Name: high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay
Uploaded: 2020-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

メディアボリュームが病気や抵抗の結果に及ぼす影響をテストしてくれたジェイミー・カルマに感謝します。ルイス・ラボのマエル・ボーディン博士とカール・J・シャイバー博士が、原稿に関する建設的なコメントや提案をしてくれたことに感謝します。ルイス研究所における植物免疫に関する研究は、USDA ARS 2030-21000-046-00Dおよび2030-21000-050-00D(JDL)とNSF生物科学局IOS-1557661(JDL)によって支えられていました。

1. バイオセーフティキャビネットの作成と使用
<ol><li>バイオセーフティキャビネットを70%エタノールで拭き取ります。</li>
	<li>サッシを閉じ、バイオセーフティキャビネットの紫外線を15分間点灯します。</li>
	<li>15分後、バイオセーフティキャビネットの紫外線を消します。サッシを持ち上げ、ブロワーを15分間オンにします。</li>
	<li>滅菌されたキャビネットに入れる前に、バイオセーフ?...

<ol>
	<li>Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plant+stomata+in+bacterial+invasion.">Role of plant stomata in bacterial invasion.</a> Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).</li><li>Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+molecular+events+in+PAMP-triggered+immunity.">Early molecular events in PAMP-triggered immunity.</a> Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).</li><li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines.">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li><li>Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins.">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li><li>Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+another+day:+molecular+mechanisms+of+effector-triggered+immunity+elicited+by+type+III+secreted+effector+proteins.">Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).</li><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitive+response-related+death.">Hypersensitive response-related death.</a> Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).</li><li>Boyd, L. A., Ridout, C., O'Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-pathogen+interactions:+disease+resistance+in+modern+agriculture.">Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture.</a> Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).</li><li>Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+in+field+tomatoes.">Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).</li><li>Pedley, K. F., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+Pto-mediated+resistance+to+bacterial+speck+disease+in+tomato.">Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato.</a> Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).</li><li>Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloned+avirulence+gene+AvrPto+induces+disease+resistance+in+tomato+cultivars+containing+the+Pto+resistance+gene.">The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene.</a> Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).</li><li>Martin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map-based+cloning+of+a+protein+kinase+gene+conferring+disease+resistance+in+tomato.">Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato.</a> Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).</li><li>Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+mutants+altered+in+bacterial+disease+resistance+provide+evidence+for+a+new+locus+controlling+pathogen+recognition.">Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition.</a> Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).</li><li>Salmeron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+Prf+is+a+member+of+the+leucine-rich+repeat+class+of+plant+disease+resistance+genes+and+lies+embedded+within+the+Pto+kinase+gene+cluster.">Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.</a> Cell. 86 (1), 123-133 (1996).</li><li>Scofield, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+gene-for-gene+specificity+in+bacterial+speck+disease+of+tomato.">Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato.</a> Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).</li><li>Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+evolutionary+analyses+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+genetically+monomorphic+and+under+strong+selection+to+evade+tomato+immunity.">The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity.</a> PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).</li><li>Almeida, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).</li><li>Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+AvrPtoB+homologs+from+several+Pseudomonas+syringae+pathovars+elicit+Pto-dependent+resistance+and+have+similar+virulence+activities.">Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).</li><li>Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+Pto+pathogen+resistance+gene+within+species+of+wild+tomato+(Lycopersicon).+I.+Functional+analysis+of+Pto+alleles.">Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles.</a> Genetics. 171 (1), 345-357 (2005).</li><li>Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTLs+controlling+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1+strains+from+the+wild+tomato+Solanum+habrochaites+LA1777.">Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777.</a> Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).</li><li>Bao, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+gene+in+Solanum+habrochaites+for+resistance+to+a+race+1+strain+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).</li><li>Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+seedling+resistance+assay+identifies+wild+tomato+lines+that+are+resistant+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).</li><li>Uppalapati, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+on+tomato+seedlings:+phenotypic+and+gene+expression+analyses+of+the+virulence+function+of+coronatine.">Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+tock:+circadian+regulation+of+plant+innate+immunity.">Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator.">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator.</a> Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).</li></ol>

トマト苗のこれらの細菌株に対する耐性を検出するように最適化されたPstDC3000またはPstT1による洪水接種のプロトコルについて説明します。苗の抵抗性アッセイにおいて最適な結果を得るためのいくつかの重要なパラメータがあり、細菌濃度および界面活性剤濃度を含む、経験的に22を決定した。PstDC3000の場合、光学密度は、Pto/Prfクラスタを含む?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60805">High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay</a>. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

シュードモナスシリンゲは、広範囲の植物宿主に感染するグラム陰性病原菌である。細菌は、宿主植物に住み、または、心の傷を通して、アポプラスト1に増殖する。植物は、細菌病原体による感染から保護するために、2層の免疫応答を進化させた。第1レベルは植物細胞表面で起こり、植物細胞膜上のパターン認識受容体はPAMP誘発免疫(PTI)2と呼ばれるプロセスにおいて高度に保存された病原体関連分子パターン(PMP)を知覚する。このプロセスの間に、宿主植物は、細胞壁へのカロキスの沈着、気孔の閉鎖、活性酸素種の産生、および病原性関連遺伝子の誘導を含む防御応答経路を上方制御する。
細菌は、エフェクターと呼ばれるタンパク質を植物細胞3に直接送達するためにIII型分泌システムを利用することによってPTIを克服することができる。エフェクタータンパク質は、一般的にPTIの成分を標的とし、病原体の毒性を促進する 4.植物免疫の第2層は、エフェクタータンパク質の認識時に植物細胞内で発生する。この認識は、受容体(NlRs)を含むヌクレオチド結合部位ロイシンリッチリピートをコードする耐性遺伝子に依存する。NlRは、エフェクターを直接認識するか、毒性目標またはおとり5に対する活性を認識することができる。次いで、エフェクター誘発免疫(ETI)と呼ばれるプロセスにおいて二次免疫応答を引き起こし、これはしばしば過敏応答(HR)に関連する、感染部位における局所細胞死の一種である6。ETIに関連する遺伝子耐性とは対照的に、植物は、複数の遺伝子7の寄与に依存する定量的な部分抵抗性を示すことができる。
P. シリンガエpv.トマト(Pst)はトマトの細菌斑点の因果剤であり、持続的な農業上の問題である。この分野における主な株は、典型的には、タイプIIIエフェクターAvrPtoおよびAvrPtoBのいずれかまたは両方を発現するPstレース0株であった。DC3000(Pst DC3000)は、代表的なレース0株およびトマトに細菌斑点を引き起こす可能性のある病原体のモデルである。細菌斑病と闘うために、ブリーダーはPto[P.シリンガエpv.トマト]/Prf [Pto耐性とフェンチオン感受性]遺伝子クラスターを野生のトマト種ソラナムピンピネリフォリウムから現代の品種8,9に浸透させた。Pto遺伝子は、セリンスレオニンプロテインキナーゼをコードし、Prf NLRと共に、エフェクターAvrPtoおよびAvrPtoB 10、11、12、13、14の認識を介して、PstDC3000に対する耐性を付与する。しかし、この抵抗は、近年15、16で彼らの急速かつ積極的な広がりを可能にする、新興のレース1株に対して効果がありません。レース1株は、Pto/Prfクラスターによる認識を回避し、AvrPtoがこれらの株で失われるか変異し、AvrPtoBは最小15、17、18を蓄積するように見える。
野生のトマト集団は、Pst抵抗のための自然変動の重要な貯水池であり、以前に潜在的な抵抗loci19、20、21を同定するために使用されてきた。しかし、病原体耐性の現在のスクリーンは、4〜5週齢の成虫植物20,21を利用する。したがって、それらは、成長時間、成長室空間、および比較的小さいサンプルサイズによって制限される。従来のアプローチの限界に対処するために、我々は10日齢のトマト苗22を用いて高スループットトマトP.シリンゲ耐性アッセイを開発した。このアプローチは、大人の植物を使用する上で、いくつかの利点を提供します: すなわち、より短い成長時間、スペースの要件を減らし、より高いスループット。さらに、このアプローチが、成体植物22で観察される疾患耐性のフェノタイプを忠実に再現することを実証した。
このプロトコルに記載されている苗の洪水アッセイでは、トマトの苗は10日間無菌ムラシゲとスクーグ(MS)メディアのペトリ皿で栽培され、その後、関心のある細菌と界面活性剤を含む接種物であふれています。洪水の後、苗は細菌増殖アッセイを介して耐病性について定量的に評価することができる。さらに、苗の生存または死は、洪水の7〜14日後に離散性抵抗または疾患表現型として作用することができます。このアプローチは、Pst株T1(Pst T1)などのPstレース1株に対する耐性のために多数の野生トマトの受け入れをスクリーニングするためのハイスループットの代替手段を提供し、関心のある他の細菌株に容易に適応することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Tape Micropore 1/2&#34; x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm borosilicate glass beads</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock</td>
			<td>GB3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet, class II type A2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>47744-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>500029-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 190 Proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burner Wick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898A / No. W-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burners</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898 / No. BO125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol ACS reagent</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97061-356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97062-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2.2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Beadbeater-96, 115 volt</td>
			<td>Bio Spec Products Inc.</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog, Basal Salts</td>
			<td>Caisson Laboratories, Inc.</td>
			<td>MSP01-50LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-200XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB08-757-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150x15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>1013131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>R-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCO138454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 20 &#956;L 960/10 GPS-L10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 250 &#956;L 960/10 GPS-L250</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR dissecting forceps fine tip, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay

トマトは、グラム陰性細菌であるシュードモナスシリンゲに感染し、細菌斑点病を引き起こす可能性のある農事学的に重要な作物です。トマト-P. シリンガエpv.トマトパソシステムは、植物の自然応答と耐病性の遺伝的基盤を解剖するために広く使用されています。ソラナム・ピンピネリフォリウムから栽培トマトへのPto/Prf遺伝子クラスターの導入により、病気は何十年もの間正常に管理されていましたが、P.シリンガエのレース1株はPto/Prf遺伝子クラスターによって与えられた抵抗を克服するために進化し、世界中で発生しています。
野生のトマト種は、異なる病原体の圧力を持つ多様な環境で進化したため、病原体認識における自然の多様性の重要な貯水池です。野生のトマトの耐病性の典型的なスクリーンでは、大人の植物が使用され、成長時間の延長と成長スペースの要件の増加のためにスクリーニングできる植物の数を制限することができます。植物の成長時間と成長室空間を最小限に抑え、植物の急速な回転を可能にし、大きなサンプルサイズをテストできる耐性のために10日齢のトマト苗をスクリーニングする方法を開発しました。生存または死の苗の結果は、離散表現型として、または洪水後に生き残った苗の新たな成長の量によって定義される抵抗スケールで扱うことができる。この方法は、2つのP.シリンガ株に対する耐性のために10日齢のトマト苗をスクリーニングするように最適化されており、他のP.シリンゲ株に容易に適応することができる。

苗抵抗アッセイを用いた品種および等原性ラインにおけるPtoR媒介性免疫の検出 図 5は、PstDC3000 が氾濫した後の Moneymaker-PtoRおよび Moneymaker-PtoSカルティバーの代表的な結果を示しています。感染前に、10日齢の苗木が完全に出現し、拡大されたコチルドンと新興の最初の真の葉。苗は、マイナスコントロール(データは示されてい?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

苗の洪水アッセイは、シュードモナスシリンガエ細菌に対する耐性のための野生のトマトの受診の迅速なスクリーニングを促進する。このアッセイは、苗菌増殖アッセイと組み合わせて使用され、細菌に対する根底にある耐性をさらに特徴付けるのに役立ち、かつ、マッピング集団をスクリーニングして抵抗の遺伝的基礎を決定するために使用することができる。

シュードモナスシリンゲpvに対する耐性のハイスループット同定苗フラッドアッセイを用いたトマトのトマト

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

この高スループットプロトコルは、細菌病原体シュードモナスシリンガエへの野生の受診からトマト苗の迅速なスクリーニングを可能にする。苗の洪水の試しは植物の成長時間および成長の部屋の必要性を最小にし、植物の急速な回転を可能にし、大きいサンプルサイズをテストすることを可能にする。このアッセイは、野生のアクセスや複雑な遺伝的背景を持つ他のラインで抵抗をスクリーニングするために使用することができる強力なツールです。プロトコルは、2つのシュードモナスシリンゲ株の洪水接種のための特定の方向を提供します。しかし、汎用性があり、他の細菌病原体に対する宿主抵抗性を検出するように変更することができます。この手順を実証することは、私の研究室の研究スペシャリストであるヤナ・ハサンです。トマトの苗を育てることから始めます。トマトの種を2.2ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れ、50%漂白液を2ミリリットル加えます。チューブを25分間揺らし、ピペットで漂白剤溶液を取り除きます。2ミリリットルの超純水を加え、チューブを5回反転して種子を洗います。チューブから液体を吸引し、さらに4回洗浄を繰り返す。最後の洗浄の後、2ミリリットルの超純水を加え、種子を無菌ペトリ皿に注ぎます。鉗子をエタノールで焼き付けて殺菌し、5~7種の種子を0.5 XMSプラス0.8%の寒天培地で100×25ミリリットルのプレートに移します。外科テープでプレートの端を密封します。プレートが平らに積み重ねられ、上向きになっていることを確認します。殺菌を同期させるために少なくとも3日間、暗闇の中で4°Cで殺菌された種子を成層させる。3日後、プレートの表面に沿って根が下に伸びるようにプレートを垂直方向に向け、シードの線が水平に向きます。16時間の光、8時間の暗いサイクルで摂氏22度に設定された成長室に種子を移します。チャンバーで10日間苗を栽培し、その時点で彼らは通常、完全に出現し、拡大されたコチルドンと新興の最初の真の葉を表示します。平らな、無菌の爪楊枝を持つ適切なKB寒天に新鮮な細菌をストリーク。PstT1 の場合、洪水実験で細菌を使用する前に、48 時間摂氏 28 度でプレートをインキュベートします。接種を調製するために、無菌で細菌を無菌に再懸濁し、10ミリモル塩化マグネシウムを0.1の光学密度とする。次に、2つの連続希釈液を作り、0075のOD600で作業濃度を得る。また、10ミリモル塩化マグネシウムで非イオン有機シリコーン界面活性剤共重合体の1〜10希釈を調製する。それを渦巻き、細菌にそれを追加し、混合するチューブを渦巻きます。成長室から生安全キャビネットに10日齢の苗とプレートを移し、外科テープを取り外します。その後、各プレートに接種物の6ミリリットルを転送します。ピペットチップで苗を接種器にそっと押し込み、タイマーを3分間開始します。各手に1つのプレートを保持し、苗のコチルドンと葉を水没させるためにプレートの前面を下に傾けます。接種側を5~7回横にスウィッシュし、プレートを戻して根を接種器で覆います。プレートをもう一度傾け、サイクルを合計 3 分間繰り返します。プレートからイノキュラムを注ぎ、平らな表面に置き、残留接種を2度目に注ぎます。プレートを再ラップし、成長室に戻します。マネーメーカーPtoRとマネーメーカー-PtoS品種は、PSTDC3000であふれ、洪水の7〜10日後にフェノタイプされました。マネーメーカー-PtoRの苗はPtoPRF遺伝子クラスターを運び、PSTDC3000に耐性があった。PSTDC3000エフェクターAVRPtoまたはAVRPto-Bを認識できないほぼ等同性のマネーメーカー-PtoS苗は、洪水の7日以内にすぐに死亡した。10日齢の苗木はPstT1であふれ、洪水の少なくとも10日後にフェノタイプされました。受けやすい受け入れの影響を受けやすい受け入れは死んでいて、茶色の尖端のメリステムを持ち、新しい成長を欠いていた。対照的に、耐性苗は、新しい緑色の成長の高レベルを表示し、PstT1で感染を生き残った。細菌増殖アッセイは、PstT1耐性およびソラナムネオリチLA1329を定量的に確認するために実施した。耐性と感受性の高いLA1329との間の細菌増殖の1.7ログの違いがあり、耐性LA1329とMoneymaker-PtoSの間には1.6ログの違いがあり、これはフェロティピックの結果と相関していた。このアッセイを行う際に覚えておくべき最も重要なことは、プロトコル全体で無菌技術に細心の注意を払い、プレート上のすべての苗が完全に浸水していることを確認することです。必ず、植物組織や細菌に感染し、適切な規制に従って材料を処分してください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

ハイスループットの使用<em&gt;インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために&gt;マイクロ流体システム

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

中国ハムスター卵巣細胞培養におけるハイスループット自動マイクロバイオリアクターを用いたプロセス最適化

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...