Name: high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay
Uploaded: 2020-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay at JoVE.com

Agradecemos a Jamie Calma por testar o efeito do volume de mídia sobre os desfechos de doenças ou resistência. Agradecemos ao Dr. Maël Baudin e ao Dr. Karl J. Scheiber do Laboratório Lewis por fornecerem comentários construtivos e sugestões sobre o manuscrito. A pesquisa sobre imunidade vegetal no laboratório de Lewis foi apoiada pelo USDA ARS 2030-21000-046-00D e 2030-21000-050-00D (JDL), e pela Diretoria de Ciências Biológicas iOS-1557661 (JDL).

1. Preparação e uso de armário de biossegurança
<ol><li>Limpe o armário de biossegurança com 70% de etanol.</li>
	<li>Feche a faixa e ligue a luz ultravioleta no armário de biossegurança por 15 min.</li>
	<li>Depois de 15 min, desligue a luz ultravioleta no armário de biossegurança. Levante a faixa e ligue o soprador por 15 min.</li>
	<li>Limpe todos os itens a serem usados no gabinete de biossegurança com 70% de etanol antes de colocar os itens no armário esterilizado.</li>
	<li>Luvas limpas ou mãos nuas ...

<ol>
	<li>Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plant+stomata+in+bacterial+invasion.">Role of plant stomata in bacterial invasion.</a> Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).</li><li>Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+molecular+events+in+PAMP-triggered+immunity.">Early molecular events in PAMP-triggered immunity.</a> Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).</li><li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines.">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li><li>Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins.">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li><li>Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+another+day:+molecular+mechanisms+of+effector-triggered+immunity+elicited+by+type+III+secreted+effector+proteins.">Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).</li><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitive+response-related+death.">Hypersensitive response-related death.</a> Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).</li><li>Boyd, L. A., Ridout, C., O'Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-pathogen+interactions:+disease+resistance+in+modern+agriculture.">Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture.</a> Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).</li><li>Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+of+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+in+field+tomatoes.">Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).</li><li>Pedley, K. F., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+Pto-mediated+resistance+to+bacterial+speck+disease+in+tomato.">Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato.</a> Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).</li><li>Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloned+avirulence+gene+AvrPto+induces+disease+resistance+in+tomato+cultivars+containing+the+Pto+resistance+gene.">The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene.</a> Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).</li><li>Martin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map-based+cloning+of+a+protein+kinase+gene+conferring+disease+resistance+in+tomato.">Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato.</a> Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).</li><li>Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+mutants+altered+in+bacterial+disease+resistance+provide+evidence+for+a+new+locus+controlling+pathogen+recognition.">Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition.</a> Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).</li><li>Salmeron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+Prf+is+a+member+of+the+leucine-rich+repeat+class+of+plant+disease+resistance+genes+and+lies+embedded+within+the+Pto+kinase+gene+cluster.">Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.</a> Cell. 86 (1), 123-133 (1996).</li><li>Scofield, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+gene-for-gene+specificity+in+bacterial+speck+disease+of+tomato.">Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato.</a> Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).</li><li>Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+evolutionary+analyses+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+genetically+monomorphic+and+under+strong+selection+to+evade+tomato+immunity.">The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity.</a> PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).</li><li>Almeida, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).</li><li>Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+AvrPtoB+homologs+from+several+Pseudomonas+syringae+pathovars+elicit+Pto-dependent+resistance+and+have+similar+virulence+activities.">Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).</li><li>Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+Pto+pathogen+resistance+gene+within+species+of+wild+tomato+(Lycopersicon).+I.+Functional+analysis+of+Pto+alleles.">Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles.</a> Genetics. 171 (1), 345-357 (2005).</li><li>Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTLs+controlling+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1+strains+from+the+wild+tomato+Solanum+habrochaites+LA1777.">Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777.</a> Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).</li><li>Bao, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+gene+in+Solanum+habrochaites+for+resistance+to+a+race+1+strain+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).</li><li>Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+seedling+resistance+assay+identifies+wild+tomato+lines+that+are+resistant+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1.">A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).</li><li>Uppalapati, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+on+tomato+seedlings:+phenotypic+and+gene+expression+analyses+of+the+virulence+function+of+coronatine.">Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+tock:+circadian+regulation+of+plant+innate+immunity.">Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator.">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator.</a> Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).</li></ol>

Um protocolo para inoculação de inundação com PstDC3000 ou PstT1 otimizado para detectar resistência a essas cepas bacterianas em mudas de tomate é descrito. Existem vários parâmetros críticos para os resultados ótimos no ensaio de resistência às mudas, incluindo concentração bacteriana e concentração surfactante, que foram empiricamentedeterminados 22. Para o PstDC3000, a densidade óptica foi otimizada para alcançar a sobrevida completa em uma cultivar...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60805">High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay</a>. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Pseudomonas sinringae é uma bactéria patogênica gram-negativa que infecta uma ampla gama de hospedeiros vegetais. As bactérias entram na planta hospedeira através dos estomatos ou feridas físicas e proliferam no apoplast1. As plantas desenvolveram uma resposta imune de duas camadas para proteger contra infecções por patógenos bacterianos. O primeiro nível ocorre na superfície celular da planta, onde receptores de reconhecimento de padrões na membrana celular vegetal percebem padrões moleculares altamente conservados associados ao patógeno (PAMPs) em um processo chamado imunidade desencadeada por PAMP (PTI)2. Durante esse processo, a planta hospedeira regula as vias de resposta à defesa, incluindo deposição de calose na parede celular, fechamento de estomatas, produção de espécies reativas de oxigênio e indução de genes relacionados à patogênese.
As bactérias podem superar o PTI utilizando um sistema de secreção tipo III para fornecer proteínas, chamadas de efeitos, diretamente na célula vegetal3. As proteínas dos efeitos geralmente visam componentes do PTI e promovem a virulência patogênica4. A segunda camada de imunidade vegetal ocorre dentro da célula vegetal após o reconhecimento das proteínas eficazes. Este reconhecimento depende de genes de resistência, que codificam a repetição de nucleotídeos que contém receptores (NLRs). As NLRs são capazes de reconhecer os efeitos diretamente ou reconhecer sua atividade em um alvo de virulência ou isca5. Eles então desencadeiam uma resposta imune secundária em um processo chamado imunidade desencadeada por efeitos (ETI), que é frequentemente associada a uma resposta hipersensível (HR), uma forma de morte celular localizada no local da infecção6. Em contraste com a resistência gene-for-gene associada ao ETI, as plantas podem apresentar resistência parcial quantitativa, que depende da contribuição de múltiplos genes7.
P. sinringae pv. tomate (Pst) é o agente causal da mancha bacteriana no tomate e é um problema agrícola persistente. As cepas predominantes no campo têm sido tipicamente cepas de raça Pst 0 que expressam ambos os efeitos tipo III AvrPto e AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) é uma cepa representativa de raça 0 e um modelo de patógeno que pode causar manchas bacterianas no tomate. Para combater a doença das manchas bacterianas, os criadores introgressaram o pto [P. singae pv. tomate]/ Prf [Pto resistência e sensibilidade à fenthion] aglomerado da espécie de tomate selvagem Solanum pimpinellifolium em cultivares modernas8,9. O gene Pto codifica uma quinase de proteína serina-threonine que, juntamente com o PRF NLR, confere resistência ao PstDC3000 através do reconhecimento dos efetuantes AvrPto e AvrPtoB10,11,12,13,14. No entanto, essa resistência é ineficaz contra cepas emergentes da raça 1, permitindo sua rápida e agressiva propagação nos últimos anos15,16. As cepas da raça 1 evitam o reconhecimento pelo cluster Pto/PRF, porque a AvrPto está perdida ou mutada nessas cepas, e a AvrPtoB parece acumular minimamente15,17,18.
As populações de tomate silvestre são importantes reservatórios de variação natural para a resistência pst e já foram utilizadas anteriormente para identificar potenciais loci de resistência19,20,21. No entanto, as telas atuais para resistência ao patógeno utilizam plantas adultas de 4 a 5 semanas de idade20,21. Portanto, eles são limitados pelo tempo de crescimento, espaço da câmara de crescimento e tamanhos amostrais relativamente pequenos. Para abordar as limitações das abordagens convencionais, desenvolvemos um ensaio de resistência ao tomate de alto throughput P. sinringae utilizando mudas de tomate de 10 dias de idade22. Esta abordagem oferece várias vantagens sobre o uso de plantas adultas: ou seja, menor tempo de crescimento, requisitos de espaço reduzidos e maior rendimento. Além disso, demonstramos que essa abordagem recapitula fielmente os fenótipos de resistência à doença observados em plantas adultas22.
No ensaio de inundação de mudas descrito neste protocolo, as mudas de tomate são cultivadas em placas de Petri de mídia estéril murashige e skoog (MS) por 10 dias e, em seguida, são inundadas com um inóculo contendo as bactérias de interesse e um surfactante. Após inundações, as mudas podem ser avaliadas quantitativamente para resistência à doença através de ensaios de crescimento bacteriano. Além disso, a sobrevivência ou morte das mudas pode atuar como uma resistência discreta ou fenótipo da doença 7-14 dias após a inundação. Esta abordagem oferece uma alternativa de alto rendimento para a triagem de um grande número de adesões de tomate selvagem para resistência às cepas de raça 1 do Pst, como a cepa Pst T1 (PstT1), e pode ser facilmente adaptada a outras cepas bacterianas de interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Tape Micropore 1/2&#34; x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>56222-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm borosilicate glass beads</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock</td>
			<td>GB3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet, class II type A2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>47744-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>500029-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 190 Proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burner Wick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898A / No. W-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Alcohol Burners</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S41898 / No. BO125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol ACS reagent</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark&#8482; Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97061-356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97062-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2.2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Beadbeater-96, 115 volt</td>
			<td>Bio Spec Products Inc.</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog, Basal Salts</td>
			<td>Caisson Laboratories, Inc.</td>
			<td>MSP01-50LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-200XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB08-757-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 150x15mm sterile petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>1013131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>R-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NCO138454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 20 &#956;L 960/10 GPS-L10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips LTS 250 &#956;L 960/10 GPS-L250</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR dissecting forceps fine tip, 4.5&#34;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of resistance to pseudomonas syringae pv. tomato in tomato using seedling flood assay

O tomate é uma cultura agronômica importante que pode ser infectada pela Pseudomonas singae, uma bactéria Gram-negativa, resultando em doenças bacterianas. Otomate-P. sinringae pv. o patosistema de tomate é amplamente utilizado para dissecar a base genética das respostas inatas da planta e da resistência à doença. Embora a doença tenha sido gerida com sucesso por muitas décadas através da introdução do aglomerado genético Pto/PRF de Solanum pimpinellifolium em tomate cultivado, as cepas de raça 1 de P. sinringae evoluíram para superar a resistência conferida pelo grupo genético Pto/PRF e ocorrem em todo o mundo.
As espécies de tomate silvestre são importantes reservatórios de diversidade natural no reconhecimento de patógenos, pois evoluíram em diversos ambientes com diferentes pressões patogênicas. Em telas típicas para resistência a doenças no tomate selvagem, plantas adultas são usadas, o que pode limitar o número de plantas que podem ser rastreadas devido ao seu tempo de crescimento prolongado e maiores exigências de espaço de crescimento. Desenvolvemos um método para testar mudas de tomate de 10 dias de idade para resistência, o que minimiza o tempo de crescimento das plantas e o espaço da câmara de crescimento, permite uma rápida rotatividade de plantas e permite que grandes tamanhos de amostra sejam testados. Os desfechos de sobrevivência ou morte das mudas podem ser tratados como fenótipos discretos ou em uma escala de resistência definida pela quantidade de novo crescimento nas mudas sobreviventes após inundações. Este método foi otimizado para tela de mudas de tomate de 10 dias de idade para resistência a duas cepas p. sinringae e pode ser facilmente adaptado a outras cepas p. syringae.

Detecção de imunidade mediada por PTORem cultivares e linhas isogênicas usando o ensaio de resistência a mudas A Figura 5 mostra resultados representativos para as cultivares Moneymaker-PtoR e Moneymaker-PtoS 7-10 dias após a inundação com o PstDC3000. Antes da infecção, as mudas de 10 dias de idade exibiam cotyledons totalmente emergidos e expandidos e emergentes primeiras folhas verdadeiras. As mudas foram alagadas com 10 mM ...

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High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

O ensaio de inundação de mudas facilita a rápida triagem das adesões de tomate selvagem para a resistência à bactéria Pseudomonas seringae. Este ensaio, usado em conjunto com o ensaio de crescimento bacteriano de mudas, pode auxiliar na caracterização da resistência subjacente à bactéria, e pode ser usado para mapear populações para determinar a base genética da resistência.

Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Este protocolo de alto rendimento permite a triagem rápida de mudas de tomate desde adesões selvagens ao patógeno bacteriano Pseudomonas seringae. O ensaio de inundação de mudas minimiza o tempo de crescimento das plantas e as necessidades da câmara de crescimento, permite uma rápida rotatividade das plantas e permite que grandes tamanhos de amostra sejam testados. Este ensaio é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para testar resistência em adesões selvagens e outras linhas com formações genéticas complexas.O protocolo fornece instruções específicas para a innoculação de inundação de duas cepas de seringa Pseudomonas. No entanto, é versátil e pode ser modificado para detectar resistência do hospedeiro a outros patógenos bacterianos. Demonstrando o procedimento será Yana Hasan, especialista em pesquisa no meu laboratório.Comece cultivando as mudas de tomate. Coloque as sementes de tomate em um tubo de microcentrífuga de 2,2 mililitros e adicione dois mililitros de solução de alvejante de 50%. Balance o tubo por 25 minutos e remova a solução de alvejante com uma pipeta.Adicione dois mililitros de água ultra pura e lave as sementes invertendo o tubo cinco vezes. Aspire o líquido do tubo e repita a lavagem mais quatro vezes. Após a lavagem final, adicione dois mililitros de água ultra-pura e despeje as sementes em uma placa de Petri estéril.Esterilizar fórceps batendo-os em etanol e depois usá-los para transferir cinco a sete sementes para uma placa de 100 por 25 mililitros com 0,5 XMS mais 0,8% de mídia ágar. Sele as bordas da placa com fita cirúrgica. Certifique-se de que as placas estão empilhadas e de frente para cima.Estratifique as sementes esterilizadas a quatro graus Celsius no escuro por pelo menos três dias para sincronizar a germinação. Após três dias, oriente verticalmente as placas para que as raízes cresçam ao longo da superfície da placa e a linha de sementes seja orientada horizontalmente. Transfira as sementes para uma câmara de crescimento a 22 graus Celsius com um ciclo escuro de 16 horas e 8 horas.Cresça as mudas por dez dias na câmara, momento em que elas normalmente exibirão totalmente emergidas e cotilledons expandidos e primeiras folhas verdadeiras emergentes. Listrar bactérias frescas em ágar KB apropriado com um palito de dente plano e estéril. Para PstT1, incubar a placa a 28 graus Celsius durante 48 horas antes de usar as bactérias no experimento de inundação.Para preparar o inóculo, resususpense as bactérias em cloreto de magnésio estéril e dez milimônios a uma densidade óptica de 0,1. Em seguida, faça duas diluições seriais para obter uma concentração de trabalho com um OD600 de 0075. Também prepare uma diluição de um a dez copolímero surfactante organosilicone não iônico em dez cloreto de magnésio milililar.Vórtice e adicione-o às bactérias, girando o tubo para misturar. Transfira as placas com as mudas de dez dias de idade da câmara de crescimento para o armário de biossegurança e remova a fita cirúrgica. Em seguida, transfira seis mililitros de inóculo para cada placa.Empurre suavemente as mudas para o inóculo com uma ponta de pipeta e inicie um temporizador por três minutos. Segure uma placa em cada mão e incline a frente da placa para baixo para submergir os cotilledons e folhas das mudas. Swish o inóculo lado a lado cinco a sete vezes, em seguida, ponta as placas de volta para cobrir as raízes com o inóculo.Incline as placas para baixo novamente e repita o ciclo por um total de três minutos. Despeje o inóculo das placas, coloque-os em uma superfície plana e despeje qualquer inóculo residual pela segunda vez. Enrole as placas e coloque-as de volta na câmara de crescimento.As cultivares Moneymaker-PtoR e Moneymaker-PtoS foram inundadas com PSTDC3000 e fenotítipadas de sete a dez dias após inundações. As mudas moneymaker-PtoR carregam o aglomerado genético PtoPRF e foram resistentes ao PSTDC3000. Enquanto as mudas de Moneymaker-PtoS quase isogênicas, que não podem reconhecer os efeitos PSTDC3000 AVRPto ou AVRPto-B, morreram rapidamente, dentro de sete dias após inundações.Mudas de dez dias foram inundadas com PstT1 e fenotítipadas pelo menos dez dias após inundações. Adesões suscetíveis estavam mortas, tinham meristems atópicos marrons e não tinham novo crescimento. Em contraste, as mudas resistentes apresentaram um alto nível de crescimento verde e sobreviveram à infecção com PstT1.Ensaios de crescimento bacteriano foram realizados para confirmar quantitativamente a resistência ao PstT1 e ao Solanum NeoRici LA1329. Houve uma diferença de 1,7 log no crescimento bacteriano entre la1329 resistente e suscetível e uma diferença de 1,6 log entre la1329 resistente e Moneymaker-PtoS, que se correlacionava com os resultados fenotípicos. Ao realizar este ensaio, as coisas mais importantes a se lembrar são prestar muita atenção à técnica asséptica em todo o protocolo e garantir que todas as mudas na placa estejam completamente inundadas.Certifique-se de autoclave tecido vegetal infectado e bactérias e descarte de materiais de acordo com as normas apropriadas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Baseados em células de Ensaio de cálcio para Médio a High Throughput Screening de Funções TRP usando FlexStation Canal 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Bioengenharia

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

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Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

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Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Fenotipagem de tensão de levedura de alta produtividade com sequenciamento de RNA baseado em gotículas

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...