Name: high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay
Uploaded: 2020-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

Nous remercions Jamie Calma d’avoir testé l’effet du volume des médias sur les maladies ou les résultats de la résistance. Nous remercions le Dr Mael Baudin et le Dr Karl J. Scheiber du Laboratoire Lewis d’avoir fourni des commentaires et des suggestions constructifs sur le manuscrit. La recherche sur l’immunité végétale dans le laboratoire Lewis a été soutenue par l’USDA ARS 2030-21000-046-00D et 2030-21000-050-00D (JDL), et la Direction des sciences biologiques de la NSF IOS-1557661 (JDL).

1. Préparation et utilisation d’armoires de biosécurité
<ol><li>Essuyez l’armoire de biosécurité avec 70% d’éthanol.</li>
	<li>Fermez la ceinture et allumez la lumière ultraviolette dans l’armoire de biosécurité pendant 15 min.</li>
	<li>Après 15 min, éteignez la lumière ultraviolette dans l’armoire de biosécurité. Soulevez la ceinture et allumez la souffleuse pendant 15 min.</li>
	<li>Essuyez tous les articles à utiliser dans l’armoire de biosécurité avec 70% d’éthanol avant de mettre l...

<ol>
	<li>Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plant+stomata+in+bacterial+invasion.">Role of plant stomata in bacterial invasion.</a> Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).</li><li>Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+molecular+events+in+PAMP-triggered+immunity.">Early molecular events in PAMP-triggered immunity.</a> Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).</li><li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines.">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li><li>Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins.">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li><li>Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+another+day:+molecular+mechanisms+of+effector-triggered+immunity+elicited+by+type+III+secreted+effector+proteins.">Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).</li><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitive+response-related+death.">Hypersensitive response-related death.</a> Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).</li><li>Boyd, L. A., Ridout, C., O'Sullivan, D. M., Leach, J. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map-based+cloning+of+a+protein+kinase+gene+conferring+disease+resistance+in+tomato.">Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato.</a> Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).</li><li>Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+mutants+altered+in+bacterial+disease+resistance+provide+evidence+for+a+new+locus+controlling+pathogen+recognition.">Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition.</a> Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).</li><li>Salmeron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+Prf+is+a+member+of+the+leucine-rich+repeat+class+of+plant+disease+resistance+genes+and+lies+embedded+within+the+Pto+kinase+gene+cluster.">Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.</a> Cell. 86 (1), 123-133 (1996).</li><li>Scofield, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+gene-for-gene+specificity+in+bacterial+speck+disease+of+tomato.">Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato.</a> Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).</li><li>Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+evolutionary+analyses+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+genetically+monomorphic+and+under+strong+selection+to+evade+tomato+immunity.">The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity.</a> PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).</li><li>Almeida, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).</li><li>Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. 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Functional analysis of Pto alleles.</a> Genetics. 171 (1), 345-357 (2005).</li><li>Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTLs+controlling+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1+strains+from+the+wild+tomato+Solanum+habrochaites+LA1777.">Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777.</a> Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).</li><li>Bao, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+gene+in+Solanum+habrochaites+for+resistance+to+a+race+1+strain+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).</li><li>Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+seedling+resistance+assay+identifies+wild+tomato+lines+that+are+resistant+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).</li><li>Uppalapati, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+on+tomato+seedlings:+phenotypic+and+gene+expression+analyses+of+the+virulence+function+of+coronatine.">Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+tock:+circadian+regulation+of+plant+innate+immunity.">Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator.">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator.</a> Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).</li></ol>

Un protocole d’inoculation d’inondation avec PstDC3000 ou PstT1 optimisé pour détecter la résistance à ces souches bactériennes dans les semis de tomates est décrit. Il existe plusieurs paramètres critiques pour des résultats optimaux dans l’essai de résistance aux semis, y compris la concentration bactérienne et la concentration de surfactant, qui ont été empiriquementdéterminés 22. Pour PstDC3000, la densité optique a été optimisée pour atteindr...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60805">High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay</a>. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Pseudomonas syringae est une bactérie pathogène Gram-négative qui infecte un large éventail d’hôtes végétaux. Les bactéries pénètrent dans la plante hôte par les stomates ou les blessures physiques et prolifèrent dans l’apoplast1. Les plantes ont développé une réponse immunitaire à deux niveaux pour se protéger contre l’infection par des agents pathogènes bactériens. Le premier niveau se produit à la surface des cellules végétales, où les récepteurs de reconnaissance des motifs sur la membrane des cellules végétales perçoivent des modèles moléculaires hautement conservés associés aux agents pathogènes (PAMP) dans un processus appelé immunité déclenchée par pAMP (PTI)2. Au cours de ce processus, la plante hôte dérégère les voies de réponse de défense, y compris le dépôt de callose à la paroi cellulaire, la fermeture des stomates, la production d’espèces réactives d’oxygène, et l’induction des gènes liés à la pathogénie.
Les bactéries peuvent surmonter PTI en utilisant un système de sécrétion de type III pour fournir des protéines, appelés effecteurs, directement dans la cellule végétale3. Les protéines Effector ciblent généralement les composants de PTI et favorisent la virulence pathogène4. Le deuxième niveau d’immunité végétale se produit dans la cellule végétale lors de la reconnaissance des protéines effectrices. Cette reconnaissance dépend des gènes de résistance, qui codent la répétition du site de liaison nucléotide contenant des récepteurs (NLR). Les NLR sont capables soit de reconnaître directement les effecteurs, soit de reconnaître leur activité sur une cible de virulence ou leurre5. Ils déclenchent alors une réponse immunitaire secondaire dans un processus appelé l’immunité effector-déclenchée (ETI), qui est souvent associée à une réponse hypersensible (HR), une forme de mort cellulaire localisée au site de l’infection6. Contrairement à la résistance du gène pour gène associée à l’ETI, les plantes peuvent présenter une résistance partielle quantitative, qui dépend de la contribution de multiples gènes7.
P. syringae pv. tomate (Pst) est l’agent causal de la tache bactérienne sur la tomate et est un problème agricole persistant. Les souches prédominantes sur le terrain ont généralement été les souches de la course Pst 0 qui expriment l’un ou l’autre ou les deux des effecteurs de type III AvrPto et AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) est une souche représentative de race 0 et un modèle pathogène qui peut causer des taches bactériennes dans la tomate. Pour lutter contre la maladie bactérienne des taches, les éleveurs ont introgressé le Pto [P. syringae pv. tomate]/Prf [Pto résistance et sensibilité au fenthion] groupe génétique de l’espèce de tomate sauvage Solanum pimpinellifolium dans les cultivars modernes8,9. Le gène Pto code une protéine sérine-threonine kinase protéine qui, avec le Prf NLR, confère une résistance à PstDC3000 via la reconnaissance des effecteurs AvrPto et AvrPtoB10,11,12,13,14. Cependant, cette résistance est inefficace contre les souches émergentes de la course 1, ce qui permet leur propagation rapide et agressive ces dernières années15,16. Les souches de la course 1 échappent à la reconnaissance par le cluster Pto/Prf, parce qu’AvrPto est soit perdu, soit muté dans ces souches, et AvrPtoB semble s’accumuler au minimum15,17,18.
Les populations de tomates sauvages sont d’importants réservoirs de variation naturelle pour la résistance au Pst et ont déjà été utilisées pour identifier les loci de résistance potentielle19,20,21. Cependant, les écrans actuels pour la résistance aux agents pathogènes utilisent des plantes adultes de 4 à 5 semaines20,21. Par conséquent, ils sont limités par le temps de croissance, l’espace de chambre de croissance, et la taille relativement petite d’échantillon. Pour répondre aux limites des approches conventionnelles, nous avons développé un essai de résistance aux seringues de tomate P. à haut débit à l’aide d’semis de tomates de 10 jours22. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport à l’utilisation de plantes adultes : à savoir, un temps de croissance plus court, des besoins d’espace réduits et un débit plus élevé. En outre, nous avons démontré que cette approche récapitule fidèlement les phénotypes de résistance aux maladies observés chez les plantes adultes22.
Dans l’analyse d’inondation des semis décrite dans ce protocole, les semis de tomates sont cultivés sur des boîtes de Petri de murashige stérile et Skoog (MS) médias pendant 10 jours, puis sont inondés d’un inoculum contenant les bactéries d’intérêt et un surfactant. Après les inondations, les semis peuvent être évalués quantitativement pour la résistance aux maladies par le biais d’essais de croissance bactérienne. En outre, la survie ou la mort des semis peut agir comme une résistance discrète ou un phénotype de la maladie 7 à 14 jours après l’inondation. Cette approche offre une alternative à haut débit pour le dépistage d’un grand nombre d’accessions à la tomate sauvage pour la résistance aux souches de la course Pst 1, telles que la souche Pst T1(PstT1), et peut facilement être adaptée à d’autres souches bactériennes d’intérêt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Tape Micropore 1/2&#34; x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm borosilicate glass beads</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock</td>
			<td>GB3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet, class II type A2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>47744-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>500029-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 190 Proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burner Wick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898A / No. W-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burners</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898 / No. BO125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol ACS reagent</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97061-356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97062-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2.2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Beadbeater-96, 115 volt</td>
			<td>Bio Spec Products Inc.</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog, Basal Salts</td>
			<td>Caisson Laboratories, Inc.</td>
			<td>MSP01-50LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-200XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB08-757-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150x15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>1013131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>R-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCO138454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 20 &#956;L 960/10 GPS-L10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 250 &#956;L 960/10 GPS-L250</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR dissecting forceps fine tip, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay

La tomate est une culture d’importance agronomique qui peut être infectée par les seringues Pseudomonas, une bactérie Gram-négative, entraînant une maladie bactérienne des taches. La tomate-P. syringae pv. le pathosystem de tomate est employé couramment pour disséquer la base génétique des réponses innées de plante et de résistance de la maladie. Alors que la maladie a été gérée avec succès pendant de nombreuses décennies grâce à l’introduction de l’amas de gènes Pto/Prf de Solanum pimpinellifolium dans la tomate cultivée, les souches de la race 1 des seringues P. ont évolué pour surmonter la résistance conférée par le groupe génétique Pto/Prf et se produisent dans le monde entier.
Les espèces de tomates sauvages sont d’importants réservoirs de diversité naturelle dans la reconnaissance des agents pathogènes, parce qu’elles ont évolué dans divers environnements avec différentes pressions pathogènes. Dans les écrans typiques pour la résistance aux maladies dans la tomate sauvage, les plantes adultes sont utilisées, ce qui peut limiter le nombre de plantes qui peuvent être examinées en raison de leur temps de croissance prolongée et de plus grandes exigences d’espace de croissance. Nous avons mis au point une méthode pour dépister les semis de tomates vieux de 10 jours pour détecter la résistance, ce qui réduit au minimum le temps de croissance des plantes et l’espace de la chambre de croissance, permet un roulement rapide des plantes et permet de tester de grandes tailles d’échantillons. Les résultats de la survie ou de la mort peuvent être traités comme des phénotypes discrets ou sur une échelle de résistance définie par la quantité de nouvelle croissance des semis survivants après les inondations. Cette méthode a été optimisée pour filtrer les semis de tomates vieux de 10 jours pour la résistance à deux souches de seringues P. et peuvent facilement être adaptées à d’autres souches de seringues P.

Détection de l’immunité PtoR-négociée dans les cultivars et les lignées isogéniques à l’aide de l’essai de résistance aux semis La figure 5 montre des résultats représentatifs pour les cultivars Moneymaker-PtoR et Moneymaker-PtoS 7 à 10 jours après les inondations avec PstDC3000. Avant l’infection, les semis de 10 jours ont montré des cotyledons complètement émergés et agrandis et des premières feuilles vraies ?...

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High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

L’essai d’inondation de semis facilite le criblage rapide des adhésions de tomate sauvage pour la résistance à la bactérie de seringue de Pseudomonas. Cet essai, utilisé en conjonction avec l’essai de croissance bactérienne de semis, peut aider à caractériser davantage la résistance sous-jacente à la bactérie, et peut être employé pour dépister la cartographie des populations pour déterminer la base génétique de la résistance.

Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Ce protocole à haut débit permet un criblage rapide des semis de tomates des accessions sauvages à l’agent pathogène bactérien Pseudomonas seringues. L’analyse des inondations de semis minimise le temps de croissance des plantes et les besoins en chambre de croissance, permet un roulement rapide des plantes et permet de tester de grandes tailles d’échantillons. Cet essai est un outil puissant qui peut être utilisé pour dépister la résistance dans les accessions sauvages et d’autres lignées avec des antécédents génétiques complexes.Le protocole fournit des indications spécifiques pour l’innoculation des inondations de deux souches de seringues Pseudomonas. Cependant, il est polyvalent et peut être modifié pour détecter la résistance de l’hôte à d’autres pathogènes bactériens. Yana Hasan, spécialiste de la recherche dans mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par faire pousser les semis de tomates. Placer les graines de tomate dans un tube de microcentrifugeuse de 2,2 millilitres et ajouter deux millilitres de solution d’eau de Javel à 50 %. Faire basculer le tube pendant 25 minutes, puis retirer la solution d’eau de Javel à l’l’intérieur d’une pipette.Ajouter deux millilitres d’eau ultra pure et laver les graines en inversant le tube cinq fois. Aspirer le liquide du tube, et répéter le lavage quatre fois de plus. Après le lavage final, ajouter deux millilitres d’eau ultra-pure et verser les graines dans une boîte de Pétri stérile.Stériliser les forceps en les flamant dans l’éthanol, puis les utiliser pour transférer cinq à sept graines sur une plaque de 100 par 25 millilitres avec 0,5 XMS plus 0,8 pour cent de médias d’agar. Sceller les bords de la plaque avec du ruban chirurgical. Assurez-vous que les plaques sont empilées à plat et face vers le haut.Stratifier les graines stérilisées à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant au moins trois jours pour synchroniser la germination. Après trois jours, orientez verticalement les plaques de façon à ce que les racines poussent le long de la surface de l’assiette et que la ligne de graines soit orientée horizontalement. Transférer les graines dans une chambre de croissance réglée à 22 degrés Celsius avec un cycle sombre de 16 heures de lumière et de 8 heures.Faites pousser les semis pendant dix jours dans la chambre, à ce moment-là, ils afficheront généralement des cotyléons entièrement émergés et élargis et des premières feuilles vraies émergentes. Striez les bactéries fraîches sur l’agar KB approprié avec un cure-dent plat et stérile. Pour le PstT1, incuber la plaque à 28 degrés Celsius pendant 48 heures avant d’utiliser les bactéries dans l’expérience d’inondation.Pour préparer l’inoculum, résusquer aseptiquement les bactéries dans le chlorure de magnésium stérile et dix millimolaire à une densité optique de 0,1. Ensuite, faire deux dilutions en série pour obtenir une concentration de travail avec un OD600 de 0075. Préparez également une dilution d’un à dix de copolymer surfactant d’organosilicone non ionique dans le chlorure de magnésium de dix millimolar.Vortex et l’ajouter aux bactéries, tourbillonnant le tube pour mélanger. Transférer les assiettes avec les semis vieux de dix jours de la chambre de croissance à l’armoire de biosécurité et enlever le ruban chirurgical. Transférer ensuite six millilitres d’inoculum à chaque assiette.Poussez doucement les semis dans l’inoculum à l’aide d’une pointe de pipette et démarrez une minuterie pendant trois minutes. Tenez une assiette dans chaque main et inclinez l’avant de la plaque vers le bas pour submerger les cotyléons et les feuilles des semis. Swish le côté inoculum à côté cinq à sept fois, puis incliner les plaques en arrière pour couvrir les racines avec l’inoculum.Inclinez à nouveau les plaques et répétez le cycle pendant un total de trois minutes. Versez l’inoculum des assiettes, ez-les sur une surface plane et versez l’inoculum résiduel une deuxième fois. Ré-envelopper les assiettes et les remettre dans la chambre de croissance.Les cultivars Moneymaker-PtoR et Moneymaker-PtoS ont été inondés de PSTDC3000 et phénotypés sept à dix jours après les inondations. Les semis Moneymaker-PtoR sont porteurs du groupe génétique PtoPRF et étaient résistants au PSTDC3000. Alors que les semis Moneymaker-PtoS quasi isogéniques, qui ne peuvent pas reconnaître les effecteurs PSTDC3000 AVRPto ou AVRPto-B sont morts rapidement, dans les sept jours suivant les inondations.Les semis vieux de dix jours ont été inondés de PstT1 et phénotypés au moins dix jours après les inondations. Les accessions sensibles étaient mortes, avaient des meristems apical bruns et manquaient de nouvelle croissance. En revanche, les semis résistants ont montré un niveau élevé de nouvelle croissance verte et ont survécu à l’infection avec PstT1.Des analyses de croissance bactérienne ont été effectuées pour confirmer quantitativement la résistance pstT1 et Solanum NeoRici LA1329. Il y avait une différence de 1,7 bille dans la croissance bactérienne entre la LA1329 résistante et sensible et une différence de 1,6 journal entre la LA1329 résistante et Moneymaker-PtoS, qui était corrélée avec les résultats phénotypiques. Lors de cet essai, les choses les plus importantes à retenir sont de prêter une attention particulière à la technique aseptique tout au long du protocole et de s’assurer que tous les semis sur la plaque sont complètement inondés.Assurez-vous d’autoclaver les tissus végétaux et les bactéries infectés et d’éliminer les matériaux conformément à la réglementation appropriée.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

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The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

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À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

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