Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
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成像和分析指导由研究资源中心提供——芝加哥伊利诺伊大学研究组织学和组织成像核心，该中心由研究副校长办公室提供支持。这项工作得到了NIH/NCI RO1CA191317对中电的支持，国家卫生研究院/NIAMS（SBDRC向A.Paller博士授予1P30AR075049-01），以及罗伯特·卢里综合癌症中心对西北大学免疫治疗评估核心的支持。

小鼠脾脏和HLF16小鼠肿瘤组织23是从我们的实验室获得的。人扁桃体组织是从一家商业供应商那里购买的。详情载于资料表。
1. 组织嵌入
<ol><li>将新鲜组织嵌入 OCT（最佳切割温度）溶液中，并使用干冰或液氮进行卡扣冻结。</li>
	<li>将组织储存在-80°C。</li>
</ol>2. 冷冻切除
<ol><li>在低温器中切割 8 μm 部分，温度设定为 -25 °C?...

冷冻组织已广泛用于mIF成像，传统上使用直接和间接方法32检测组织上的3到4个标记31。在直接方法中，抗体与荧光染料或量子点33结合以标记组织，而在间接方法中，非结合原抗体用于标记组织，然后由专门识别原抗体的氟磷结合二次抗体标记。前面讨论的一些最近同时使用的多路复用染色方法也可用于染色冷冻组织和检测四个以上的标记。?...

最近显微成像技术的进步大大增进了我们对生物过程和疾病状态的了解和理解。通过致色免疫组织化学（IHC）对组织中的蛋白质进行原位检测，在病理学中进行。然而，使用色谱IHC染色检测多个标记是具有挑战性的1，使用多路免疫荧光（mIF）染色方法的较新的方法，其中多个生物标记标记在单个组织样本上，正在开发中。多个生物标记的检测是有用的，因为有关组织结构、细胞空间分布和抗原共表达的信息都捕获在单个组织样本2中。多光谱荧光成像技术的使用使得检测多种生物标记成为可能。在这项技术中，使用特定的光学元件可以分离或"不混合"每个荧光波的荧光光谱，从而在没有任何光谱串扰3的情况下检测多个标记。多光谱荧光成像正在成为细胞生物学、临床前药物开发、临床病理学和肿瘤免疫功能44、5、65,6的关键方法。重要的是，免疫细胞（特别是CD8 T细胞）的分量可以作为现有肿瘤患者的预后因子7。
已经开发了多种荧光染色的各种方法，可以同时或按顺序执行。在同时染色的方法中，所有抗体在一个步骤中作为鸡尾酒一起加入，以标记组织。UltraPlex 技术使用触觉结合的初级抗体的鸡尾酒，然后采用氟磷结合抗触觉二次抗体的鸡尾酒。InSituPlex 技术8使用独特的 DNA 结合原抗体的混合物，这些抗体同时添加到组织中，然后进行放大步骤，最后是荧光结合探，这些探针与原抗体上每个独特的 DNA 序列相辅相成。这两种技术都能够检测四个标记和4'，6-2-苯胺烯酰胺（DAPI）的核染色。同时进行多路复用染色的另外两种方法是基于二次肌体质谱9。Hyperion 成像系统使用成像质量细胞学10来检测多达 37 个标记。该技术使用金属结合抗体的混合物来染色组织，组织的特定区域被激光清除，并转移到检测到金属离子的量量细胞计中。另一个类似的技术是IONPath，它使用多路复用的ion光束成像技术11。该技术使用经过改进的质谱仪和氧心源代替激光来清除金属偶联抗体。虽然所有这些同时多重染色方法能够检测多个标记，但无法低估将DNA、触觉或金属结合到抗体中所涉及的成本、消融造成的组织损失以及大量用于解混合的图像处理。此外，套件和染色协议目前仅适用于 FFPE 组织，开发定制面板需要额外的时间和支出。
相反，顺序多路复用染色方法包括将带有抗体的组织标记到一个标记，剥离以去除抗体，然后连续重复此过程以标记多个标记12。酪氨酸信号放大 （TSA） 是最常用的顺序多路复用方法。另外两种复用技术采用同时和顺序染色方法的组合。CODEX 平台13采用与独特的 DNA 寡核苷酸序列结合的抗体鸡尾酒，最终使用指数聚合步骤标记荧光磷，然后成像、剥离和重复这一过程，以检测多达 50 个标记。MultiOmyx 多路复用染色方法14是染色的迭代，其混合物由 3 到 4 个荧光素偶联抗体、成像、淬火荧光波和重复此循环来检测单个部分多达 60 个标记。与同时多重染色方法类似，虽然可以检测出广泛的标记，但染色、图像采集、处理和分析的时间也很大。剥离/淬火步骤涉及加热和/或漂白组织样本，因此，顺序多路复用染色方法通常对 FFPE 组织执行，在加热或漂白时保持组织完整性。
正式固定和随后的石蜡嵌入很容易在临床环境中进行，组织块易于存储，并提供多种多路染色方案。然而，FFPE组织的处理、嵌入和去压化，以及抗原检索15，抗体可以更好地获得表皮的过程，是费时的。此外，FFPE组织中的处理有助于自荧光16和口罩目标表皮，导致变异和缺乏抗体克隆可用于检测FFPE组织17，18，19的抗原。17,18,19一个例子是人类白细胞抗原（HLA）类I等位基因20。相反，组织的快速冻结不涉及修复前后的广泛处理步骤，无需对抗原检索21、22,22进行检测，有利于检测更广泛的靶点。因此，使用冷冻组织进行多光谱荧光成像对于检测临床前和临床研究的目标很有价值。
鉴于上述使用FFPE组织的限制，我们询问是否可以对冷冻组织进行多光谱荧光成像。为了解决这个问题，我们测试了一种同时使用荧光素结合抗体面板的多路复用染色方法，以检测多种抗原，并使用半自动多光谱成像系统对染色进行了分析。我们能够在90分钟内同时在单个组织部分中染色多达六个标记。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

在正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 组织中进行多光谱荧光成像，能够检测单个组织样本中的多个标记，从而提供有关标记的抗原共表达和空间分布的信息。然而，缺乏适合正式固定组织的抗体可能会限制可检测到的标记的性质。此外，染色方法非常耗时。在这里，我们描述了一种在冷冻组织中执行多光谱荧光成像的快速方法。该方法包括所使用的荧光波组合、小鼠和人类冷冻组织染色的详细步骤，以及扫描、采集和分析程序。对于染色分析，使用了商用半自动多光谱荧光成像系统。通过这种方法，在单个冷冻组织部分中，多达六个不同的标记被染色和检测。机器学习分析软件可以表型细胞，可用于定量分析。此处描述的冷冻组织方法可用于检测在 FFPE 组织中无法检测到的标记或 FFPE 组织不能针对的抗体。

检测冷冻脾脏部分的单染色标记 由于半自动成像系统使用液晶可调滤波器（LCTF）系统，允许更广泛的波长检测25，并且由于这里没有执行信号放大步骤，我们首先优化了显微镜上每个标记的初级结合抗体的检测。如图 1所示，其中每个单染色标记均为伪彩色红色。此处使用的Alexa Fluor偶联抗体已通过公司验证为免疫荧光和流细胞测定。但是，...

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A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

我们描述了一种快速染色方法，用于对冷冻组织进行多光谱成像。

冷冻组织部分多光谱荧光成像的快速方法

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

此方法有助于检测和共同本地化单个低温中的多个生物标志物，包括石蜡部分通常无法检测到的标记。使用这种实验染色方法，染色时间显著缩短，可以在任何实验室中执行该方法。演示此方法将是迪内什· 贾尚卡尔。他是实验室的熟练博士后，也是免疫治疗评估核心，设施经理。在选择用于分析的抗体时，请考虑半自动成像系统上可用的激发和发射滤波器集。在测试各种氟磷结合原抗体组合后，准备使用荧光团，以便您具有表中所示的最小光谱重叠。对于多路复用染色，在预定的最佳错觉下准备含有相容荧光的抗体鸡尾酒，并将鸡尾酒添加到感兴趣的组织部分。对于单标记染色，仅将原联偶抗体添加到幻灯片中。对于所有染色，包括一个控制无污染的幻灯片，经过相同的染色过程，而无需添加原联偶抗体。在室温下孵育一小时后，用PBS清洗幻灯片两次，每次洗涤五分钟。第二次洗涤后，用DAPI将多路复用染色的幻灯片在室温下用DAPI进行7分钟的反染色，然后用PBS进行两次5分钟的洗涤。要创建光谱库，请将多光谱成像系统的灯功率设置为 100%，并打开显微镜操作软件。选择编辑协议和新协议。输入协议名称，并在成像模式下选择荧光。然后提供一个研究名称，并加载单个彩色幻灯片到舞台上。单击"编辑曝光"，并使用自动对焦和自动曝光选项调整曝光时间并获取单个彩色幻灯片的快照。成像单个彩色幻灯片后，保存协议。在"构建库"选项卡下的机器学习软件中，加载每个彩色图像。选择适当的楼层并单击"提取"。该软件将自动提取在地板上选择的荧光信号。若要保存提取的颜色，请单击"保存以存储"。可以创建一个新组，也可以将提取的颜色存储到现有组。对于多光谱成像，创建和验证光谱库后，如演示的，调整多路复用彩色幻灯片上的焦点和曝光时间，并打开扫描的幻灯片以创建新任务。提供幻灯片 ID 并选择协议。在"任务"下，选择整个幻灯片扫描，以在多路复用彩色幻灯片上执行整个幻灯片扫描。在整个幻灯片扫描图像中，选择整个图像中感兴趣的区域。这些区域将使用多路复用幻灯片上先前设置的曝光时间进行扫描，用于频谱解混和分析。在显微镜操作软件中，选择获取任务中的 MSI 字段，然后单击"过程幻灯片"以 20 倍的放大倍率获取感兴趣的区域。获取感兴趣区域后，在机器学习软件中，单击手动分析选项卡下的"文件"和"打开"以加载多路复用彩色图像。选择光谱库源，然后单击"选择楼层"以选择以前保存的光谱库。单击"文件"和"打开"可加载未污染的图像。然后单击自动荧光油墨标记图标，并在未污染的幻灯片上绘制一条线或区域，以识别组织内的自动荧光。然后在"编辑标记和颜色"选项卡下，为每个标记分配名称，然后单击"全部准备"。在验证光谱上未混合的图像后，在机器学习软件中，从面板中选择细胞质膜和标记选项。并使用省略号按钮，选择使用此信号查找，以配置标记来检测核、细胞质或膜。当选择细胞质或膜标记时，选择"使用信号"以帮助进行核分裂选项。该软件将自动检测和创建细胞核、细胞质和膜的单个掩码。使用特定标记的病理视图和软件中的配置选项调整蒙版，然后单击"全部分段"以创建细胞分段图。细胞分割后，选择标记以表型正细胞。此外，选择至少五个未沾染所选标记的细胞来表型负细胞。然后单击"训练分类器"以训练软件，以自动检测图像中沾染所选标记的所有单元格。将创建表型贴图。正如这些图像显示的，用于流式细胞学验证的抗体可用于使用半自动成像系统中的液晶可调滤波器来可视化组织染色。在这里，可以观察到冷冻人类扁桃体的光谱未混合图像，包括卵泡胚芽中心内的B细胞和增殖细胞的标签，以及卵泡T细胞间区域。病理视图选项允许可视化感兴趣的组织内每个标记的单个染色模式，表明多路复用染色方法和光谱成像工作在冷冻组织。如冷冻小鼠肿瘤部分所证明，多光谱成像也可用于可视化肿瘤渗透T细胞，以及其他骨髓细胞谱系，包括肿瘤相关巨噬细胞。可以生成细胞分割和表型图，以及软件分析的每个标记的染色细胞数量，表明该软件可用于定量冷冻组织上的多光谱染色。对于新到该技术的人，了解氟化物的具体特征，并准备高质量的库幻灯片，以便以最小的光谱重叠进行光谱解混合，这一点非常重要。执行抗体滴定也很重要。我们认为，这种方法可以提供有关免疫治疗对癌症和其他治疗应用的疗效的床边信息，特别是当时机至关重要时。

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