Name: cell surface receptor identification using genome-scale crispr/cas9 genetic screens
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Wellcome Trust No 206194, присужденным GJW. Мы благодарим Cytometry Core объекта: Би Линг Нг, Дженнифер Грэм, Сэм Томпсон, и Кристофер Холл за помощь с FACS.

<ol>
	<li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+intercellular+adhesion:+the+importance+of+weak+protein-protein+interactions.">Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).</li><li>Wood, L., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+extracellular+receptor-ligand+interactions.">Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).</li><li>Bushell, K. M., S&#246;llner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Visser, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina.">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149 (2015).</li><li>&#214;zkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks.">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor.">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li><li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juno+is+the+egg+Izumo+receptor+and+is+essential+for+mammalian+fertilization.">Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization.</a> Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).</li><li>Mullican, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFRAL+is+the+receptor+for+GDF15+and+the+ligand+promotes+weight+loss+in+mice+and+nonhuman+primates.">GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).</li><li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+malaria+is+associated+with+parasite+binding+to+endothelial+protein+C+receptor.">Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor.</a> Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).</li><li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+ligand-receptor+interactions+on+living+cells+and+tissues.">Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).</li><li>Sobotzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HATRIC-based+identification+of+receptors+for+orphan+ligands.">HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands.</a> Nature Communications. 9 (1), 1519 (2018).</li><li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms.">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Genetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions.">CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+antigen+specificity+of+a+monoclonal+antibody+using+genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+library.">Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library.</a> Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).</li><li>Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+toolbox+to+study+virus-host+interactions.">A CRISPR toolbox to study virus-host interactions.</a> Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).</li><li>Kerr, J. S., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidity-based+extracellular+interaction+screening+(AVEXIS)+for+the+scalable+detection+of+low-affinity+extracellular+receptor-ligand+interactions.">Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3881 (2012).</li><li>Tzelepis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+Dropout+Screen+Identifies+Genetic+Vulnerabilities+and+Therapeutic+Targets+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.</a> Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).</li><li>Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+cellular+pathways+required+for+cell+surface+recognition.">Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition.</a> Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+pooled+CRISPR+genetic+screens+using+MAGeCKFlute.">Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.</a> Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR/SpCas9+Knockout+Screens.">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).</li><li>Crosnier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum.">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).</li><li>Kirk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD147+is+tightly+associated+with+lactate+transporters+MCT1+and+MCT4+and+facilitates+their+cell+surface+expression.">CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression.</a> The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).</li><li>Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+extracellular+receptor-ligand+interaction+screening+using+CRISPR+activation.">Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation.</a> Genome Biology. 19 (1), 205 (2018).</li><li>van der Meer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Model+Passports-a+hub+for+clinical,+genetic+and+functional+datasets+of+preclinical+cancer+models.">Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models.</a> Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).</li><li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas.">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PloS One. 10 (3), e0121314 (2015).</li><li>Behan, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prioritization+of+cancer+therapeutic+targets+using+CRISPR-Cas9+screens.">Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.</a> Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Описана стратегия скрининга на основе CRISPR для выявления генов, кодирующих клеточные компоненты, участвующие в распознавании клеток. Аналогичный подход с использованием активации CRISPR также обеспечивает генетическую альтернативу для выявления непосредственно взаимодействующих рецепторов рекомбинантных белков без необходимости генерировать большие белковые библиотеки26. Однако одним из основных преимуществ такого подхода является то, что он применим к взаимодействиям, опосредованным молекулами поверхности, нативно отображаемыми на клетке, и не зависит от переэкспрессии рецепторов, которые могут влиять на связывающую алчность рецептора. В отличие от других методов, таким образом, этот метод не делает никаких предположений относительно биохимической природы или клеточной биологии рецепторов и дает возможность изучать взаимодействия, опосредованные белками, которые обычно трудно изучать с помощью биохимических подходов, таких как очень большие белки, или те, которые пересекают мембрану несколько раз или образуют комплексы с другими белками, и молекулы, кроме белков, таких как гликаны, гликолипы, гликолипы. Учитывая геноммасштаба характер метода, этот подход также имеет преимущество не только выявление рецептора, но и дополнительные клеточные компоненты, которые необходимы для связывания события, тем самым обеспечивая понимание клеточной биологии рецептора.
Одним из основных ограничений этого метода при его использовании для определения рецептора белка сироты является первоначальное требование сначала определить клеточную линию, которая связывается с белком. Это не всегда легко и выявления клеточной линии, которая отображает связывание фенотипа, который также является вседозволенным для генетических экранов может быть ограничивающим время шагом для развертывания этого асссе. Некоторые клеточные линии, как правило, связываются с большим количеством белков, чем другие. Это особенно актуально для белков, которые связывают HS, потому что эти белки, как правило, связываются с любой клеточной линии, которая отображает HS боковых цепей, независимо от родного контекста связывания. Кроме того, мы заметили, что upregulation синдеканов (т.е., протеогликанов, которые содержат HS) в клеточных линиях приводит к увеличению связывания HS-связывающих белков26. Это может быть фактором, чтобы принять во внимание при выборе клеточной линии для скрининга. Однако также важно отметить, что аддитивная привязка ГС не мешает связыванию с конкретным рецептором. Это означает, что если привязка наблюдается, вполне возможно, что она опосредована исключительно СГ, потому что привязка опосредовано СС в этом ассе является добавкой, а не созависимым19. В таком сценарии описанный подход блокирования гепарина может определить такое поведение без необходимости выполнять полный генетический экран.
Полезным ресурсом для выбора клеточных линий является Cell Model Passport, который содержит геномику, транскриптомику и информацию о состоянии культуры для линий раковых клеток no 100027. В зависимости от биологического контекста, клетки могут быть выбраны на основе их профилей выражения. Для того чтобы помочь выбору линий клетки, мы сгруппировали линии клетки 1.000 в паспорте модели клетки согласно выражению q1.500 preannotated гликопротеинов поверхности клетки человека28 (Дополнительная Рисунок 2; информация кластера для каждой линии клетки вместе с условиями роста обеспечены в дополнительной таблице 2). При тестировании связывания белка с неизвестной функцией, полезно выбрать панель репрезентативных клеточных линий из каждого кластера, чтобы увеличить вероятность покрытия широкого спектра рецепторов. При выборе рекомендуется выбирать клеточные линии, которые легко культивируются и легко преобразовываются. Поскольку эти клеточные линии будут использоваться в скрининге в масштабе генома, предпочтительнее, чтобы они могли быть легко выращены в больших количествах и разрешительны для трансдукции лентивиральной инфекции, поскольку это наиболее распространенный метод доставки sgRNA для генетического скрининга на основе CRISPR в более поздних шагах.
Как правило, выделение фенотипа осуществляется в одном сорте. Однако это определяется яркостью популяции окрашенных клеток по сравнению с контролем. Итеративные раунды выделений могут быть приняты для сценариев, в которых соотношение сигнала к шуму желаемого фенотипа является низким, или когда целью экрана является выявление мутантов, которые имеют сильные фенотипы. При использовании итеративного подхода отбора для экранов на основе FACS, важно учитывать, что процесс сортировки может привести к гибели клеток, в основном из-за силы сортировки. Таким образом, не все собранные ячейки будут представлены в следующем раунде сортировки.
Сложность библиотеки является очень важным фактором при успешном выполнении генетических экранов, особенно для отрицательных экранов отбора, потому что степень истощения в них может быть определена только путем сравнения результатов с тем, что присутствовало в стартовой библиотеке. Для отрицательных экранов отбора, он является общим для поддержания библиотек 500-1000 х сложности. Положительные экраны отбора, однако, более надежны для размеров библиотеки, потому что на таких экранах ожидается, что для конкретного фенотипа будет выбрано лишь небольшое число мутантов. Таким образом, в описанном здесь положительном экране отбора размер библиотеки может быть уменьшен до 50-100-кратной сложности без ущерба для качества экрана. Кроме того, на этих экранах также можно использовать библиотеку управления для данной линии ячейки в данный день в качестве "общего контроля" для всех образцов, отсортированных в день для данной линии ячейки. Это позволит сократить количество контрольных библиотек, которые необходимо производить и секвенировать.
Другим важным соображением для использования этого подхода является ограничение потери функции экранов в выявлении генов, которые имеют важное значение для роста клеток in vitro. Сроки экранов имеет решающее значение в этом отношении, так как чем дольше клетки-мутанты хранятся в культуре, тем выше вероятность того, что клетки с мутациями в основных генах становятся нежизнеспособными и больше не представлены в библиотеке мутантов. Последние генетические экраны, выполненные в рамках инициативы Project Score в более чем 300 клеточных линиях показывают, что несколько генов в KEGG-аннотированный белок секреции и N-гликозилационный путь часто определены как необходимые для ряда клеточных линий (Дополнительная рисунок 3)29. Это может быть принято во внимание при проектировании экранов, если влияние генов, необходимых для распространения и жизнеспособности, должно быть исследовано в контексте процесса распознавания клеток. В этом случае проведение экранов в ранний момент (например, день 9 посттрансдукции) было бы в целом уместно. Однако, если этот подход используется для определения нескольких целей с сильными эффектами размера, а не общие клеточные пути, было бы целесообразно выполнять экраны на более поздний момент времени (например, день 15-16 посттрансдукции).
Результаты скрининга очень надежны; в восьми рекомбинантных экранов связывания белка выполняется в прошлом, рецептор поверхности клетки был верхний удар в каждом случае19. При использовании этого подхода для определения партнера по взаимодействию следует ожидать, что рецептор и факторы, способствующие его представлению на поверхности, будут идентифицированы с высокой статистической достоверностью. После того, как экран выполняется и хит проверяется с помощью одного gRNA нокаут, дальнейшие последующие действия могут быть выполнены с использованием существующих биохимических методов, таких как AVEXIS4 и прямой сатурируемый связывания очищенных белков с использованием поверхностного плазмонрезонанса. Описанный здесь подход применим ко всем белкам, для которых можно создать растворимый рекомбинантный связывающий зонд.
Таким образом, это геном масштаба CRISPR нокаут подход для выявления взаимодействий опосредовано клеточных белков поверхности. Этот метод, как правило, применим для выявления клеточных путей, необходимых для распознавания поверхности клеток в широком диапазоне различных биологических контекстов, в том числе между собственными клетками организма (например, нейронным и иммунологическим распознаванием), а также между клетками-хозяинами и патогенными белками. Этот метод обеспечивает генетическую альтернативу биохимическим подходам, предназначенным для идентификации рецепторов, и поскольку он не требует каких-либо предварительных предположений относительно биохимической природы или клеточной биологии рецепторов, он имеет большой потенциал, чтобы сделать совершенно неожиданные открытия.

Внеклеточные взаимодействия белков клеточных рецепторов поверхности направляют важные биологические процессы, такие как организация тканей, распознавание хоста и патогена и иммунная регуляция. Исследование этих взаимодействий представляет интерес для более широкого биомедицинского сообщества, потому что мембранные рецепторы являются действенными целями систематически поставляемых терапевтических препаратов, таких как моноклональные антитела. Несмотря на их важность, изучение этих взаимодействий остается технически сложной задачей. Это главным образом потому, что мембранные рецепторы амфипатических, что делает их трудно изолировать от биологических мембран для биохимических манипуляций, и их взаимодействия являются олицетворяемыми слабым имитителями (KDв диапазоне мМ-ММ)1. Следовательно, многие широко используемые методы не подходят для обнаружения этого класса белковых взаимодействий1,,2.
Ряд методов был разработан специально для изучения внеклеточных рецепторов-лиганд взаимодействий, которые принимают их уникальные биохимические свойства во внимание3. Ряд из этих подходов включают выражение всего эктодона рецептора в качестве растворимого рекомбинантного белка в системах млекопитающих или насекомых, основанных на клетках, чтобы гарантировать, что эти белки содержат постпереводные изменения, которые являются структурно важными, такие как гликаны и дисульфидные связи. Чтобы преодолеть с низким содержанием связывания, эктодоменов часто олигомеризированы, чтобы увеличить их связывания алчность. Заядлый белок эктодомеменов были успешно использованы в качестве связывающих зондов для выявления партнеров взаимодействия в прямых рекомбинантных белково-белковых экранов взаимодействия4,,5,,6,7. Хотя в целом успешным, рекомбинантные методы на основе белка требуют, чтобы эктодомен мембранного рецептора быть произведены в качестве растворимого белка. Таким образом, это обычно применимо только к белкам, которые содержат смежные внеклеточной области (например, однопроходный тип I, тип II, или GPI-якорь) и, как правило, не подходит для рецепторных комплексов и мембранных белков, которые охватывают мембрану несколько раз.
Методы клонирования выражения, в которых библиотека дополнительных ДНК (cDNAs) трансфицируется в клетки и проверяется на увеличение-связывания фенотипа также были использованы для выявления внеклеточного белка-белковых взаимодействий8. Наличие больших коллекций клонированных и секвенированных плазмидов экспрессии кДНК в последние годы облегчило методы, в которых клеточные линии, перевыражающие cDNAs, кодирующие рецепторы поверхности клеток, проверяются на связывание рекомбинантных белков для определения взаимодействий9,10. Подходы, основанные на переэкспрессии кДНК, в отличие от рекомбинантных белковых методов, дают возможность выявлять взаимодействия в контексте плазменной мембраны. Тем не менее, успех использования конструкций экспрессии кДНК зависит от способности клеток переэкспрессировать белок в правильно сложенной форме, но это часто требует клеточных вспомогательных факторов, таких как транспортеры, сопровождающие, и правильное олигомерной сборки. Таким образом, трансфекции одной кДН может быть недостаточно для достижения экспрессии поверхности клетки.
Методы скрининга с использованием конструкций кДНК или рекомбинантных белковых зондов являются ресурсоемкими и требуют больших коллекций библиотек кДНК или рекомбинантных белков. Специально разработанные методы на основе масс-спектрометрии были использованы в последнее время для выявления внеклеточных взаимодействий, которые не требуют сборки больших библиотек. Тем не менее, эти методы требуют химических манипуляций поверхности клетки, которые могут изменить биохимический характер молекул, присутствующих на поверхности клеток и в настоящее время применимы только для взаимодействия опосредовано гликозилатированных белков11,12. Большинство имеющихся в настоящее время методов также в значительной степени сосредоточены на взаимодействии между белками, в то время как в значительной степени игнорируя вклад мембраны микросреды, в том числе молекул, таких как гликаны, липиды и холестерин.
Недавнее развитие высокоэффективного биалелеческого таргетинга с использованием CRISPR-подходов позволило геном масштаба библиотек клеток, не хватает определенных генов в одном пуле, которые могут быть проверены в систематическом и беспристрастным образом для выявления клеточных компонентов, участвующих в различных контекстах, в том числе вскрытие клеточных процессов сигнализации, выявление возмущений, которые придают устойчивость к наркотикам, токсинов и патогенов, и определения конкретных антител15,14,15,. Здесь мы описываем геном масштаба CRISPR основе нокаут-клеток скрининга анализ, который обеспечивает альтернативу текущим биохимических подходов для выявления внеклеточных рецепторов-лиганд взаимодействий. Такой подход к выявлению взаимодействий, опосредованных мембранными рецепторами генетическими экранами, особенно подходит для исследователей, которые имеют целенаправленный интерес к отдельным лигандам, поскольку он позволяет избежать необходимости компиляции больших библиотек cDNA или рекомбинантных белков.
Этот анализ состоит из трех основных шагов: 1) Высоко заядлые рекомбинантные протеиновые связывающие зонды, состоящие из внеклеточных областей рецептора интереса, производятся и используются в связывающих сяпись на основе флуоресценции цитометрии; 2) Связывание анализы используются для определения клеточной линии, которая выражает взаимодействие партнера рекомбинантного зонда белка; 3) Cas9-выражение версия клеточной линии, которая взаимодействует с белком интерес производится и геном масштаба CRISPR / Cas9 основе нокаут экран выполняется(Рисунок 1). В этом генетическом экране, связывание рекомбинантного белка в клеточных линиях используется в качестве измеримого фенотипа, в котором клетки в библиотеке нокаутом, которые потеряли способность связывать зонд сортируются с помощью флуоресценции на основе активированной сортировки клеток (FACS) и генов, которые вызвали потерю связывающего фенотипа, идентифицированного путем секвенирования. В принципе, гены, кодируя рецептор, ответственный за связывание алчный зонд и те, необходимые для его поверхности клетки дисплей определены.
Первый шаг этого протокола включает в себя производство алчный рекомбинантных белковых зондов, представляющих эктодомен мембранных рецепторов. Эти рецепторы, как известно, часто сохраняют свои внеклеточные связывающие функции, когда их эктодоменов выражаются в качестве рекомбинантного растворимого белка1. Для белка интерес, растворимые рекомбинантные белки могут быть произведены в любой подходящей системы экспрессии эукариотического белка в любом формате при условии, что он может быть олигомеризирован для увеличения связывания жадности, и он содержит теги, которые могут быть использованы в флуоресценции на основе потока цитометрии основе связывающей анализы (например, FLAG-тег, биоттин-тег). Подробные протоколы для производства растворимых эктодоменов мембранных рецепторов с использованием системы экспрессии белка HEK293, а также различные методы мультимеризации и построения экспрессии белка для производства как пентамериковых белков, так и мономерных белков, ранее описаны1,,17. Протокол здесь будет описывать шаги для генерации флуоресцентных алчных зондов из мономерных биоинтинилобных белков, спряжение их стрептавидин спряженный к флюорохром (например, фикоэритрин, или PE), которые могут быть использованы непосредственно в клеточной основе связывающих анализов и имеет преимущество не требует вторичного антитела для обнаружения. Общие протоколы для выполнения генома масштаба экранов уже описаны20,21, Таким образом, протокол в основном сосредоточены на специфике выполнения потока цитометрии основе рекомбинантных белков связывающих экранов с использованием CRISPR / Cas9 нокаут скрининга системы с использованием человека V1 ("Yusa") библиотека18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse alkaline phosphatase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Chem-Cruz</td>
			<td>SC-204655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood &#38; Cell Culture DNA Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Kapa</td>
			<td>KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX with PLUS reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2+-NTA agarose beads</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-501-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OX-68 antibody</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1022R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1040-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 desalting columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes with 5 mL bed volume</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2&#215; Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCFA filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated microtitre plates</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>734-1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell surface receptor identification using genome-scale crispr/cas9 genetic screens

Межклеточная коммуникация, опосредованное прямыми взаимодействиями между мембранными клеточными рецепторами, имеет решающее значение для нормального развития и функционирования многоклеточных организмов. Однако обнаружение этих взаимодействий остается технически сложным. Данная рукопись описывает систематический подход к генетическому скринингу, основанному на геноме CRISPR/Cas9, который показывает клеточные пути, необходимые для конкретных событий распознавания поверхности клеток. Этот анализ использует рекомбинантные белки, вырабатываемые в системе экспрессии белка млекопитающих в качестве заядлых связывающих зондов для выявления партнеров по взаимодействию на генетическом экране на основе клеток. Этот метод может быть использован для определения генов, необходимых для взаимодействия поверхности клеток, обнаруженных рекомбинантными связывающими зондами, соответствующими эктодоменам мембранных рецепторов. Важно отметить, что, учитывая геном масштаба природы этого подхода, он также имеет то преимущество, не только выявление прямого рецептора, но и клеточных компонентов, которые необходимы для представления рецептора на поверхности клетки, тем самым обеспечивая ценную информацию о биологии рецептора.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens at JoVE.com

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Данная рукопись описывает подход к скринингу на основе клеток в масштабе генома для выявления внеклеточных взаимодействий рецепторов-лигандов.

Идентификация рецепторов поверхности клетки используя Геном-Шкала CRISPR/Cas9 Генетические экраны

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Обнаружение взаимодействий поверхности клеток с использованием имеющихся в настоящее время биохимических подходов по-прежнему создает технические проблемы. Этот протокол предоставляет генетическую альтернативу, используя подход к скринингу клеток масштаба генома для выявления взаимодействий рецепторов лиганда на поверхности клетки. В отличие от большинства других существующих методов, этот метод не делает никаких предположений относительно биологии рецепторов.Это дает возможность определить взаимодействия при посредничестве широкого спектра молекул поверхности клеток. Молекулы поверхности клеток непосредственно доступны для таких препаратов, как моноклональные антитела. Таким образом, определение взаимодействий при посредничестве этих молекул может иметь важные терапевтические последствия.Этот метод, как правило, применим к исследователям, заинтересованным в изучении клеточных процессов сигнализации и распознавания в широком диапазоне биологических контекстов, включая нейронные и иммунологические взаимодействия, а также взаимодействия патогенов-хозяина. Протокол требует высокой пропускной способности машины сортировки ячеей и следующего поколения секвенирования машин. Убедитесь, что эти средства доступны перед запуском протокола.Начните с восьми серийных разбавления образцов биотинилированного белка в пластине 96-колодец, гарантируя, что окончательный объем каждого разбавления составляет не менее 200 микролитров и что только тег управления включен. Сделайте дубликат пластины образцов, удалив 100 микролитров из каждой хорошо и передачи его в новую пластину 96-хорошо. Включите только теги управления белком, который будет использоваться в качестве контрольного зонда во всех обязательных эссе.Добавьте 100 микролитров по 0,1 микрограмма на миллилитр стрептавидина-PE к скважинам в одной из пластин и 100 микролитров буфера разбавления к скважинам другой пластины. Инкубировать пластину в течение 20 минут при комнатной температуре. Между тем, блокировать скважины стрептавидина закодированной пластины с буфером разбавления в течение 15 минут.После мытья тарелки убедитесь, что она сухая. Затем перенесите общий объем образца с обеих пластин на отдельные скважины стрептавидиновой кодовой пластины и инкубировать его в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации, мыть пластину три раза с 200 микролитров мыть буфера.Добавьте 100 микролитров мыши анти-крысы Cd4d3'4 IgG и инкубировать пластину еще на час. Повторите стирку. Добавьте 100 микролитров противомошачьей щелочной фосфатазы и оставьте тарелку при комнатной температуре на час.Затем мыть скважины три раза с мыть буфера и один раз с разбавления буфера. Подготовка р-нитрофенил фосфат на один миллиграмм на миллилитр в краситель этаноламин буфера и добавить 100 микролитров к каждой хорошо. После 15-минутной инкубации, измерить поглощение имеют каждый хорошо на 405 нанометров.Используйте минимальное разбавление, при котором нет сигнала на пластине, в качестве соответствующего фактора разбавления для создания тетраперов. Инкубировать стрептавидин-PE и соответствующее биотинилированное разбавление белка в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем храните конъюгированные белки в легкой защищенной трубке при четырех градусах Цельсия до дальнейшего использования.Спин конические трубки с обработанными и контроль образцов в 200 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и заморозить одну из труб при температуре минус 20 градусов по Цельсию для более длительного использования. Повторно приостановить гранулы в другой трубке в 10 миллилитров PBS с 1%BSA и выделить 100 микролитров клеток в качестве отрицательного контроля на 96-хорошо пластины.Затем докодированный рекомбинантный белок добавить к клеточной суспензии в конической трубке и в пластине 96-колодец. Выполните окрашивание клеток в течение по крайней мере одного часа при четырех градусах по Цельсию на роторе скамейки с нежным вращением. Затем гранулы клетки в 200 раз G в течение пяти минут и удалить супернатант.После мытья клеток дважды, повторно приостановить их в пять миллилитров PBS. Процедить клетки через 30 микрометровый ситечко, чтобы удалить клеточные кластеры. Затем проанализируйте их с потоком Содор.Используйте отрицательный контрольный образец для выхода на посадку для положительных и PE отрицательных ячеек BFP. Затем сортировать образец и собирать от 500 000 до 1 миллиона BFP положительных и PE отрицательных клеток в 1,5 миллилитров центрифугации трубки. Больная клетка будет зависеть от связывания клеток с белком, но обычно собираются от одного до 5% отрицательных образцов PE.Теперь пусть отсортированные клетки путем центрифугирования в течение 500 раз G в течение пяти минут, а затем тщательно удалить супернатант. Гранулы могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение шести месяцев. Используйте функцию подсчета магии для карты последовательностей от несортированной и отсортированной популяции до справочной библиотеки, которая даст необработанный файл подсчета.Вы запустите тестовую функцию магии, используя необработанные подсчеты из несортированного образца управления в качестве контроля и подсчеты из отсортированного образца в качестве лечения. Откройте сгенерированный файл резюме генов и ранжировать столбец ранга паузы в порядке возрастания. Затем определите попадания с ложной скоростью обнаружения менее 0,05 пункта.Рецептор, как правило, занимает очень часто в первой позиции. Наконец, используйте R или эквивалентное программное обеспечение для построения надежного рейтинга алгоритм оценка для положительного выбора. В клетках NCI-SNU-1 и HEC-293 соответственно были выполнены экраны нокдауна генома для идентификации связующего партнера человека TNFSF9 и P falciparum Rh5.Связывание поведения Rh5 было затронуто как гепараном сульфатом, так и известным рецептором BSG, в то время как TN-FRSF-9 не терял привязки к своему известному рецептору TN-FSF-9. При предварительной инкубации с растворимым гепарином. Распространение GNA в библиотеке миг-мутантов показало, что сложность библиотеки сохранялась на протяжении всего эксперимента.Техническое качество экранов оценивалось путем изучения распределения наблюдаемых складных изменений G-РНК, ориентированных на набор несуществующих генов, по сравнению с распределением для эталонного набора основных генов. Кроме того, обогащение на уровне путей показало, что были выявлены и значительно обогащены ожидаемые основные пути отсева населения. При сравнении образца управления с исходной плазмидной библиотекой.Надежный алгоритм ранга или RRA-оценка обеспечивает меру, из которых G-РНК последовательно ранжируются выше, чем ожидалось. На экране для TNFRSF9 лучшим хитом стал TNFSF9, который является известным связующим партнером. Кроме того, был также выявлен ряд генов, связанных с путем TP53.В случае RH5, в дополнение к известному рецептору, и гену, необходимому для производства сульфатных приколов, был также идентифицирован ген SLC16A1. Подход к скринингу, как правило, очень надежный, и непосредственно взаимодействующий рецептор должен быть высоко оценен в списке генов, обогащенных в этом порядке популяции. Очень важно проверить хиты, полученные с экрана.Если взаимодействие опосредовано белками, биохимические подходы, предназначенные для изучения бинарных белковых белковых взаимодействий, например, могут быть использованы для дальнейших исследований проверки. Из-за беспристрастной природы масштаба генома этого подхода, мы ожидаем, что он поможет в изучении взаимодействий при посредничестве трудно изучать молекулы клеток, таких как липиды, мультипасс мембранных белков и гликанов. Он также может выявить новые пути, необходимые для торговли рецепторами и биологии.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Первичных зародышевых клеток Трансплантация для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-основе скачка в Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Эффективное производство и генерируемые идентификации ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена нокауты в модели системы данио рерио

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Представляя ген нокаут непосредственно в Amastigote Этап trypanosoma cruzi Использование CRISPR / Cas9 системы

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...