Name: high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay
Uploaded: 2020-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

Vi takker Jamie Calma for at teste effekten af medievolumen på sygdom eller resistens resultater. Vi takker Dr. Maël Baudin og Dr. Karl J. Scheiber fra Lewis Lab for at give konstruktive kommentarer og forslag til manuskriptet. Forskning i planteimmunitet i Lewis laboratoriet blev støttet af USDA ARS 2030-21000-046-00D og 2030-21000-050-00D (JDL), og NSF Direktoratet for BiologiskE Videnskaber IOS-1557661 (JDL).

1. Forberedelse og anvendelse af biosikkerhedsskabe
<ol><li>Tør biosikkerhedsskabet af med 70 % ethanol.</li>
	<li>Luk rammen og tænd for ultraviolet lys i biosikkerhedsskabet i 15 min.</li>
	<li>Efter 15 minutter skal det ultraviolette lys slukkes i biosikkerhedsskabet. Løft rammen og tænd for blæseren i 15 min.</li>
	<li>Tør alle genstande, der skal bruges i biosikkerhedsskabet, af med 70 % ethanol, før varerne lægges i det steriliserede kabinet.</li>
	<li>Rene handsker eller bare hænder med 70 % ethanol, f?...

<ol>
	<li>Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plant+stomata+in+bacterial+invasion.">Role of plant stomata in bacterial invasion.</a> Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).</li><li>Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+molecular+events+in+PAMP-triggered+immunity.">Early molecular events in PAMP-triggered immunity.</a> Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).</li><li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines.">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li><li>Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins.">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li><li>Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+another+day:+molecular+mechanisms+of+effector-triggered+immunity+elicited+by+type+III+secreted+effector+proteins.">Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).</li><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitive+response-related+death.">Hypersensitive response-related death.</a> Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).</li><li>Boyd, L. A., Ridout, C., O'Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-pathogen+interactions:+disease+resistance+in+modern+agriculture.">Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture.</a> Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).</li><li>Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+in+field+tomatoes.">Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).</li><li>Pedley, K. F., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+Pto-mediated+resistance+to+bacterial+speck+disease+in+tomato.">Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato.</a> Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).</li><li>Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloned+avirulence+gene+AvrPto+induces+disease+resistance+in+tomato+cultivars+containing+the+Pto+resistance+gene.">The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene.</a> Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).</li><li>Martin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map-based+cloning+of+a+protein+kinase+gene+conferring+disease+resistance+in+tomato.">Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato.</a> Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).</li><li>Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+mutants+altered+in+bacterial+disease+resistance+provide+evidence+for+a+new+locus+controlling+pathogen+recognition.">Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition.</a> Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).</li><li>Salmeron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+Prf+is+a+member+of+the+leucine-rich+repeat+class+of+plant+disease+resistance+genes+and+lies+embedded+within+the+Pto+kinase+gene+cluster.">Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.</a> Cell. 86 (1), 123-133 (1996).</li><li>Scofield, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+gene-for-gene+specificity+in+bacterial+speck+disease+of+tomato.">Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato.</a> Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).</li><li>Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+evolutionary+analyses+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+genetically+monomorphic+and+under+strong+selection+to+evade+tomato+immunity.">The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity.</a> PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).</li><li>Almeida, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).</li><li>Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+AvrPtoB+homologs+from+several+Pseudomonas+syringae+pathovars+elicit+Pto-dependent+resistance+and+have+similar+virulence+activities.">Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).</li><li>Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+Pto+pathogen+resistance+gene+within+species+of+wild+tomato+(Lycopersicon).+I.+Functional+analysis+of+Pto+alleles.">Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles.</a> Genetics. 171 (1), 345-357 (2005).</li><li>Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTLs+controlling+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1+strains+from+the+wild+tomato+Solanum+habrochaites+LA1777.">Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777.</a> Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).</li><li>Bao, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+gene+in+Solanum+habrochaites+for+resistance+to+a+race+1+strain+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).</li><li>Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+seedling+resistance+assay+identifies+wild+tomato+lines+that+are+resistant+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).</li><li>Uppalapati, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+on+tomato+seedlings:+phenotypic+and+gene+expression+analyses+of+the+virulence+function+of+coronatine.">Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+tock:+circadian+regulation+of+plant+innate+immunity.">Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator.">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator.</a> Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).</li></ol>

En protokol for oversvømmelse inokulering med PstDC3000 eller Pst T1 optimerettil at opdage resistens over for disse bakterielle stammer i tomat planter er beskrevet. Der er flere kritiske parametre for optimale resultater i sætteplanteresistensanalysen, herunder bakteriekoncentration og overfladeaktivt stofkoncentration, som empirisk blev bestemt22. For PstDC3000 blev den optiske tæthed optimeret til at opnå fuldstændig overlevelse på en resistent sort, der indeho...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60805">High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay</a>. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Pseudomonas syringae er en Gram-negativ patogen bakterie, der inficerer en bred vifte af plante værter. Bakterier ind i værtsplanten gennem stomata eller fysiske sår og formere sig i apoplast1. Planter har udviklet en todelt immunrespons for at beskytte mod infektion med bakterielle patogener. Det første niveau forekommer på plantecelleoverfladen, hvor mønstergenkendelsesreceptorer på plantecellemembranen opfatter stærkt bevarede patogenrelaterede molekylære mønstre (PAMP'er) i en proces kaldet PAMP-udløst immunitet (PTI)2. Under denne proces, værtsplanten upregulates forsvar respons veje, herunder aflejring af callose til cellevæggen, lukning af stomata, produktion af reaktive ilt arter, og induktion af patogenese-relaterede gener.
Bakterier kan overvinde PTI ved at udnytte en type III sekresion system til at levere proteiner, kaldet effektorer, direkte ind i plantecellen3. Effektorproteiner er normalt rettet mod komponenter i PTI og fremmer patogenvirulens4. Det andet niveau af planteimmunitet opstår i plantecellen ved anerkendelse af effektorproteiner. Denne anerkendelse er afhængig af resistens gener, som indkode nukleotid-bindende site leucin-rige gentage indeholdende receptorer (NLRs). NLR'er er i stand til enten at genkende effektorer direkte eller genkende deres aktivitet på et virulensmål eller lokkedue5. De udløser derefter en sekundær immunrespons i en proces kaldet effector-udløst immunitet (ETI), som ofte er forbundet med en overfølsom respons (HR), en form for lokaliseret celledød på infektionsstedet6. I modsætning til gen-for-genresistens forbundet med ETI, planter kan udvise kvantitativ delvis resistens, som er afhængig af bidraget fra flere gener7.
P. syringae pv. tomat (Pst) er årsagssammenhæng af bakteriel plet på tomat og er en vedvarende landbrugsproblem. Fremherskende stammer i feltet har typisk været Pst race 0 stammer, der udtrykker den ene eller begge af type III effektorer AvrPto og AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) er en repræsentativ race 0 stamme og en model patogen, der kan forårsage bakteriel plet i tomat. For at bekæmpe bakteriel plet sygdom, opdrættere introgressed Pto [P. syringae pv. tomat]/ Prf [Pto resistens og fenthion følsomhed] genklynge fra den vilde tomatarter Solanum pimpinellifolium i moderne sorter8,9. Pto-genet koder et serine-threoninproteinkinase, der sammen med Prf NLR giver resistens over for PstDC3000 via anerkendelse af effektorerne AvrPto og AvrPtoB10,11,12,13,14. Denne modstand er imidlertid ineffektiv over for nye race 1-stammer, hvilket giver mulighed for deres hurtige og aggressive spredning i de seneste år15,16. Race 1 stammer unddrage anerkendelse af Pto / Prf klynge, fordi AvrPto er enten tabt eller muteret i disse stammer, og AvrPtoB synes at akkumulere minimalt15,17,18.
Vilde tomatpopulationer er vigtige reservoirer af naturlig variation for pst-resistens og er tidligere blevet anvendt til at identificere potentielresistens loci19,20,21. Men, nuværende skærme for patogenmodstand udnytte 4-5-ugergamle voksne planter20,21. Derfor er de begrænset af væksttid, vækstkammer plads, og relativt små stikprøvestørrelser. For at løse begrænsningerne af konventionelle tilgange, vi udviklet en høj-throughput tomat P. syringae modstand assay ved hjælp af 10-dages gamle tomat planter22. Denne tilgang giver flere fordele i forhold til at bruge voksne planter: nemlig kortere væksttid, reducerede pladskrav og højere gennemløb. Desuden har vi vist, at denne fremgangsmåde trofast opsummerer sygdomsresistens fænotyper observeret i voksne planter22.
I den kimvarmeanalyse, der er beskrevet i denne protokol, dyrkes tomatplanter på petriskåle af sterile Murashige- og Skoog-medier (MS) i 10 dage og oversvømmes derefter med et inokulum, der indeholder de pågældende bakterier og et overfladeaktivt stof. Efter oversvømmelser kan planter vurderes kvantitativt for sygdomsresistens via bakterievækstanalyser. Derudover kan sætteplante overlevelse eller død fungere som en diskret modstand eller sygdom fænotype 7-14 dage efter oversvømmelse. Denne tilgang tilbyder en høj-throughput alternativ til screening et stort antal vilde tomat tiltrædelser for resistens over for Pst race 1 stammer, såsom Pst stamme T1 (PstT1), og kan nemt tilpasses til andre bakterielle stammer af interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Tape Micropore 1/2&#34; x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm borosilicate glass beads</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock</td>
			<td>GB3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet, class II type A2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>47744-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>500029-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 190 Proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burner Wick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898A / No. W-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burners</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898 / No. BO125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol ACS reagent</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97061-356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97062-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2.2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Beadbeater-96, 115 volt</td>
			<td>Bio Spec Products Inc.</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog, Basal Salts</td>
			<td>Caisson Laboratories, Inc.</td>
			<td>MSP01-50LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-200XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB08-757-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150x15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>1013131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>R-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCO138454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 20 &#956;L 960/10 GPS-L10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 250 &#956;L 960/10 GPS-L250</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR dissecting forceps fine tip, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay

Tomat er en agronomisk vigtig afgrøde, der kan være inficeret med Pseudomonas syringae, en Gram-negativ bakterie, resulterer i bakteriel plet sygdom. Dentomat-P. syringae pv. tomat patosystem er almindeligt anvendt til at dissekere det genetiske grundlag for plante medfødte reaktioner og sygdomsresistens. Mens sygdommen blev forvaltet med succes i mange årtier gennem indførelsen af Pto / Prf genklyngen fra Solanum pimpinellifolium til dyrket tomat, race 1 stammer af P. syringae har udviklet sig til at overvinde resistens overrakt af Pto / Prf genklyngen og forekomme over hele verden.
Vilde tomatarter er vigtige reservoirer af naturlig mangfoldighed i patogengenkendelse, fordi de udviklede sig i forskellige miljøer med forskellige patogentryk. I typiske skærme for sygdomsresistens i vilde tomat, voksne planter anvendes, som kan begrænse antallet af planter, der kan screenes på grund af deres udvidede vækst tid og større vækst plads krav. Vi udviklede en metode til at screene 10-dages gamle tomatplanter for modstand, hvilket minimerer plantevækst tid og vækst kammer plads, giver mulighed for en hurtig omsætning af planter, og giver mulighed for store stikprøvestørrelser, der skal testes. Frøplanter resultater af overlevelse eller død kan behandles som diskrete fænotyper eller på en modstand skala defineret ved mængden af ny vækst i overlevende planter efter oversvømmelse. Denne metode er blevet optimeret til at screene 10-dages-gamle tomat planter for modstand mod to P. syringae stammer og kan nemt tilpasses til andre P. syringae stammer.

Påvisning af PtoR-medieretimmunitet i sorter og isogene linjer ved hjælp af sætteplantemodstandsanalysen Figur 5 viser repræsentative resultater for Moneymaker-PtoR og Moneymaker-PtoS kultivarer 7-10 dage efter oversvømmelse med PstDC3000. Før infektion, 10-dages gamle planter vises fuldt opstået og udvidet cotyledons og nye første sande blade. Frøplanterne blev oversvømmet med 10 mM MgCl2 + 0,015% overfladeaktivt s...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Den sætteplante oversvømmelse assay letter hurtig screening af vilde tomat tiltrædelser for modstanden mod Pseudomonas syringae bakterie. Denne analyse, der anvendes i forbindelse med sætteplante bakterievækst assay, kan hjælpe med yderligere at karakterisere den underliggende resistens over for bakterien, og kan bruges til at screene kortlægning populationer til at bestemme det genetiske grundlag for resistens.

High-Throughput Identifikation af resistens over for Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat ved hjælp af sætteplante Oversvømmelse Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Denne høje gennemløb protokol tillader hurtig screening af tomat planter fra vilde tiltrædelser til bakterielpatogen Pseudomonas syringae. Den kimplante oversvømmelse assay minimerer plantevækst tid og vækst kammer behov, giver mulighed for hurtig omsætning af planter, og giver mulighed for store stikprøvestørrelser, der skal testes. Denne analyse er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at screene for resistens i vilde tiltrædelser og andre linjer med komplekse genetiske baggrunde.Protokollen indeholder specifikke anvisninger for oversvømmelsesoplokker af to Pseudomonas syringae stammer. Men, Det er alsidig og kan ændres til at opdage vært resistens over for andre bakterielle patogener. Demonstration af proceduren vil være Yana Hasan, en forskningsspecialist i mit laboratorium.Begynd med at dyrke tomatplanter. Placer tomatfrø i en 2,2 milliliter mikrocentrifuge rør og tilsæt to milliliter 50% blegemiddel opløsning. Rock røret i 25 minutter derefter fjerne blegemiddel opløsning med en pipette.Tilsæt to milliliter ultra rent vand og vask frøene ved at vende røret fem gange. Aspirere væsken fra røret, og gentag vask fire gange mere. Efter den endelige vask tilsættes to milliliter ultra-rent vand og hæld frøene i en steril petriskål.Steriliser kraftækker ved at flamme dem i ethanol derefter bruge dem til at overføre fem til syv frø på en 100 med 25 milliliter plade med 0,5 XMS plus 0,8 procent agar medier. Luk pladens kanter med kirurgisk tape. Sørg for, at pladerne er stablet fladt og vender op.Stratificere steriliserede frø ved fire grader Celsius i mørke i mindst tre dage for at synkronisere spiring. Efter tre dage, lodret orientere pladerne, således at rødderne vil vokse ned langs overfladen af pladen og linjen af frø er orienteret vandret. Overfør frøene til et vækstkammer sat til 22 grader Celsius med en 16-timers lys, 8-timers mørk cyklus.Dyrk planterne i ti dage i kammeret, hvorefter de typisk vil vise fuldt ud og udvidet cotyledons og nye første sande blade. Streak friske bakterier på passende KB agar med en flad, steril tandstikker. For PstT1 inkuberes pladen ved 28 grader Celsius i 48 timer, før bakterierne i oversvømmelseseksperimentet blev brugt.For at forberede inokulumet, aseptisk resuspenderede bakterierne i steril, ti millimolar magnesiumchlorid til en optisk tæthed på 0,1. Derefter foretages to serielle fortyndinger for at opnå en arbejdskoncentration med en OD600 på 0075. Også forberede en 1 til ti fortynding af ikke-ioniske organosilicone overfladeaktivt copolymer i ti millimolar magnesiumchlorid.Vortex det og tilføje det til bakterier, hvirvlende røret til at blande. Overfør pladerne med de ti dage gamle planter fra vækstkammeret til biosikkerhedsskabet og fjern det kirurgiske tape. Derefter overføres seks milliliter inokulum til hver plade.Skub forsigtigt planterne ind i inokulumet med en pipettespids, og start en timer i tre minutter. Hold en plade i hver hånd og vip forsiden af pladen ned for at nedsænke cotyledons og blade af planter. Swish inoculum side til side fem til syv gange, så tip pladerne tilbage for at dække rødderne med inokulum.Vip pladerne ned igen og gentag cyklussen i i alt tre minutter. Hæld inokulum fra pladerne, sæt dem ned på en flad overflade, og hæld eventuelle resterende inoculum for anden gang. Ombryde pladerne og læg dem tilbage i vækstkammeret.Moneymaker-PtoR og Moneymaker-PtoS sorter blev oversvømmet med PSTDC3000 og fænotypet syv til ti dage efter oversvømmelser. Moneymaker-PtoR planter bære PtoPRF genklynge og var resistente over for PSTDC3000. Mens nær-isogenic Moneymaker-PtoS planter, som ikke kan genkende PSTDC3000 effektorer AVRPto eller AVRPto-B døde hurtigt, inden for syv dage efter oversvømmelser.Ti dage gamle planter blev oversvømmet med PstT1 og fænotypet mindst ti dage efter oversvømmelser. Modtagelige tiltrædelser var døde, havde brune apikale meristems og manglede ny vækst. I modsætning hertil viste resistente planter et højt niveau af ny grøn vækst og overlevede infektion med PstT1.Bakteriel vækst assays blev udført for kvantitativt at bekræfte PstT1 resistens og Solanum NeoRici LA1329. Der var en 1,7 log forskel i bakterievækst mellem resistente og modtagelige LA1329 og en 1,6 log forskel mellem resistente LA1329 og Moneymaker-PtoS, som korreleret med fænoopypiske resultater. Når du udfører denne analyse, de vigtigste ting at huske er at være meget opmærksomme på aseptisk teknik i hele protokollen og sikre, at alle planter på pladen er grundigt oversvømmet.Sørg for at autoklave inficeret plantevæv og bakterier og bortskaffe materialer i overensstemmelse med passende regler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Anvendelse af et High-throughput<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Brug Tomoauto: En protokol til High-throughput Automatiseret Cryo-elektron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

High-throughput bestemmelse af bakterier Repellent Polymerer til medicinsk udstyr

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Procesoptimering ved hjælp af høj gennemløb automatiseret mikro-bioreaktorer i kinesisk Hamster Ovary Cell Dyrkning

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Høj gennemløb Gær Strain Fænotryk med Dråbe-baseret RNA Sekventering

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering af dynamiske miljøforhold ved hjælp af en mikrofluidisk højoverførselsenhed

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...