Name: high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay
Uploaded: 2020-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

אנו מודים לג Calma על בדיקת ההשפעה של עוצמת המדיה על המחלה או תוצאות ההתנגדות. אנו מודים לד ר מייסר באודין וד ר קרל שייבר ממעבדת לואיס למתן הערות והצעות בונות על כתב היד. מחקר על חסינות הצמח במעבדה לואיס היה נתמך על ידי משרד החקלאות בשנת 2030-21000-046-00D ו-2030-21000-050-00D (JDL), ואת מינהל NSF למדעי הביולוגיה IOS-1557661 (JDL).

1. הכנה ושימוש בארונות בטיחות
<ol><li>נגב את ארון הביוטיחות. עם 70% אתנול</li>
	<li>סגרו את האבנט והדליקו את האור האולטרה-סגול בארון הביובטיחות במשך 15 דקות.</li>
	<li>לאחר 15 דקות, לכבות את האור האולטרה סגול בארון אבטחה טיחות. הרם את האבנט ותדליק. את המפוח למשך 15 דקות</li>
	<li>למחוק את כל הפריטים כדי לשמש הקבי?...

<ol>
	<li>Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plant+stomata+in+bacterial+invasion.">Role of plant stomata in bacterial invasion.</a> Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).</li><li>Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+molecular+events+in+PAMP-triggered+immunity.">Early molecular events in PAMP-triggered immunity.</a> Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).</li><li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines.">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li><li>Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins.">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li><li>Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+another+day:+molecular+mechanisms+of+effector-triggered+immunity+elicited+by+type+III+secreted+effector+proteins.">Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).</li><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitive+response-related+death.">Hypersensitive response-related death.</a> Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).</li><li>Boyd, L. A., Ridout, C., O'Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-pathogen+interactions:+disease+resistance+in+modern+agriculture.">Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture.</a> Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).</li><li>Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+in+field+tomatoes.">Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).</li><li>Pedley, K. F., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+Pto-mediated+resistance+to+bacterial+speck+disease+in+tomato.">Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato.</a> Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).</li><li>Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloned+avirulence+gene+AvrPto+induces+disease+resistance+in+tomato+cultivars+containing+the+Pto+resistance+gene.">The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene.</a> Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).</li><li>Martin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map-based+cloning+of+a+protein+kinase+gene+conferring+disease+resistance+in+tomato.">Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato.</a> Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).</li><li>Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+mutants+altered+in+bacterial+disease+resistance+provide+evidence+for+a+new+locus+controlling+pathogen+recognition.">Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition.</a> Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).</li><li>Salmeron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+Prf+is+a+member+of+the+leucine-rich+repeat+class+of+plant+disease+resistance+genes+and+lies+embedded+within+the+Pto+kinase+gene+cluster.">Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.</a> Cell. 86 (1), 123-133 (1996).</li><li>Scofield, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+gene-for-gene+specificity+in+bacterial+speck+disease+of+tomato.">Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato.</a> Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).</li><li>Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+evolutionary+analyses+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+genetically+monomorphic+and+under+strong+selection+to+evade+tomato+immunity.">The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity.</a> PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).</li><li>Almeida, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).</li><li>Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+AvrPtoB+homologs+from+several+Pseudomonas+syringae+pathovars+elicit+Pto-dependent+resistance+and+have+similar+virulence+activities.">Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).</li><li>Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+Pto+pathogen+resistance+gene+within+species+of+wild+tomato+(Lycopersicon).+I.+Functional+analysis+of+Pto+alleles.">Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles.</a> Genetics. 171 (1), 345-357 (2005).</li><li>Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTLs+controlling+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1+strains+from+the+wild+tomato+Solanum+habrochaites+LA1777.">Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777.</a> Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).</li><li>Bao, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+gene+in+Solanum+habrochaites+for+resistance+to+a+race+1+strain+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).</li><li>Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+seedling+resistance+assay+identifies+wild+tomato+lines+that+are+resistant+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).</li><li>Uppalapati, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+on+tomato+seedlings:+phenotypic+and+gene+expression+analyses+of+the+virulence+function+of+coronatine.">Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+tock:+circadian+regulation+of+plant+innate+immunity.">Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator.">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator.</a> Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).</li></ol>

פרוטוקול עבור המבול החיסון עם pstDC3000 או pstT1 אופטימיזציה כדי לזהות עמידות אלה זנים חיידקיים בשתילים עגבניות מתוארת. ישנם מספר פרמטרים קריטיים לקבלת תוצאות מיטביות של התנגדות שתיל, כולל ריכוז חיידקי וריכוז החומרים, אשר נקבעו באמצעות מדעית22. עבור PstDC3000, הצפיפות האו?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60805">High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay</a>. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

פסאודומונס syringae הוא חיידק פתוגניים שלילי גרם מדביק מגוון רחב של מארחי הצמח. חיידקים להיכנס למפעל מארח דרך הסטוטה או פצעים פיזיים מתרבים בתוך האפוסט1. צמחים התפתחו תגובה חיסונית דו שכבתית כדי להגן מפני זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים. הרמה הראשונה מתרחשת במשטח התא של הצמח, שבו קולטני הזיהוי תבניות על קרום התא הצמח תופס מאוד שימור הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרי (PAMPs) בתהליך שנקרא PAMPS-מופעל חסינות (PAMPS)2. במהלך תהליך זה, המפעל המארח upregulates תגובת ההגנה מסלולים, כולל התצהיר של callose לקיר התא, סגירת שיניים, ייצור של מינים חמצן תגובתי, ו אינדוקציה של הגנים הקשורים בפתוגנזה.
חיידקים יכולים להתגבר על PTI על ידי ניצול סוג III הפרשה מערכת כדי לספק חלבונים, הנקראים מפלעריקים, ישירות לתא הצמח3. אפקטור חלבונים בדרך כלל המטרה מרכיבים של PTI ולקדם התקפה אלימה הפתוגן4. הרמה השנייה של חסינות הצמח מתרחשת בתוך תא הצמח על ידי הכרה של חלבונים האפקטור. הכרה זו תלויה גנים התנגדות, אשר לקודד נוקלאוטיד האתר מחייב לוקמיה עשיר לחזור המכיל קולטנים (NLRs). מסוגלים לזהות את העריקים ישירות או לזהות את פעילותם במטרה של התקפה אלימה או דמה5. לאחר מכן הם מפעילים תגובה חיסונית משנית בתהליך שנקרא אפקטור החיסון המופעל (אתי), אשר קשורה לעתים קרובות עם תגובה רגישות יתר (HR), צורה של מוות תאים מקומי באתר של זיהום6. לעומת התנגדות גנטית לגנים הקשורים אתי, הצמחים יכולים להפגין עמידות חלקית כמותית, אשר תלויה בתרומה של גנים מרובים7.
P. syringae pv. עגבניות (Pst) הוא סוכן סיבתי של גרגר חיידקי על עגבניות והוא בעיה חקלאית מתמשך. זנים השולט בשדה יש בדרך כלל מרוץ Pst 0 זנים המבטאים או שניהם מסוג III AvrPto ו AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) הוא גזע נציג 0 זן מודל פתוגן שיכול לגרום לגרגר חיידקי בעגבניה. כדי להילחם במחלת הגרגר החיידקי, המגדלים המאכבו את pto [P. syringae pv. עגבניה]/prf [pto התנגדות ו fenthion רגישות] שאשכול גנים מתוך מינים עגבניות פראי solanum פיפינאליןלזנים מודרניים8,9. הגן pto מקודד את החלבון סרין טראונין קינאז כי, יחד עם prf nlr, מעניקה עמידות ל PstDC3000 דרך ההכרה של העריקים AvrPto ו AvrPtoB10,11,12,13,14. עם זאת, התנגדות זו אינה יעילה נגד גזע המתעוררים 1 זנים, המאפשר התפשטות מהירה ואגרסיבית שלהם בשנים האחרונות15,16. גזע 1 זנים להתחמק הכרה על ידי האשכול pto/prf , כי AvrPto הוא איבד או מוטציה בזנים אלה, ו AvrPtoB מופיע לצבור מינימלית15,17,18.
אוכלוסיות עגבניות בר הם מאגרים חשובים של וריאציה טבעית עבור Pst התנגדות ובעבר שימשו כדי לזהות התנגדות פוטנציאל הרוח19,20,21. עם זאת, מסכי הנוכחי עבור עמידות הפתוגן לנצל 4 – 5-שבוע-צמחים למבוגרים בן20,21. לפיכך, הם מוגבלים בזמן הגדילה, בחלל חדר הצמיחה ובמידות קטנות יחסית. כדי להתמודד עם מגבלות של גישות קונבנציונליות, פיתחנו syringae בקצב גבוה של עגבניות P. שיטת התנגדות באמצעות שתילי עגבניות בן 10 ימים22. גישה זו מציעה מספר יתרונות על-ידי שימוש בצמחי מבוגרים: כלומר, זמן צמיחה קצר יותר, דרישות שטח מופחת ותפוקה גבוהה יותר. יתר על כן, הדגמנו כי גישה זו בנאמנות לכידה התנגדות המחלה פנוטיפים שנצפו בצמחים למבוגרים22.
בתיקון המבול שתיל המתואר בפרוטוקול זה, שתילי עגבניות גדלים על מנות פטרי של מדיה מורראשיג ו Skoog (MS) סטרילי במשך 10 ימים ולאחר מכן מוצפים באינת המכיל את החיידקים של הריבית ואת החומרים. בעקבות ההצפה, השתילים ניתן להעריך ככמת עבור התנגדות למחלות באמצעות assays הגידול חיידקי. בנוסף, שתיל הישרדות או מוות יכול לשמש התנגדות דיסקרטית או פנוטיפ המחלה 7 – 14 ימים לאחר ההצפה. גישה זו מציעה חלופה בתפוקה גבוהה עבור הקרנת מספר גדול של הגשת עגבניות בר עבור התנגדות pst מרוץ 1 זנים, כגון Pst להתאמץ t1 (pstt1), והוא יכול בקלות להיות מותאם לזנים חיידקיים אחרים של עניין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Tape Micropore 1/2&#34; x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm borosilicate glass beads</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock</td>
			<td>GB3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet, class II type A2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>47744-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>500029-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 190 Proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burner Wick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898A / No. W-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burners</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898 / No. BO125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol ACS reagent</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97061-356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97062-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2.2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Beadbeater-96, 115 volt</td>
			<td>Bio Spec Products Inc.</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog, Basal Salts</td>
			<td>Caisson Laboratories, Inc.</td>
			<td>MSP01-50LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-200XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB08-757-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150x15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>1013131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>R-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCO138454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 20 &#956;L 960/10 GPS-L10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 250 &#956;L 960/10 GPS-L250</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR dissecting forceps fine tip, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay

עגבנייה היא יבול חשוב agronomically שיכול להיות נגוע על ידי פסאודומונס syringae, חיידק גראם שלילי, וכתוצאה מכך מחלת הגרגר חיידקי. העגבנייה-P. syringae pv. מערכת העגבניות היא בשימוש נרחב כדי לנתח את הבסיס הגנטי של הצמח תגובות מולדים התנגדות המחלה. בעוד המחלה הצליחה בהצלחה במשך עשרות שנים רבות באמצעות המבוא של pto/Prf האשכול גנים מסולנום פיפינליות לתוך עגבניה מעובד, גזע 1 זנים של P. syringae התפתחו כדי להתגבר על התנגדות הענקת ידי pto/prf האשכול גנים ומתרחשים ברחבי העולם.
מינים עגבניות בר הם מאגרים חשובים של גיוון טבעי בזיהוי הפתוגן, כי הם התפתחו בסביבות מגוונות עם לחצים הפתוגן שונים. במסכים טיפוסיים עבור עמידות למחלות בעגבניות בר, צמחים למבוגרים משמשים, אשר יכול להגביל את מספר הצמחים שניתן לוקרן בשל זמן צמיחה המורחבת שלהם ודרישות שטח גדילה גדול יותר. פיתחנו שיטה למסך 10-יום-שתילי עגבניות של התנגדות, אשר ממזער את הצמיחה הצמח זמן וחלל קאמרית הצמיחה, מאפשר תחלופת מהירה של צמחים, ומאפשר לדגום גדלים גדולים להיבדק. שתילים התוצאות של הישרדות או מוות יכול להיות מטופלים כמו פנוטיפים דיסקרטית או על סולם ההתנגדות המוגדר על ידי כמות הצמיחה החדשה בשתילים ששרדו לאחר ההצפה. שיטה זו כבר ממוטבת למסך 10-יום-שתילי עגבניות התנגדות לשני זני p. syringae והוא יכול בקלות להתאים זנים p syringae אחרים.

זיהוי של החסינות Ptor-תיווך בזנים וקווים איזוגניים באמצעות התנגדות שתיל העמידות איור 5 מציג את התוצאות הייצוגיות עבור Moneymaker-Ptor ו Moneymaker-ptor זנים ars 7 – 10 ימים לאחר ההצפה עם PstDC3000. לפני זיהום, 10 יום-שתילים הציגו במלואו התפתחה פסיגי והמתעוררים עלים אמ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

השטף שתיל המבול מאפשר הקרנה מהירה של הקלה עגבניות בר עבור התנגדות פסבדו החיידק syringae bacterium. מעשה זה, המשמש בשילוב עם השימוש בקביעת הצמיחה החיידקית של הנבט, יכול לסייע עוד יותר באפיון ההתנגדות הבסיסית לחיידק, וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הבסיס לאוכלוסיות מיפוי כדי לברר את היסוד הגנטי של ההתנגדות.

זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

פרוטוקול תפוקה גבוה זה מאפשר סינון מהיר של שתילי עגבניות מגישה פראית למזרק פסאודומונס פתוגן חיידקי. מבדיקה של שיטפון השתילים ממזערת את זמן צמיחת הצמחים ואת צרכי תא הצמיחה, מאפשרת תחלופה מהירה של צמחים ומאפשרת נבדקים גדלי מדגם גדולים. בדיקה זו היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לסנן התנגדות בגישה פראית וקווים אחרים עם רקע גנטי מורכב.הפרוטוקול מספק כיוונים ספציפיים להזרקת שיטפונות של שני זנים מזרק Pseudomonas. עם זאת, הוא רב תכליתי ו ניתן לשנות כדי לזהות עמידות המארח פתוגנים חיידקיים אחרים. הדגימה להליך תהיה יאנה חסן, מומחית מחקר במעבדה שלי.התחל בגידול שתילי העגבניות. מניחים זרעי עגבניות בצינור מיקרוצנטריפוגה 2.2 מיליליטר ומוסיפים שני מיליליטר של 50% פתרון אקונומיקה. רוק הצינור במשך 25 דקות ולאחר מכן להסיר את הפתרון אקונומיקה עם פיפטה.מוסיפים שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד ושוטפים את הזרעים על ידי היפוך הצינור חמש פעמים. שאפו את הנוזל מהצינור, וחזרו על הכביסה ארבע פעמים נוספות. לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד ויוצקים את הזרעים לתוך צלחת פטרי סטרילית.סטריליזציה ממטרים על ידי בוער אותם באתנול ואז להשתמש בהם כדי להעביר חמישה עד שבעה זרעים על צלחת 100 על ידי 25 מיליליטר עם 0.5 XMS בתוספת 0.8 אחוז אגר מדיה. לאטום את הקצוות של הצלחת עם קלטת כירורגית. ודא כי הצלחות מוערמות שטוחות עם הפנים כלפי מעלה.מרביים את הזרעים הסטריליים בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים לפחות כדי לסנכרן נביטה. לאחר שלושה ימים, מכוונים אנכית את הצלחות כך שהשורשים יגדלו לאורך פני השטח של הצלחת וקו הזרעים מכוון אופקית. מעבירים את הזרעים לתא צמיחה שנקבע ל-22 מעלות צלזיוס עם מחזור חושך של 16 שעות, 8 שעות.לגדל את השתילים במשך עשרה ימים בתא, ובנקודה זו הם בדרך כלל יציגו קוטילדונים מגיחים ומורחבים ועלים אמיתיים ראשונים. פס חיידקים טריים על אגר KB מתאים עם קיסם שטוח, סטרילי. עבור PstT1, דגירה הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני השימוש בחיידקים בניסוי השיטפון.כדי להכין את inoculum, באופן בלתי ניתן לחישוב מחדש את החיידקים סטרילי, עשרה מילימולר מגנזיום כלורי לצפיפות אופטית של 0.1. לאחר מכן לבצע שני דיללולים סדרתיים כדי לקבל ריכוז עבודה עם OD600 של 0075. כמו כן להכין אחד עד עשרה דילול של קופולימר פעילי שטח שאינם יוניים במגנזיום כלוריד 10 מילימולאר.מערבולת זה ולהוסיף אותו לחיידקים, מערבולת הצינור לערבב. מעבירים את הצלחות עם השתילים בני עשרת הימים מתא הגדילה לארון האבטחה הביולוגית ומסירים את הקלטת הכירורגית. ואז להעביר שישה מיליליטר של inoculum לכל צלחת.בעדינות לדחוף את השתילים לתוך inoculum עם קצה פיפטה ולהתחיל טיימר במשך שלוש דקות. החזיקו צלחת אחת בכל יד והטו את חזית הצלחת כלפי מטה כדי להטביע את הקוטילדונים ועלי השתילים. סוויש את inoculum מצד לצד חמש עד שבע פעמים, ואז להטות את הצלחות בחזרה כדי לכסות את השורשים עם inoculum.להטות את הצלחות שוב למטה ולחזור על המחזור במשך שלוש דקות בסך הכל. יוצקים את inoculum את הצלחות, להגדיר אותם על משטח שטוח, ויוצקים את כל inoculum שיורית בפעם השנייה. לעטוף מחדש את הצלחות ולמקום אותם בחזרה בתא הצמיחה.Moneymaker-PtoR ו Moneymaker-PtoS זנים הוצפו PSTDC3000 ו פנוטיפים שבעה עד עשרה ימים לאחר הצפה. שתילים Moneymaker-PtoR לשאת את אשכול הגנים PtoPRF היו עמידים PSTDC3000. בעוד כמעט איזוגני Moneymaker-PtoS שתילים, אשר לא יכול לזהות את PSTDC3000 משפיעים AVRPto או AVRPto-B מת במהירות, בתוך שבעה ימים לאחר הצפה.שתילים בני עשרה ימים הוצפו ב- PstT1 ובפנוטיפים לפחות עשרה ימים לאחר ההצפה. זיצויים רגישים היו מתים, היו להם מריסטמים אפים חומים וחסרו צמיחה חדשה. לעומת זאת, שתילים עמידים הציגו רמה גבוהה של צמיחה ירוקה חדשה ושרדו זיהום עם PstT1.בדיקות גידול חיידקים בוצעו כדי לאשר כמותית עמידות PstT1 ו Solanum NeoRici LA1329. היה הבדל של 1.7 ביומן הצמיחה החיידקית בין LA1329 עמידים רגישים הבדל יומן 1.6 בין LA1329 עמיד Moneymaker-PtoS, אשר בקורלציה עם התוצאות פנוטיפיות. בעת ביצוע בדיקה זו, הדברים החשובים ביותר לזכור הם לשים לב לטכניקה aseptic לאורך כל הפרוטוקול ולהבטיח כי כל השתילים על הצלחת מוצפים ביסודיות.הקפד autoclave רקמת צמח נגועים וחיידקים להיפטר מחומרים בהתאם לתקנות המתאימות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...