、识别对药物、毒素和病原体产生抗药性的扰动，并确定抗体的特异性13、14、15、16。13,14,15,16在这里，我们描述了一种基于基因组规模的CRISPR敲除细胞筛选测定方法，它提供了替代当前生物化学方法，以识别细胞外受体-配体相互作用。这种通过遗传屏幕识别膜受体介导的相互作用的方法特别适用于对单个配体有关注力的研究人员，因为它避免了编译大量cDNA或重组蛋白库的需要。
该测定包括三个主要步骤：1） 高度狂热的重组蛋白结合探针，由感兴趣的受体的细胞外区域组成，产生并用于基于荧光的流细胞测量结合测定;2） 结合测定用于识别表示重组蛋白探针相互作用伙伴的细胞系;3） 生成与感兴趣的蛋白质相互作用的Cas9表达型细胞系，并执行基于基因组规模的CRISPR/Cas9的敲除屏幕（图1）。在这个遗传屏幕中，将重组蛋白与细胞系结合用作可测量的表型，其中，在挖空库中失去结合探针能力的细胞使用基于荧光的活性细胞分拣（FACS）和导致通过测序识别的结合表型丢失的基因进行排序。原则上，识别编码负责结合狂热探针的受体的基因及其细胞表面显示所需的基因。
该协议的第一步是生产代表膜结合受体的异域的avid重组蛋白探针。众所周知，当这些受体的异体被表达为重组可溶性蛋白1时，它们经常保持其细胞外结合功能。对于感兴趣的蛋白质，可溶性重组蛋白可以在任何合适的真核蛋白表达系统中以任何格式产生，前提是它可以进行寡聚，以增强结合性，并且它包含可用于荧光流细胞测定（例如，FLAG-tag，生物素标签）的标签。使用HEK293蛋白表达系统生产膜受体可溶性异域的详细协议，以及不同的多美化技术和用于生产五角蛋白和单体蛋白的蛋白质表达结构，此前已描述过,1，17。此处的协议将描述从单体生物微化蛋白中产生荧光avid探针的步骤，将它们结合到氟铬（例如，植物素或PE）中，这些链球菌结合在一起，可以直接用于基于细胞的结合测定，其优点是不需要二次抗体进行检测。执行基因组尺度屏幕的一般协议已经描述了20，21，因此该协议主要侧重于使用CRISPR/Cas9敲除筛选系统使用CRISPR/Cas9敲除筛选系统使用人类V1（"Yusa"）库18执行流细胞学重组蛋白结合屏幕的细节。20,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse alkaline phosphatase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Chem-Cruz</td>
			<td>SC-204655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood &#38; Cell Culture DNA Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Kapa</td>
			<td>KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX with PLUS reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2+-NTA agarose beads</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-501-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OX-68 antibody</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1022R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1040-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 desalting columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with 5 mL bed volume</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2&#215; Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCFA filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated microtitre plates</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>734-1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell surface receptor identification using genome-scale crispr/cas9 genetic screens

膜嵌入细胞表面受体之间的直接相互作用促进的细胞间通信对多细胞生物的正常发育和功能至关重要。然而，检测这些交互在技术上仍然具有挑战性。本手稿描述了一种系统基因组级CRISPR/Cas9敲除基因筛选方法，揭示了特定细胞表面识别事件所需的细胞通路。该测定利用哺乳动物蛋白表达系统中产生的重组蛋白作为狂热的结合探针，在基于细胞的基因筛选中识别相互作用伙伴。该方法可用于识别与膜嵌入受体的分面相对应的重组结合探针检测到的细胞表面相互作用所需的基因。重要的是，鉴于这种方法的基因组规模性质，它不仅具有识别直接受体的优点，而且还可以识别在细胞表面呈现受体所需的细胞成分，从而为受体生物学提供有价值的见解。

提供了两个有代表性的基因组尺度敲除屏的测序数据，以识别分别在NCI-SNU-1和HEK293细胞中执行的人类TNFSF9和P.恶性疟原虫RH5的结合伙伴（补充表1）。RH5的结合行为受到硫酸盐及其已知受体BSG24（图3C）的影响，而TNFRSF9专门与其已知的受体TNFSF9结合，在预孵化时不失去与可溶性肝素的结合。图3B中的蛋白质3代表TNFRSF9。
对于两个细胞系，还提供3天（9天、14天和16天后）在对照突变库中分布gRNA（补充表1）。gRNA分布表明，整个实验过程中，库的复杂性一直保持（图5A）。TNFSF9配体鉴定的基因筛选在转染后的第14天进行，而RH5的遗传筛选则在第9天进行后转染。通过检查观察到的gRNA褶皱变化的分布情况，针对一组非必要基因的分布与基本基因参考组分布22（图5B）相比，评估了屏幕的技术质量。此外，路径级浓缩还表明，在将对照样本与原始质粒库进行比较时，在"辍学"种群中确定了预期的基本途径并显著丰富了。图 5C中描述了第 14 天 NCI-SNU-1 示例的示例。
使用MAGeCK的-测试函数（关于MAGeCK的基因摘要输出，请参阅补充表1）在对照组与排序的种群中分布gRNA用于识别表型屏幕中的受体。MAGeCK在基因级分析中报告的修正RRA分数根据按p值排列的基因进行绘制。MAGeCK 中的 RRA 分数提供了 gRNA 排名始终高于预期的度量。在 TNFRSF9 的屏幕上，点击量最大的是 TNFSF9，它是 TNFRSF9 的已知绑定伙伴（图 5D）。此外，还确定了与TP53通路有关的一些基因。在RH5的情况下，除了已知的受体（BSG） 和产生硫酸盐的 GG （SLC35B2） 所需的基因外，还确定了另一个基因 （SLC16A1） （图 5E）。SLC16A1 是将BSG贩运到细胞表面所需的陪同人员。这些结果共同证明了屏幕能够识别直接相互作用的受体以及该受体以功能形式在细胞表面表达所需的细胞成分的能力。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60803/60803fig1v2.jpg"> 图1：识别细胞表面受体的基因筛选方法概述。此测定包括三个主要步骤：首先，代表细胞表面受体的异域的重组蛋白以细胞线表示，该细胞系可以添加结构上关键的翻译后修饰，如 HEK293 细胞。单体蛋白异域通过结合链霉菌-PE来增加其结合性。其次，这些狂热的探针用于细胞结合测定，其中PE荧光（绿色）明显变化指示的细胞系上的明亮染色与负对照蛋白（黑色）相比，表明存在细胞表面结合伙伴。第三，选择受体阳性Cas9表达细胞系，并使用针对绝大多数蛋白质编码基因的gRNA进行基因组规模筛选。在生成突变库时，通常使用 30% 的转导效率，这是基于泊松分布概率，确保每个细胞接收单个 gRNA，以便生成的表型归因于特定的敲除。传感器表示的BFP标记用于使用FACS选择含有gRNA的细胞。色情屏幕在转导后 9-16 天内执行。在屏幕的当天，突变细胞总群分为两部分。一半作为对照种群保留，另一半被选择用于重组蛋白结合。突变库中不再能够结合重组蛋白的细胞使用FACS进行排序，在排序与对照人群中的gRNA的丰富用于识别标记的avid探针细胞表面结合所需的基因。指示协议中需要大量时间的步骤。这个数字是从夏尔马等人19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60803/60803fig2.jpg"> 图2：使用基于ELISA的方法确定生物微化蛋白与链球菌蛋白-PE的比率。链球菌-PE结合策略的一个例子，用于从生物微化单聚蛋白中产生一个狂热的探针。一系列稀释性生物微化单体被孵育成固定浓度的链球菌。ELISA确定了无法检测到过量生物微量单体的最低稀释量。ELISA 是执行有或没有预孵一系列蛋白质稀释与 10 纳克链球菌-PE。在存在链球菌-PE时，计算了未识别信号的最小稀释度（圆形黑色）和饱和所需的蛋白质量，以生成具有4 μg/mL链球菌-PE的10倍库存溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60803/60803fig3.jpg"> 图3：蛋白质与细胞系的代表性结合。与对照样本相比，与细胞系结合的蛋白质荧光明显增加。重组蛋白的热处理（80°C，10分钟），所有结合都回对负对照，表明结合行为依赖于正确折叠的蛋白质。（B） 与细胞表面不同类别的蛋白质结合行为;依赖GG。从左到右，蛋白质可以分为三种类型：蛋白质类型1只吸附HS。这些蛋白质在预孵育后失去其结合，肝素浓度超过0.2mg/mL。蛋白质类型 2 与 HS 结合，除了特定的受体。这些蛋白质在预阻塞实验中失去部分结合。蛋白质类型 3 不绑定 HS。与亲线相比，这些蛋白质不会失去结合。（C） 以添加剂方式与 HS 和特定受体结合的蛋白质（即 RH5）的示例。靶向受体（即BSG）或HS合成所需的酶（例如SLC35B2、EXTL3），仅部分减少RH5与对照对照的细胞结合。转导多克隆线可用于此类实验，以建立结合行为。这个数字是从夏尔马等人19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60803/60803fig4.jpg"> 图 4：选择具有高 Cas9 活性的克隆细胞系。使用GFP-BFP报告系统评估了NCI-SNU-1细胞系多克隆线和克隆系的基因组编辑效率，其中细胞系与病毒进行转导，病毒具有gRNA靶向质粒编码的GFP或没有（即"空"）。图解图被描绘出来。流细胞学用于在转导后测试BFP和GFP表达式，并将其与未感染的控制进行比较。GFP 表达式用作 Cas9 活动的代理，而 BFP 表达式标记了传感器。未感染和空受感染的细胞的配置文件看起来与所有克隆相似。代表配置文件在左侧面板中描述。与多克隆线（右面板）相比，NCI-SNU-1细胞系的五个克隆都显示GFP损失较高，克隆4具有最高的效率，耐火材料总体最少。这个数字是从夏尔马等人19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60803/60803fig5.jpg"> 图5：用于识别细胞表面结合伙伴的基因筛选的代表性结果。（A） 累积分布函数图将质粒体库中的gRNA丰度与第9天、14日和16日HEK-293-E和NCI-SNU-1细胞的突变库进行比较。对于任何给定数字，累积密度函数报告低于该阈值的数据点的百分比。与原始质粒种群相比，突变细胞群的微小变化表示与质粒库相比，gRNA的子集的耗竭。（B） 以前在 HEK293 和 NCI-SNU-1 细胞系中被归类为必需（红色）或非必需（黑色）的基因的分数变化分布。非必需基因的折叠变化分布居于±0，而基本基因的分布则向左转向负折变化。（C） NCI-SNU-1突变对照种群在转染后14天内耗尽的基因中，有显著丰富的通路。确定了已知的已知细胞基本途径。（D） 强健的等级算法 （RRA） - 在已分类细胞中富集的基因得分，这些基因已经失去了结合 TNFRSF9 探针的能力。基因根据RRA评分进行排名。已知的相互作用伙伴TNFSF9和与TP53通路相关的基因（红色标记）在屏幕中被识别。（E） 从 GRNA 富集分析中识别的 RH5 与 HEK293 细胞（左面板）结合所需的基因的有序 RRA 分数。SLC35B2和SLC16A1是在 5% 的错误发现率 （FDR） 阈值内识别的。在HS生物合成途径中，另外两个基因（即EXTL3和NDST1）在25%的FDR内被识别。描绘一般GAG生物合成途径的原理图，相关基因映射到相应的步骤（面板2）。在屏幕中未发现硫酸软骨素生物成因所需的基因（即CSGALNACT1/2）。这个数字是从夏尔马等人19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>质粒名称</td>
			<td>质 粒#</td>
			<td>使用</td>
		</tr>
<tr>
<td>蛋白质表达结构：CD200RCD4d3_4-生物链接器-他</td>
			<td>加金： 36153</td>
			<td>生产含有CD4d3+4、生物结合和6-他标签的重组蛋白。</td>
		</tr>
<tr>
<td>pMD2.G</td>
			<td>加金： 12259</td>
			<td>VSV-G 信封表示质粒;生产扁病毒</td>
		</tr>
<tr>
<td>psPAX2</td>
			<td>加金： 12260</td>
			<td>伦迪病毒包装质粒，生产扁病毒</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cas9 构造： pKLV2-EF1a-Cas9Bd-W</td>
			<td>加金： 68343</td>
			<td>生产有组织表达Cas9线</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA表达结构：pKLV2-U6gRNA5（BbsI）-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td>加金： 67974</td>
			<td>CRISPR gRNA 表达载体，具有改进的脚手架和紫杉/BFP 标记</td>
		</tr>
<tr>
<td>人类改进的全基因组敲除CRISPR库</td>
			<td>加金： 67989</td>
			<td>一个gRNA库，针对18，010个人类基因，设计用于扁病毒。</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP-BFP 结构：pKLV2-U6gRNA5（gGFP）-PGKBFP2AGFP-W</td>
			<td>加金： 67980</td>
			<td>Cas9 活动报告员与 BFP 和 GFP。</td>
		</tr>
<tr>
<td>空结构：pKLV2-U6gRNA5（空）-PGKBFP2AGFP-W</td>
			<td>加金： 67979</td>
			<td>Cas9 活动报告器（控制）与 BFP 和 GFP。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：此方法中使用的质粒。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>缓冲区名称</td>
			<td>组件</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBS （10X）</td>
			<td>1.5 M NaCl 和 200 mM HEPES 在 MiliQ 水中，调整到 pH 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS （10X）</td>
			<td>80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na2HPO4和 2.4 g KH2PO4在 MiliQ 水中，调整到 pH 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>磷酸钠缓冲液（80mM库存）</td>
			<td>7.1 g Na2HPO4.2H2O，5.55 g NaH2PO4，调整至 pH 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>他的净化结合缓冲器</td>
			<td>20 mM 磷酸钠缓冲液，0.5 M NaCl 和 20 mM Imidazole，调整至 pH 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>他的净化洗脱缓冲液</td>
			<td>20 mM 磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl 和 400 mM Imidazole，调整至 pH 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>二乙醇胺缓冲液</td>
			<td>10% 二乙醇胺和 0.5 mM MgCl2 在 MiliQ 水中，调整到 pH 9.2：</td>
		</tr>
<tr>
<td>D10</td>
			<td>DMEM，1% 青霉素链霉素（100 单位/mL）和 10% 热灭活 FBS</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2：本研究所需的缓冲区。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>组件</td>
			<td>10厘米的菜</td>
			<td>6 孔板</td>
		</tr>
<tr>
<td>293FT 电池</td>
			<td>70~80% 汇</td>
			<td>70~80% 汇</td>
		</tr>
<tr>
<td>转染兼容介质（Opti-MEM）（步骤5.1.2）</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>转染兼容介质（Opti-MEM）（步骤5.1.4）</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>伦迪病毒转移载体</td>
			<td>3 μg</td>
			<td>0.5微克</td>
		</tr>
<tr>
<td>psPax2（见表1）</td>
			<td>7.4 微克</td>
			<td>1.2 微克</td>
		</tr>
<tr>
<td>pMD2.G（见表1）</td>
			<td>1.6 微克</td>
			<td>0.25微克</td>
		</tr>
<tr>
<td>加试剂</td>
			<td>12 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>利波霉素 LTX</td>
			<td>36 μL</td>
			<td>6 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>D10 （步骤 7.1.7）</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>D10（步骤 7.1.8 和 7.1.10）</td>
			<td>8 mL</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表3：扁病毒包装混合物试剂的数量和体积。
表4：用于放大gRNA和NGS的引底序列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/table4.xlsx" target="_blank">请点击此处查看此文件（右键单击以下载）。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>每次反应的体积</td>
			<td>主混合 （x38）</td>
		</tr>
<tr>
<td>Q5 热启动高保真 2x</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>950 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>底漆 （L1/U1） 混合 （每个 10 μM）</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>38 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>基因组DNA（1毫克/mL）</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>72 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>22 μL</td>
			<td>1100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>总</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>1900 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表5：用于从高复杂度样品中放大gRNA的PCR。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>周期号</td>
			<td>变性</td>
			<td>退火</td>
			<td>扩展</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>98 °C， 30s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2-24</td>
			<td>98 °C， 10s</td>
			<td>61 °C， 15s</td>
			<td>72 °C， 20s</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>72 °C， 2 分钟</td>
		</tr>
</tbody></table>表 6：第一个 PCR 的 PCR 条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>每次反应的体积</td>
		</tr>
<tr>
<td>KAPA HiFi 热启动就绪混合</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>底漆（PE1.0/指数底漆）混合（每个5μM）</td>
			<td>2μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>第一个 PCR 产品 （40 pg/μL）</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>18 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>总</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表7：基因屏幕中sgRNA索引标记的PCR。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>周期号</td>
			<td>变性</td>
			<td>退火</td>
			<td>扩展</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>98 °C， 30s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2-15</td>
			<td>98 °C， 10s</td>
			<td>66 °C， 15s</td>
			<td>72 °C， 20s</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>72 °C， 5 分钟</td>
		</tr>
</tbody></table>表8：第二次PCR的PCR条件。
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60803/60803suppfig1.jpg"> 补充图 S1：绘制门的指南，用于对不具约束力的填充进行排序。（A） 与对照种群相比，理想的蛋白质候选物筛选应具有结合种群的明显变化，并且结合应保留在缺乏HS生物合成机制的细胞上。肝素阻断实验可用于代替SLC35B2靶细胞系的测试。（B） 细胞缺乏蛋白质异位的表面染色，但从扁病毒转导中表达BFP荧光的细胞被收集。显示的细胞来自一个屏幕，用于识别GABBR222的受体。这个数字是从夏尔马等人19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803suppfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60803/60803suppfig2.jpg"> 补充图S2：细胞表面糖蛋白转录组基基于PCA图，使用来自1000多个癌细胞系的RNA-seq数据。细胞模型Passport27中的细胞系根据1，500个细胞表面糖蛋白的FPKM值，使用K-手段聚类进行聚类。每个群集的代表性单元格行都已标记。第5组完全由造血源细胞系组成（另见补充表2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803suppfig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Supplementary Figure 3" src="/files/ftp_upload/60803/60803suppfig3.jpg"> 补充图S3：KEGG注释蛋白导出和项目分数N相关糖基化基因的必需性分数。为蛋白质导出和N相关糖基化通路（X轴）的基因绘制了 330 个细胞系（柱，未标记）的调整后贝叶素-基本性分数。与原始质粒库相比，分数高于 0 表示突变体严重枯竭。这些基因可以分为三个不同的簇，它们代表细胞系中不同程度的基本性。此群集可用于决定排序的当天。如果屏幕是在较晚的时间点（第 16 天）执行的，则可能无法识别已知对细胞（组 1 和 3）至关重要的基因。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/60803suppfig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
补充表 1：原始计数文件和 MAGeCK 软件生成的gene_summary与具有代表性的遗传屏幕相关的文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/supplementary_table1.xlsx" target="_blank">请点击此处查看此文件（右键单击以下载）。</a>
补充表2：根据细胞表面受体的表达对细胞系的聚类。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60803/supplementary_table2.xlsx" target="_blank">请点击此处查看此文件（右键单击以下载）。</a>

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Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

本手稿描述了一种基于基因组规模的细胞筛选方法，用于识别细胞外受体-配体相互作用。

使用基因组-规模CRISPR/Cas9基因屏幕进行细胞表面受体识别

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

使用现有生化方法检测细胞表面相互作用仍然构成技术挑战。该协议提供了一个遗传替代方案，利用基因组规模细胞筛选方法，以确定细胞表面的受体配体相互作用。与大多数其他现有方法不同，这种方法对受体的生物学没有假设。它提供了机会来识别由各种细胞表面分子培养的相互作用。细胞表面分子可直接被单克隆抗体等药物访问。因此，识别这些分子所调解的相互作用可以具有重要的治疗意义。这种方法一般适用于有兴趣探索细胞信号和识别过程的研究人员，其生物背景广泛，包括神经和免疫相互作用以及宿主病原体相互作用。该协议需要高通量的细胞分拣机和下一代测序机。在启动协议之前，请确保这些设施可用。首先在96井板中对生物素化蛋白质样品进行8次连续稀释，确保每次稀释的最终体积至少为200微升，并包括标签控制。从每一个井中去除 100 微升，并将其转移到新的 96 井板中，从而制作样品的重复板。包括一个仅标签的蛋白质控制，将用作控制探针的所有结合文章。将100微升（每毫升0.1微克）的链球菌-PE添加到其中一个板中的井中，向另一个板的孔中加入100微升稀释缓冲液。在室温下孵育板20分钟。同时，用稀释缓冲液阻断斯特普他丁编码板的孔15分钟。洗完盘子后，确保盘子干燥。然后将样品的总量从两个板转移到铁丁编码板的单个孔中，并在室温下孵育一小时。孵育后，用200微升的洗涤缓冲液洗三次。加入100微升的小鼠抗鼠Cd4d3+4IgG，再孵育一小时。重复洗涤。加入100微升的抗小鼠碱性磷酸酶结合，并在室温下离开板一小时。然后用洗涤缓冲液洗井三次，用稀释缓冲液洗一次。在染料乙醇胺缓冲液中，以每毫升一毫克的速度准备磷酸丙基苯，并在每井中加入100微升。经过15分钟的孵育，测量吸光度有每个井在405纳米。使用板上没有信号的最小稀释系数作为适当的稀释因子来创建三角板。在室温下孵育链球菌素-PE和适当的生物素化蛋白稀释30分钟。然后在四摄氏度的光保护管中储存结合蛋白，直到进一步使用。用经过处理和控制样品旋转锥形管，在200次G下旋转5分钟。取出上流液，将其中一根管子冷冻在零下20摄氏度，供以后使用。用 1%BSA 将另一管中的颗粒重新悬浮在 10 毫升 PBS 中，并留出 100 微升细胞作为 96 井板的负对量。然后将预结合重组蛋白加入锥形管和96孔板中的细胞悬浮液。在台式转子上，以温和旋转的四摄氏度进行至少一小时的细胞染色。然后在200次G下对细胞进行5分钟的颗粒化，然后取出上一液。洗涤细胞两次后，在PBS的五毫升中重新悬浮。通过 30 微米应变器对细胞进行应变，以去除细胞簇。然后用流索多分析它们。使用阴性控制样本为 BFP 阳性和 PE 阴性细胞提供门。然后对样品进行排序，将50万至100万BFP阳性和PE阴性细胞收集到1.5毫升离心管中。疼痛笼将取决于细胞与蛋白质的结合，但通常收集一到5%的PE阴性样本。现在让排序的细胞通过离心500次G五分钟，然后小心地去除上清液。颗粒可以在零下20摄氏度下储存长达6个月。使用 magic 的计数函数将序列从未排序和排序的群体映射到参考库，这将生成原始计数文件。使用未排序控制样本的原始计数作为控件，使用已排序样本的计数作为处理，运行 magic 的测试函数。打开生成的基因摘要文件，按升序对暂停排名列进行排名。然后识别错误发现率小于点 0.05 的命中。受体通常排在第一位。最后使用 R 或等效软件绘制稳健的排名算法分数以进行正选择。在NCI-SNU-1和HC-293细胞中分别进行了基因组刻度敲除筛选，用于识别人类TNFSF9和P恶性疟原虫或H5的结合伙伴。Rh5的结合行为受硫酸肝和已知受体BSG的影响，而TN-FRSF-9没有失去与已知受体TN-FSF-9的结合。使用可溶性肝素进行预孵化。控制突变库中的GNA分布表明，在整个实验过程中，库的复杂性得到保持。通过检查G-RNA目标非必需基因参考集的观测折叠变化的分布情况，与一组基本基因的参考分布相比，评估了屏幕的技术质量。此外，途径水平丰富表明，在辍学人口中，预期的基本途径已经确定并显著丰富。将控制样本与原始质粒库进行比较时。强号排名算法或 RRA 得分提供了 G-RNA 的等级一直高于预期的度量。在 TNFRSF9 的屏幕中，点击时间最大的是 TNFSF9，它是已知的绑定伙伴。此外，还确定了一些与TP53通路相关的基因。在RH5的情况下，除了已知的受体，以及生产硫酸盐的咽喉所需的基因，SLC16A1基因也被识别。筛选方法通常非常稳健，直接相互作用的受体应按此种群顺序在富集的基因列表中高排名。验证从屏幕获得的点击率至关重要。例如，如果相互作用是由蛋白质调解的，那么旨在研究二元蛋白相互作用的生化方法可用于进一步的验证研究。由于这种方法的基因组规模性质不偏不倚，我们预计它将有助于探索难以研究细胞分子（如脂质、多通膜蛋白和甘油）的相互作用。它还可能揭示受体贩运和生物学所需的新途径。

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

用荧光PCR毛细管电泳技术在基因型CRISPR / Cas9介导的敲除突变体的高通量形式

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

科研

遗传学

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

选择依赖和独立生成CRISPR / Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

CRISPR/Cas9-based 跳跃的原始生殖细胞移植在爪

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

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A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 核糖核酸蛋白介导的精确基因编辑通过管电穿孔

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

哺乳动物细胞中基于CRISPR的聚集基因屏幕

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

使用CRISPR/Cas9系统将基因挖空直接引入锥虫瘤的肌瘤阶段

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...