Name: high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay
Uploaded: 2020-03-10T14:00:00
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Wir danken Jamie Calma für die Prüfung der Wirkung des Medienvolumens auf Krankheits- oder Resistenzergebnisse. Wir danken Dr. Mael Baudin und Dr. Karl J. Scheiber vom Lewis Lab für die konstruktiven Kommentare und Anregungen zum Manuskript. Die Forschung zur Pflanzenimmunität im Lewis-Labor wurde von der USDA ARS 2030-21000-046-00D und 2030-21000-050-00D (JDL) und der NSF-Direktion für Biologische Wissenschaften IOS-1557661 (JDL) unterstützt.

1. Vorbereitung und Verwendung des Biosicherheitsschranks
<ol><li>Biosicherheitsschrank mit 70% Ethanol abwischen.</li>
	<li>Schließen Sie die Schärpe und schalten Sie das ultraviolette Licht im Biosicherheitsschrank für 15 min ein.</li>
	<li>Nach 15 min schalten Sie das ultraviolette Licht im Biosicherheitsschrank aus. Heben Sie die Schärpe an und schalten Sie das Gebläse 15 min ein.</li>
	<li>Wischen Sie alle Gegenstände, die im Biosicherheitsschrank verwendet werden sollen, mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Ge...

<ol>
	<li>Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plant+stomata+in+bacterial+invasion.">Role of plant stomata in bacterial invasion.</a> Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).</li><li>Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+molecular+events+in+PAMP-triggered+immunity.">Early molecular events in PAMP-triggered immunity.</a> Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).</li><li>Galan, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+Prf+is+a+member+of+the+leucine-rich+repeat+class+of+plant+disease+resistance+genes+and+lies+embedded+within+the+Pto+kinase+gene+cluster.">Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.</a> Cell. 86 (1), 123-133 (1996).</li><li>Scofield, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+gene-for-gene+specificity+in+bacterial+speck+disease+of+tomato.">Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato.</a> Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).</li><li>Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+evolutionary+analyses+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+genetically+monomorphic+and+under+strong+selection+to+evade+tomato+immunity.">The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity.</a> PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).</li><li>Almeida, N. 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Ein Protokoll zur Hochwasserimpfung mit PstDC3000 oder PstT1, das optimiert ist, um Resistenzen gegen diese Bakterienstämme bei Tomatensämlingen zu erkennen, wird beschrieben. Es gibt mehrere kritische Parameter für optimale Ergebnisse im Sämlingsresistenztest, einschließlich der Bakterienkonzentration und Tensidkonzentration, die empirisch bestimmt wurden22. Für PstDC3000 wurde die optische Dichte optimiert, um ein vollständiges Überleben auf einer resistenten S...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60805">High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay</a>. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Pseudomonas syringae ist ein gramnegatives pathogenes Bakterium, das eine breite Palette von Pflanzenwirten infiziert. Bakterien gelangen durch die Stomata oder physikalische Wunden in die Wirtspflanze und vermehren sich im Apoplast1. Pflanzen haben eine zweistufige Immunantwort entwickelt, um vor Infektionen durch bakterielle Krankheitserreger zu schützen. Die erste Ebene tritt an der Pflanzenzelloberfläche auf, wo Mustererkennungsrezeptoren auf der Pflanzenzellmembran hochkonservierte pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) in einem Prozess namens PAMP-triggered immunity (PTI)2wahrnehmen. Während dieses Prozesses reguliert die Wirtsanlage die Abwehrwege, einschließlich der Ablagerung von Callose an die Zellwand, dem Verschluss von Stomata, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und der Induktion pathogenesebezogener Gene.
Bakterien können PTI überwinden, indem sie ein Sekretionssystem des Typs III verwenden, um Proteine, sogenannte Effektoren, direkt in die Pflanzenzelle3zu liefern. Effektorproteine zielen häufig auf Komponenten von PTI ab und fördern die Pathogenvirulenz4. Die zweite Stufe der Pflanzenimmunität tritt innerhalb der Pflanzenzelle bei der Erkennung der Effektorproteine auf. Diese Erkennung ist abhängig von Resistenzgenen, die Nukleotid-bindende Stelle leucin-reiche Wiederholungsrezeptoren (NLRs) kodieren. NLRs sind in der Lage, Effektoren entweder direkt zu erkennen oder ihre Aktivität auf einem Virulenzziel oder Lockvogel5zu erkennen. Sie lösen dann eine sekundäre Immunantwort in einem Prozess namens Effektor-ausgelöste Immunität (ETI), die oft mit einer überempfindlichen Reaktion (HR) verbunden ist, eine Form des lokalisierten Zelltodes an der Stelle der Infektion6. Im Gegensatz zur Gen-für-Gen-Resistenz im Zusammenhang mit ETI können Pflanzen eine quantitative Partielleresistenz aufweisen, die vom Beitrag mehrerer Gene abhängt7.
P. syringae pv. Tomate (Pst) ist der Erreger von bakteriellen Flecken auf Tomaten und ist ein anhaltendes landwirtschaftliches Problem. Vorherrschende Stämme im Feld waren typischerweise Pst-Race 0-Stämme, die einen oder beide der Typ-III-Effektoren AvrPto und AvrPtoB ausdrücken. DC3000(PstDC3000) ist ein repräsentativer Race 0-Stamm und ein Modell-Erreger, der bakterielle Flecken in Tomaten verursachen kann. Zur Bekämpfung der bakteriellen Speckkrankheit introgressierten Züchter den Pto [P. syringae pv. tomato]/Prf [Pto resistance and fenthion sensitivity] gen cluster from the wild tomato species Solanum pimpinellifolium into modern cultivars8,9. Das Pto-Gen kodiert eine Serin-Threonin-Proteinkinase, die zusammen mit der Prf NLR eine Resistenz gegen PstDC3000 durch Erkennung der Effektoren AvrPto und AvrPtoB10,11,12,13,14verleiht. Allerdings ist dieser Widerstand wirkungslos gegen aufkommende Race 1-Stämme, die ihre schnelle und aggressive Ausbreitung in den letzten Jahren15,16ermöglichen. Race 1-Stämme umgehen der Erkennung durch den Pto/Prf-Cluster, da AvrPto entweder verloren geht oder in diesen Stämmen mutiert ist und AvrPtoB minimal15,17,18anzusammeln scheint.
Wilde Tomatenpopulationen sind wichtige Reservoirs der natürlichen Variation für Pst-Resistenz und wurden zuvor verwendet, um potenzielle Resistenz loci19,20,21zu identifizieren. Aktuelle Siebe auf Pathogenresistenz nutzen jedoch 4–5 Wochen alte erwachsene Pflanzen20,21. Daher sind sie durch Wachstumszeit, Wachstumskammerraum und relativ kleine Stichprobengrößen begrenzt. Um die Grenzen konventioneller Ansätze auszuräumen, haben wir einen Hochdurchsatz-Tomaten-P.-Syringae-Resistenz-Assay mit 10 Tage alten Tomatensämlingen22entwickelt. Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung erwachsener Pflanzen: nämlich kürzere Wachstumszeit, geringerer Platzbedarf und höherer Durchsatz. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass dieser Ansatz die bei erwachsenen Pflanzen beobachteten Perhänotypen der Krankheitsresistenz getreu rekapituliert22.
In dem in diesem Protokoll beschriebenen Sämling-Fluttest werden Tomatensämlinge 10 Tage lang auf Petrischalen steriler Murashige- und Skoog-Medien (MS) angebaut und dann mit einem Inokulum überflutet, das die von Interesse verwendeten Bakterien und ein Tensid enthält. Nach Überschwemmungen können Sämlinge mittels bakterieller Wachstumstests quantitativ auf Krankheitsresistenz ausgewertet werden. Darüber hinaus kann das Überleben oder der Tod von Sämlingen 7-14 Tage nach der Überflutung als diskreter Resistenz- oder Krankheitsphänotyp fungieren. Dieser Ansatz bietet eine Alternative mit hohem Durchsatz für das Screening einer großen Anzahl von Wildtomaten-Beitritten auf Resistenz gegen Pst Race 1-Stämme, wie Pst-Stamm T1 (PstT1), und kann leicht an andere bakterielle Stämme von Interesse angepasst werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Tape Micropore 1/2&#34; x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm borosilicate glass beads</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock</td>
			<td>GB3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet, class II type A2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>47744-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>500029-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 190 Proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burner Wick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898A / No. W-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burners</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898 / No. BO125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol ACS reagent</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97061-356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97062-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2.2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Beadbeater-96, 115 volt</td>
			<td>Bio Spec Products Inc.</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog, Basal Salts</td>
			<td>Caisson Laboratories, Inc.</td>
			<td>MSP01-50LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-200XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB08-757-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150x15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>1013131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>R-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCO138454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 20 &#956;L 960/10 GPS-L10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 250 &#956;L 960/10 GPS-L250</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR dissecting forceps fine tip, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay

Tomate ist eine agronomisch wichtige Pflanze, die von Pseudomonas syringaeinfiziert werden kann, einem gramnegativen Bakterium, das zu einer bakteriellen Speckerkrankung führt. Die Tomaten-P. syringae pv. Tomatenpathosystem ist weit verbreitet, um die genetische Grundlage der pflanzenanten Reaktionen und Krankheitsresistenz zu sezieren. Während Die Krankheit über viele Jahrzehnte erfolgreich durch die Einführung des Pto/Prf-Genclusters aus Solanum pimpinellifolium in kultivierte Tomaten gemanagt wurde, haben sich Rassen-1-Stämme von P. Syringae entwickelt, um Resistenzen des Pto/Prf-Genclusters zu überwinden und weltweit vorzufinden.
Wilde Tomatenarten sind wichtige Reservoirs natürlicher Vielfalt bei der Erkennung von Krankheitserregern, da sie sich in verschiedenen Umgebungen mit unterschiedlichen Krankheitserregerdrücken entwickelt haben. In typischen Siebeinwänden zur Krankheitsresistenz in Wildtomaten kommen erwachsene Pflanzen zum Einsatz, die aufgrund ihrer verlängerten Wachstumszeit und des größeren Wachstumsraumbedarfs die Anzahl der Pflanzen begrenzen können, die gesiebt werden können. Wir haben eine Methode entwickelt, um 10 Tage alte Tomatensämlinge auf Resistenz zu prüfen, die die Pflanzenwachstumszeit und den Wachstumsraum minimiert, einen schnellen Umbruch von Pflanzen ermöglicht und große Probengrößen testen lässt. Die Samenergebnisse des Überlebens oder des Todes können als diskrete Phänotypen oder auf einer Resistenzskala behandelt werden, die durch die Menge des neuen Wachstums bei überlebenden Sämlingen nach Überschwemmungen definiert wird. Diese Methode wurde optimiert, um 10 Tage alte Tomatensämlinge auf Widerstand gegen zwei P. syringae-Stämme zu überprüfen und kann leicht an andere P. syringae-Stämme angepasst werden.

Nachweis der PtoR-vermitteltenImmunität in Sorten und isogenen Linien mit dem Sämlingsresistenztest Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse für Moneymaker-PtoR und Moneymaker-PtoS-Sorten 7-10 Tage nach dem Hochwasser mit PstDC3000. Vor der Infektion zeigten 10 Tage alte Sämlinge vollständig aufgetauchte und erweiterte Kotyledonen und entstehende erste echte Blätter. Die Sämlinge wurden mit 10 mM MgCl2 + 0,015% Ten...

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High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Der Sämlingsfluttest erleichtert die schnelle Überprüfung von Wildtomaten-Beitritten auf die Resistenz gegen das Pseudomonas syringae Bakterium. Dieser Assay, der in Verbindung mit dem bakteriellen Wachstumstest verwendet wird, kann bei der weiteren Charakterisierung der zugrunde liegenden Resistenz gegen das Bakterium helfen und kann verwendet werden, um Kartierungspopulationen zu untersuchen, um die genetische Grundlage des Widerstands zu bestimmen.

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Dieses Protokoll mit hohem Durchsatz ermöglicht ein schnelles Screening von Tomatensämlingen aus wilden Zuwanderungen zum bakteriellen Erreger Pseudomonas syringae. Der Sämlingsfluttest minimiert den Bedarf an Pflanzenwachstumszeit und Wachstumskammer, ermöglicht einen schnellen Umschlag von Pflanzen und ermöglicht die Prüfung großer Probengrößen. Dieser Test ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um widerstanden in wilden Beitritten und anderen Linien mit komplexen genetischen Hintergründen zu überprüfen.Das Protokoll enthält spezifische Anweisungen für die Flutinnoculation von zwei Pseudomonas syringae Stämmen. Es ist jedoch vielseitig und kann modifiziert werden, um wirtResistenz gegen andere bakterielle Krankheitserreger zu erkennen. Demonstriert wird das Verfahren von Yana Hasan, einer Forschungsspezialistin in meinem Labor.Beginnen Sie mit dem Anbau der Tomatensämlinge. Tomatensamen in ein 2,2 Milliliter Mikrozentrifugenrohr geben und zwei Milliliter 50%Bleichlösung hinzufügen. Das Rohr 25 Minuten lang einsansanigen und die Bleichlösung mit einer Pipette entfernen.Fügen Sie zwei Milliliter ultrareines Wasser hinzu und waschen Sie die Samen, indem Sie die Röhre fünfmal invertieren. Die Flüssigkeit aus dem Rohr ansaugen und die Wäsche noch viermal wiederholen. Nach der letzten Wäsche zwei Milliliter reines Wasser hinzufügen und die Samen in eine sterile Petrischale gießen.Sterilisieren Sie Zangen, indem Sie sie in Ethanol entzünden, dann verwenden Sie sie, um fünf bis sieben Samen auf eine 100 mal 25 Milliliter Platte mit 0,5 XMS plus 0,8 Prozent Agar-Medien zu übertragen. Versiegeln Sie die Ränder der Platte mit chirurgischem Klebeband. Stellen Sie sicher, dass die Platten flach und verdeckt gestapelt sind.Die sterilisierten Samen bei vier Grad Celsius im Dunkeln mindestens drei Tage lang streuen, um die Keimung zu synchronisieren. Nach drei Tagen die Platten vertikal so ausrichten, dass die Wurzeln entlang der Oberfläche der Platte nach unten wachsen und die Samenlinie horizontal ausgerichtet ist. Übertragen Sie die Samen in eine Wachstumskammer, die auf 22 Grad Celsius mit einem 16-stündigen hellen, 8-stündigen dunklen Zyklus eingestellt ist.Wachsen Sie die Sämlinge für zehn Tage in der Kammer, an diesem Punkt werden sie in der Regel vollständig entstandene und erweiterte Kotyledonen und entstehende erste wahre Blätter zeigen. Streichen Sie frische Bakterien auf einen geeigneten KB-Agar mit einem flachen, sterilen Zahnstocher. Für PstT1, inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius für 48 Stunden vor der Verwendung der Bakterien im Hochwasserexperiment.Um das Inokulum vorzubereiten, setzen Sie die Bakterien aseptisch in sterilem, zehn Millimolaren Magnesiumchlorid auf eine optische Dichte von 0,1 aus. Machen Sie dann zwei serielle Verdünnungen, um eine Arbeitskonzentration mit einem OD600 von 0075 zu erhalten. Bereiten Sie auch eine ein bis zehn Verdünnung des nichtionischen Organosilikon-Tensid-Copolymers in zehn Millimolar-Magnesiumchlorid vor.Wirbel nieren und fügen Sie es zu den Bakterien, wirbeln die Röhre zu mischen. Die Platten mit den zehn Tage alten Sämlingen aus der Wachstumskammer in den Biosicherheitsschrank geben und das Operationsband entfernen. Dann sechs Milliliter Inokulum auf jede Platte übertragen.Die Sämlinge vorsichtig mit einer Pipettenspitze in das Inokulum schieben und einen Timer für drei Minuten starten. Halten Sie eine Platte in jeder Hand und kippen Sie die Vorderseite der Platte nach unten, um die Kotyledonen und Blätter der Sämlinge zu untertauchen. Wischen Sie die InokulumSeite zur Seite fünf bis sieben Mal, dann kippen Sie die Platten zurück, um die Wurzeln mit dem Inokulum zu bedecken.Neigen Sie die Platten erneut nach unten und wiederholen Sie den Zyklus für insgesamt drei Minuten. Gießen Sie das Inokulum von den Platten, setzen Sie sie auf eine flache Oberfläche, und gießen Sie alle Restinokulum für ein zweites Mal. Die Platten umwickeln und wieder in die Wachstumskammer legen.Moneymaker-PtoR und Moneymaker-PtoS-Sorten wurden sieben bis zehn Tage nach dem Hochwasser mit PSTDC3000 überflutet und phänotypisiert. Moneymaker-PtoR Sämlinge tragen den PtoPRF-Gencluster und waren resistent gegen den PSTDC3000. Während nahezu isogene Moneymaker-PtoS-Sämlinge, die die PSTDC3000-Effektoren AVRPto oder AVRPto-B nicht erkennen können, innerhalb von sieben Tagen nach Überschwemmungen schnell starben.Zehn Tage alte Sämlinge wurden mit PstT1 überflutet und mindestens zehn Tage nach dem Hochwasser phänotypisiert. Anfällige Beitritte waren tot, hatten braune apikale Meristems und es fehlte an neuem Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigten resistente Sämlinge ein hohes Maß an neuem grünem Wachstum und überlebten eine Infektion mit PstT1.Bakterielle Wachstumstests wurden durchgeführt, um die PstT1-Resistenz und Solanum NeoRici LA1329 quantitativ zu bestätigen. Es gab einen Unterschied von 1,7 Log im Bakterienwachstum zwischen resistentem und anfälligem LA1329 und einem 1,6-Log-Unterschied zwischen resistentem LA1329 und Moneymaker-PtoS, der mit den phänotypischen Ergebnissen korrelierte. Bei der Durchführung dieses Assays sind die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, die aufmerksamkeiter Aufmerksamkeit auf die aseptische Technik während des gesamten Protokolls zu richten und sicherzustellen, dass alle Sämlinge auf der Platte gründlich überflutet werden.Achten Sie darauf, infiziertes Pflanzengewebe und Bakterien zu autoklavieren und Materialien in Übereinstimmung mit den entsprechenden Vorschriften zu entsorgen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Hefestamm-Phänotypisierung mit Droplet-basierter RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...