Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
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Des conseils en imagerie et en analyse ont été fournis par le Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core de l’Université de l’Illinois à Chicago, établi avec le soutien du bureau du vice-chancelier de la recherche. Les travaux ont été soutenus par NIH/NCI RO1CA191317 à CLP, par NIH/NIAMS (subvention du CRST 1P30AR075049-01) au Dr A. Paller, et par le soutien du Centre complet du cancer Robert H. Lurie au centre d’évaluation de l’immunothérapie de l’Université Northwestern.

La rate de souris et les tissus de tumeur de souris de HLF1623 ont été obtenus de notre laboratoire. Des tissus d’amygdale humaine ont été achetés auprès d’un vendeur commercial. Les détails sont fournis dans la Table des Matériaux.
1. Embedding tissu
<ol><li>Intégrer le tissu frais dans la solution OCT (température de coupe optimale) et geler les cheveux à l’aide de glace sèche ou d’azote liquide.</li>
	<li>Conserver les tissus à...

Les tissus congelés ont été largement utilisés pour l’imagerie mIF pour détecter traditionnellement trois à quatre marqueurs31 sur un tissu en utilisant la méthode directe et indirecte32. Dans la méthode directe, les anticorps sont conjugués aux colorants fluoréscing ou points quantiques33 pour étiqueter le tissu, tandis que dans la méthode indirecte, un anticorps primaire non judiciaire est utilisé pour étiqueter le tissu suivi d’u...

Les progrès récents dans les techniques d’imagerie microscopique ont considérablement amélioré nos connaissances et notre compréhension des processus biologiques et des états pathologiques. La détection in situ des protéines dans les tissus par immunohistochimie chromogénique (IHC) est régulièrement effectuée en pathologie. Cependant, la détection de marqueurs multiples utilisant la coloration chromogénique de LHC est difficile1 et de nouvelles méthodes pour employer des approches de coloration d’immunofluorescence multiplex (mIF), où plusieurs marqueurs biologiques sont étiquetés sur un seul échantillon de tissu, sont en cours de développement. La détection de marqueurs biologiques multiples est utile, parce que les informations liées à l’architecture des tissus, la distribution spatiale des cellules, et la co-expression des antigènes sont tous capturés dans un seul échantillon de tissu2. L’utilisation de la technologie d’imagerie par fluorescence multispectrale a rendu possible la détection de plusieurs marqueurs biologiques. Dans cette technologie, en utilisant des optiques spécifiques les spectres de fluorescence de chaque fluorophore individuel peuvent être séparés ou «non mélangés», permettant la détection de marqueurs multiples sans aucune traque spectrale3. L’imagerie multispectrielle de fluorescence devient une approche critique dans la biologie cellulaire, le développement préclinique de drogue, la pathologie clinique, et le profilage immunitaire de tumeur4,,5,6. Fait important, la distribution spaciale des cellules immunitaires (en particulier les lymphocytes T CD8) peut servir de facteur pronostique pour les patients atteints de tumeurs existantes7.
Diverses approches de coloration de fluorescence multiplex ont été développées et peuvent être effectuées simultanément ou séquentiellement. Dans la méthode de coloration simultanée, tous les anticorps sont ajoutés ensemble comme un cocktail en une seule étape pour étiqueter le tissu. La technologie UltraPlex utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’hapten, suivi d’un cocktail d’anticorps secondaires anti-hapten conjugués au fluorophore. InSituPlex technology8 utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’ADN uniques qui sont simultanément ajoutés au tissu suivis d’une étape d’amplification et enfin de sondes épurées au fluorophore qui sont complémentaires à chaque séquence d’ADN unique sur l’anticorps primaire. Ces deux technologies permettent la détection de quatre marqueurs plus 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Deux autres approches pour la coloration simultanée de multiplex sont basées sur la spectrométrie secondaire de masse d’ion9. Le système d’imagerie Hyperion utilise la cytométrie de massed’imagerie 10 pour détecter jusqu’à 37 marqueurs. Cette technologie utilise un cocktail d’anticorps conjugués au métal pour tacher les tissus, et des zones spécifiques des tissus sont ablés par un laser et transférées à un cytomètre de masse où les ions métalliques sont détectés. Une autre technologie similaire est l’IONPath, qui utilise la technologie d’imagerie à faisceau d’ions multiplexed11. Cette technologie utilise un instrument de spectrométrie de masse modifié et une source d’ions d’oxygène au lieu d’un laser pour abler les anticorps conjugués au métal. Bien que toutes ces approches simultanées de coloration multiplexe permettent la détection de marqueurs multiples, les coûts impliqués pour conjuguer l’ADN, les haptens ou les métaux aux anticorps, la perte de tissu due à l’ablation, et le traitement d’image étendu pour le semage ne peut pas être sous-estimé. En outre, les kits et les protocoles de coloration ne sont actuellement disponibles que pour les tissus FFPE et le développement de panneaux personnalisés implique plus de temps et de dépenses.
La méthode séquentielle de coloration multiplex, en revanche, comprend l’étiquetage du tissu avec un anticorps à un marqueur, le décapage pour enlever l’anticorps, suivi par des répétitions séquentielles de ce processus pour étiqueter plusieurs marqueurs12. L’amplification du signal de tyramide (TSA) est la méthode de multiplexe séquentielle la plus fréquemment utilisée. Deux autres technologies de multiplexage utilisent une combinaison de méthodes de coloration simultanées et séquentielles. La plate-forme CODEX13 utilise un cocktail d’anticorps conjugués à des séquences uniques d’oligonucléotide d’ADN qui sont finalement étiquetés avec un fluorophore à l’aide d’une étape de polymérisation indexée suivie de l’imagerie, le décapage et la répétition du processus pour détecter jusqu’à 50 marqueurs. L’approche de coloration multiplexe MultiOmyx14 est une itération de colorant avec un cocktail de trois à quatre anticorps fluorophore-conjugués, imagerie, étanchéité des fluorophores, et répétant ce cycle pour détecter jusqu’à 60 marqueurs sur une seule section. Semblable à la méthode simultanée de coloration multiplex, tandis qu’un large éventail de marqueurs peuvent être détectés, le temps impliqué dans la coloration, l’acquisition d’image, le traitement, et l’analyse est étendu. L’étape de décapage/étanchéité consiste à chauffer et/ou à blanchir l’échantillon de tissu et, par conséquent, l’approche séquentielle de coloration multiplexe est couramment pratiquée sur les tissus ffPE qui maintiennent l’intégrité des tissus lors du chauffage ou du blanchiment.
La fixation de formaline et l’intégration subséquente de paraffine sont facilement exécutées dans un arrangement clinique, les blocs de tissu sont faciles à stocker, et plusieurs protocoles de coloration de multiplexe sont disponibles. Cependant, le traitement, l’intégration et la deparaffinisation des tissus FFPE, ainsi que la récupération d’antigène15, un processus par lequel les anticorps peuvent mieux accéder aux épitopes, prend beaucoup de temps. En outre, le traitement impliqué dans les tissus FFPE contribue à l’autofluorescence16 et les masques ciblent les épitopes, résultant en la variabilité et le manque de clone d’anticorps disponibles pour détecter les antigènes dans les tissus FFPE17,18,19. Un exemple est l’antigène leucocyte humain (HLA) classe I allèles20. En revanche, la congélation rapide des tissus n’implique pas d’étapes de traitement étendues avant ou après la fixation, contournant le besoin de récupération d’antigène21,22, et le rendant bénéfique pour détecter un plus large éventail de cibles. Par conséquent, l’utilisation de tissus congelés pour l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être utile pour détecter des cibles pour des études précliniques et cliniques.
Étant donné les limites mentionnées ci-dessus lors de l’utilisation des tissus FFPE, nous avons demandé si l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être effectuée sur les tissus congelés. Pour répondre à cette question, nous avons testé une méthode simultanée de coloration multiplexe à l’aide d’un panel d’anticorps fluorophore-conjugués pour détecter de multiples antigènes et analysé la coloration à l’aide d’un système d’imagerie multispectral semi-automatique. Nous avons pu tacher simultanément jusqu’à six marqueurs dans une seule section tissulaire dans un rayon de 90 min.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

L’imagerie multispectrale de fluorescence sur les tissus formalin-fixes de paraffine-embedded (FFPE) permet la détection de marqueurs multiples dans un seul échantillon de tissu qui peut fournir des informations sur la coexpression d’antigène et la distribution spatiale des marqueurs. Cependant, un manque d’anticorps appropriés pour les tissus formalin-fixes peut restreindre la nature des marqueurs qui peuvent être détectés. En outre, la méthode de coloration prend beaucoup de temps. Ici, nous décrivons une méthode rapide pour effectuer la formation image de fluorescence multispectrale sur les tissus congelés. La méthode comprend les combinaisons de fluorophore utilisées, des étapes détaillées pour la coloration des tissus congelés de souris et humains, et les procédures de numérisation, d’acquisition et d’analyse. Pour l’analyse des colorants, un système d’imagerie multispectral de fluorescence semi-automatique disponible dans le commerce est utilisé. Grâce à cette méthode, jusqu’à six marqueurs différents ont été tachés et détectés dans une seule section de tissu congelé. Le logiciel d’analyse de l’apprentissage automatique peut cellules phénotype qui peuvent être utilisés pour l’analyse quantitative. La méthode décrite ici pour les tissus congelés est utile pour la détection de marqueurs qui ne peuvent pas être détectés dans les tissus de la FFPE ou pour lesquels les anticorps ne sont pas disponibles pour les tissus FFPE.

Détection de marqueurs à une seule téale sur des sections de rate congelées Comme le système d’imagerie semi-automatique utilise un système de filtre à thon en cristal liquide (LCTF) qui permet une plus large gamme de détection de longueur d’onde25, et parce qu’aucune étape d’amplification du signal n’a été effectuée ici, nous avons d’abord optimisé la détection de nos anticorps conjugués primaires pour chaque marqueur au microscope. Un exemple est mo...

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A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Nous décrivons une méthode de coloration rapide pour effectuer l’imagerie multispectrale sur les tissus congelés.

Une méthode rapide pour l’imagerie multispectrale de fluorescence des sections de tissu congelé

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Cette méthode est utile pour détecter et co-localisé plusieurs biomarqueurs en une seule cryosection, y compris des marqueurs qui ne sont normalement pas détectables dans les sections de paraffine. En utilisant cette méthode expérimentale de coloration, le temps de coloration est considérablement réduit et la méthode peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire. La démonstration de cette méthode sera Dinesh Jaishankar.Il est un postdoc qualifié du laboratoire, ainsi que le noyau d’évaluation de l’immunothérapie, gestionnaire des installations. Lors de la sélection des anticorps pour l’analyse, considérez les ensembles de filtres d’excitation et d’émission disponibles sur le système d’imagerie semi-automatisé. Et après avoir testé diverses combinaisons d’anticorps primaires conjugués fluorophore, préparer les fluorophores à utiliser de sorte que vous avez un chevauchement spectral minimal comme suggéré dans le tableau.Pour la coloration multiplexe, préparer un cocktail d’anticorps avec des fluorophores compatibles à des délires optimaux prédéterminés, et ajouter le cocktail aux sections tissulaires d’intérêt. Pour une coloration à marqueur unique, ajouter l’anticorps conjugué primaire uniquement à la diapositive. Pour toutes les taches, inclure une lame non tachée de contrôle qui subit la même procédure de coloration sans l’ajout d’un anticorps conjugué primaire.Après une incubation d’une heure à température ambiante protégée de la lumière, lavez les glissières deux fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Après le deuxième lavage, contre-tacher les toboggans tachés multiplexes avec dapi pendant sept minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, suivie de deux lavages de cinq minutes dans PBS. Pour créer une bibliothèque spectrale, réglez la puissance de la lampe du système d’imagerie multispectral à 100% et ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope.Sélectionnez Modifier le protocole et le nouveau protocole. Entrez un nom de protocole et sélectionnez Fluorescence en mode imagerie. Ensuite, fournissez un nom d’étude, et chargez les diapositives tachées sur la scène.Cliquez sur Modifier l’exposition et utilisez les options de mise au point automatique et d’exposition automatique pour ajuster les temps d’exposition et acquérir des instantanés pour les diapositives tachées simples. Après avoir imagerie des diapositives tachées unique, enregistrer le protocole. Et dans le logiciel d’apprentissage automatique sous l’onglet Build Library, chargez chaque image tachée.Sélectionnez le plancher approprié et cliquez sur Extrait. Le logiciel extrairea automatiquement le signal fluorescent sélectionné dans le sol. Pour enregistrer la couleur extraite, cliquez sur Enregistrer pour stocker.Un nouveau groupe peut être créé ou la couleur extraite peut être stockée à un groupe existant. Pour l’imagerie multispectrale, une fois que la bibliothèque spectrale a été créée et vérifiée, ajustez les temps de mise au point et d’exposition sur la diapositive tachée multiplexe comme démontré, et ouvrent des diapositives numérisées pour créer une nouvelle tâche. Fournissez un iD de diapositives et sélectionnez un protocole.Sous la tâche, sélectionnez l’analyse complète de diapositives pour effectuer un balayage de diapositives entier sur la diapositive tachée multiplexe. Dans toute l’image de balayage de diapositives, sélectionnez les régions d’intérêt à travers l’image. Ces régions seront numérisées à l’aide des temps d’exposition précédemment définis sur la diapositive multiplexe à utiliser pour le démixage et l’analyse spectraux.Dans le logiciel d’exploitation microscope, sélectionnez acquérir des champs MSI sous tâche, puis cliquez sur Process Slide pour acquérir des régions d’intérêt à un grossissement 20x. Une fois que les régions d’intérêt ont été acquises, dans le logiciel d’apprentissage automatique, cliquez sur Fichier et Ouvrez sous l’onglet analyse manuelle pour charger les images tachées multiplexes. Sélectionnez la source spectrale de la bibliothèque et cliquez sur Sélectionner les étages pour choisir la bibliothèque spectrale précédemment enregistrée.Cliquez sur Fichier et Ouvrez pour charger l’image non tachée. Cliquez ensuite sur l’icône marqueur d’encre d’autofluorescence et tracez une ligne ou une région sur la diapositive non tachée pour identifier l’autofluorescence dans le tissu. Ensuite, sous l’onglet Modifier les marqueurs et les couleurs, assigner des noms pour chaque marqueur et cliquez sur Préparer tous.Après avoir vérifié l’image spectrale non mélangée, dans le logiciel d’apprentissage automatique, sélectionnez la membrane du cytoplasme et les options de marqueurs du panneau. Et en utilisant le bouton ellipsis, sélectionnez utiliser ce signal pour trouver, pour configurer le marqueur pour détecter soit les noyaux, cytoplasme ou membrane. lorsqu’un marqueur cytoplasmique ou membranaire est choisi, sélectionnez l’utilisation du signal pour faciliter l’option de fractionnement nucléaire.Le logiciel détectera et créera automatiquement des masques individuels pour le noyau, le cytoplasme et la membrane. Utilisez la vue pathologie pour un marqueur spécifique et les options de configuration dans le logiciel pour ajuster les masques, et cliquez sur Segment All pour créer une carte de segmentation cellulaire. Après la segmentation cellulaire, sélectionnez les marqueurs pour phénotyper les cellules positives.En outre, sélectionnez au moins cinq cellules qui ne sont pas tachées avec le marqueur choisi pour phénotyper les cellules négatives. Cliquez ensuite sur Train Classifier pour former le logiciel pour détecter automatiquement toutes les cellules tachées avec les marqueurs sélectionnés dans l’image. Une carte phénotype sera créée.Comme ces images le démontrent, des anticorps validés pour la cytométrie d’écoulement pourraient être utilisés pour visualiser la coloration des tissus à l’aide du filtre tunable en cristal liquide dans le système d’imagerie semi-automatisé. Ici, on peut observer une image spectrale non mélangée de l’amygdale humaine congelée qui inclut l’étiquetage des cellules B et des cellules proliférantes dans le centre germinal folliculaire, et la région inter folliculaire de T-cellule. L’option vues de pathologie permet la visualisation du modèle individuel de coloration pour chaque marqueur dans le tissu d’intérêt, suggérant que la méthode de coloration multiplexe et le travail d’imagerie spectrale sur le tissu congelé.Comme démontré sur une section congelée de tumeur de souris, la formation image multispectrale peut également être employée pour visualiser la tumeur infiltrant des lymphocytes T, et d’autres lignées myéloïdes de cellules comprenant des macrophages associés de tumeur. Des cartes de segmentation cellulaire et de phénotype, ainsi que le nombre de cellules tachées pour chaque marqueur analysé par le logiciel peuvent être générées, ce qui démontre que le logiciel peut être utilisé pour quantifier la coloration multispectrale sur les tissus gelés. Pour quelqu’un de nouveau 6 à la technique, il est important d’obtenir de connaître les caractéristiques spécifiques de vos fluorochromes, et de préparer des diapositives de bibliothèque de qualité pour le démixage spectral avec chevauchement spectral minimal.Il est également important d’effectuer la titration d’anticorps. À notre avis, cette méthode peut fournir des informations de chevet sur l’efficacité de l’immunothérapie pour le cancer et d’autres applications thérapeutiques, en particulier lorsque le moment est de l’essence.

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