Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
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Die Anleitung zur Bildgebung und Analyse wurde vom Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core an der University of Illinois at Chicago mit Unterstützung des Büros des Vizekanzlers für Forschung bereitgestellt. Die Arbeit wurde von NIH/NCI RO1CA191317 an CLP, von NIH/NIAMS (SBDRC Grant 1P30AR075049-01) an Dr. A. Paller und mit Unterstützung des Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center an den Immunotherapy Assessment Core an der Northwestern University unterstützt.

Mausmilz und HLF16 Maustumorgewebe23 wurden aus unserem Labor gewonnen. Menschliches Mandelgewebe wurde von einem kommerziellen Anbieter gekauft. Einzelheiten finden Sie in der Tabelle der Materialien.
1. Gewebeeinbettung
<ol><li>Einbetten von frischem Gewebe in OCT (optimale Schnitttemperatur) Lösung und Schnappgefrieren mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Gewebe bei -80 °C lagern.</li>
</ol>2. Kryosektion...

Gefrorene Gewebe wurden ausgiebig für die mIF-Bildgebung verwendet, um traditionell drei bis vier Marker31 auf einem Gewebe mit der direkten und indirekten Methode32zu erkennen. Bei der direkten Methode werden Antikörper mit fluoreszierenden Farbstoffen oder Quantenpunkten33 konjugiert, um das Gewebe zu kennzeichnen, während bei der indirekten Methode ein unkonjugierter Primärantikörper verwendet wird, um das Gewebe zu kennzeichnen, gefolgt von ...

Jüngste Fortschritte bei mikroskopischen Bildgebungstechniken haben unser Wissen und Verständnis von biologischen Prozessen und Krankheitszuständen deutlich verbessert. Der In-situ-Nachweis von Proteinen in Geweben über die chromogene Immunhistochemie (IHC) wird routinemäßig in der Pathologie durchgeführt. Der Nachweis mehrerer Marker mit chromogener IHC-Färbung ist jedoch eine Herausforderung1 und neuere Methoden zur Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeansätzen (mIF), bei denen mehrere biologische Marker auf einer einzigen Gewebeprobe gekennzeichnet sind, werden entwickelt. Der Nachweis mehrerer biologischer Marker ist nützlich, da Informationen zur Gewebearchitektur, zur räumlichen Verteilung von Zellen und zur Antigen-Co-Expression alle in einer einzigen Gewebeprobe erfasst werden2. Der Einsatz multispektraler Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie hat den Nachweis mehrerer biologischer Marker ermöglicht. In dieser Technologie können die Fluoreszenzspektren jedes einzelnen Fluorophors durch spezifische Optik getrennt oder "ungemischt" werden, was die Detektion mehrerer Marker ohne Spektralüberlaufermöglicht 3. Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wird zu einem kritischen Ansatz in der Zellbiologie, präklinischen Arzneimittelentwicklung, klinischen Pathologie und Tumorimmunprofilierung4,5,6. Wichtig ist, dass die räumliche Verteilung von Immunzellen (speziell CD8-T-Zellen) als prognostischer Faktor für Patienten mit bestehenden Tumoren dienen kann7.
Verschiedene Ansätze zur Multiplexfluoreszenzfärbung wurden entwickelt und können entweder gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Bei der gleichzeitigen Färbemethode werden alle Antikörper als Cocktail in einem einzigen Schritt zusammengefügte, um das Gewebe zu kennzeichnen. Die UltraPlex-Technologie verwendet einen Cocktail von haptenkonjugierten Primärantikörpern, gefolgt von einem Cocktail fluorophor-konjugierter antihapten sekundärer Antikörper. Die InSituPlex-Technologie8 verwendet einen Cocktail aus einzigartigen DNA-konjugierten Primärantikörpern, die dem Gewebe gleichzeitig zugesetzt werden, gefolgt von einem Amplifikationsschritt und schließlich fluorophorkonjugierten Sonden, die jede einzigartige DNA-Sequenz am primären Antikörper ergänzen. Beide Technologien ermöglichen den Nachweis von vier Markern plus 4',6-Diamino-2-Phenylindole (DAPI) für die kerntechnische Färbung. Zwei weitere Ansätze zur simultanen Multiplexfärbung basieren auf der sekundären Ionenmassenspektrometrie9. Das Hyperion Imaging System verwendet bildgebende Massenzytometrie10, um bis zu 37 Marker zu erkennen. Diese Technologie verwendet einen Cocktail aus metallkonjugierten Antikörpern, um das Gewebe zu färben, und bestimmte Bereiche des Gewebes werden durch einen Laser ablated und auf ein Massenzytometer übertragen, wo die Metallionen nachgewiesen werden. Eine weitere ähnliche Technologie ist der IONPath, der Multiplex-Ionen-Strahl-Bildgebungstechnologie11verwendet. Diese Technologie verwendet ein modifiziertes Massenspektrometrieinstrument und eine Sauerstoffionenquelle anstelle von Laser, um die metallkonjugierten Antikörper abzuschleifen. Während all diese simultanen Multiplex-Färbeansätze den Nachweis mehrerer Marker ermöglichen, sind die Kosten für die Konjugation von DNA, Hapten oder Metallen zu Antikörpern, der Gewebeverlust durch Ablation und die umfangreiche Bildverarbeitung zum Entmischen nicht zu unterschätzen. Darüber hinaus sind Kits und Färbeprotokolle derzeit nur für FFPE-Gewebe verfügbar, und die Entwicklung von kundenspezifischen Panels erfordert zusätzlichen Zeit- und Aufwand.
Die sequenzielle Multiplex-Färbungsmethode hingegen umfasst die Kennzeichnung des Gewebes mit einem Antikörper auf einen Marker,, um den Antikörper zu entfernen, gefolgt von sequenziellen Wiederholungen dieses Prozesses, um mehrere Marker12zu beschriften. Die Tyramidsignalverstärkung (TSA) ist die am häufigsten verwendete sequenzielle Multiplexing-Methode. Zwei weitere Multiplexing-Technologien verwenden eine Kombination aus simultanen und sequentiellen Färbemethoden. Die CODEX-Plattform13 verwendet einen Cocktail von Antikörpern, die zu einzigartigen DNA-Oligonukleotidsequenzen konjugiert sind, die schließlich mit einem Fluorophor mit einem indizierten Polymerisationsschritt gekennzeichnet werden, gefolgt von Bildgebung, Abisolieren und Wiederholen des Prozesses, um bis zu 50 Marker zu erkennen. Der MultiOmyx Multiplex-Färbungsansatz14 ist eine Iteration der Färbung mit einem Cocktail von drei bis vier fluorophorkonjugierten Antikörpern, bildgebend, das Abschrecken der Fluorophore und die Wiederholung dieses Zyklus, um bis zu 60 Marker auf einem einzigen Abschnitt zu erkennen. Ähnlich wie bei der gleichzeitigen Multiplex-Färbungsmethode, während eine breite Palette von Markern erkannt werden kann, ist die Zeit, die mit Färbung, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse verbunden ist, umfangreich. Der Stripping/Quenching-Schritt beinhaltet das Erhitzen und/oder Bleichen der Gewebeprobe und somit wird der sequenzielle Multiplex-Färbungsansatz häufig an FFPE-Geweben durchgeführt, die die Gewebeintegrität beim Erhitzen oder Bleichen erhalten.
Formalin Fixierung und nachfolgende Paraffin-Einbettung wird leicht in einer klinischen Umgebung durchgeführt, Gewebeblöcke sind einfach zu lagern, und mehrere Multiplex-Färbung Protokolle sind verfügbar. Die Verarbeitung, Einbettung und Deparaffinisierung von FFPE-Geweben sowie Antigenabruf15, ein Prozess, bei dem Antikörper besser auf Epitope zugreifen können, ist jedoch zeitaufwändig. Darüber hinaus trägt die Verarbeitung in FFPE-Geweben zur Autofluoreszenz16 bei und maskiert Zielepitope, was zu der Variabilität und dem Mangel an Antikörperklon führt, die zum Nachweis von Antigenen in FFPE-Geweben17,18,19zur Verfügung stehen. Ein Beispiel ist die menschliche Leukozytenantigen (HLA) Klasse I Allele20. Im Gegensatz dazu beinhaltet das Einfrieren von Geweben keine umfangreichen Verarbeitungsschritte vor oder nach der Fixierung, wodurch die Notwendigkeit eines Antigenabrufs21,22umgangen wird und es für die Erkennung einer breiteren Palette von Zielen von Vorteil ist. Daher kann die Verwendung von gefrorenem Gewebe für die multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wertvoll sein, um Ziele für präklinische und klinische Studien zu detektieren.
Angesichts der oben genannten Einschränkungen bei der Verwendung von FFPE-Geweben haben wir gefragt, ob multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben durchgeführt werden kann. Um diese Frage zu beantworten, testeten wir eine simultane Multiplex-Färbungsmethode mit einem Panel von fluorophorkonjugierten Antikörpern, um mehrere Antigene zu erkennen, und analysierten die Färbung mit einem semiautomatisierten multispektralen Bildgebungssystem. Wir konnten innerhalb von 90 min bis zu sechs Marker in einem einzigen Gewebeabschnitt färben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung auf formalinfixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Gewebe ermöglicht den Nachweis mehrerer Marker in einer einzigen Gewebeprobe, die Informationen über Antigenkoexpression und räumliche Verteilung der Marker liefern können. Ein Mangel an geeigneten Antikörpern für formalfixierte Gewebe kann jedoch die Art der Marker einschränken, die nachgewiesen werden können. Darüber hinaus ist die Färbemethode zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode zur Multispektralfluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben. Die Methode umfasst die verwendeten Fluorophorkombinationen, detaillierte Schritte zur Färbung von Maus- und menschlichen gefrorenen Geweben sowie die Scan-, Erfassungs- und Analyseverfahren. Für die Färbeanalyse wird ein handelsübliches multispektrales Fluoreszenz-Bildgebungssystem eingesetzt. Durch diese Methode wurden bis zu sechs verschiedene Marker in einem einzigen gefrorenen Gewebeabschnitt gebeizt und nachgewiesen. Die Machine Learning-Analysesoftware kann Zellen phänotypieren, die für die quantitative Analyse verwendet werden können. Die hier beschriebene Methode für gefrorene Gewebe ist nützlich für den Nachweis von Markern, die in FFPE-Geweben nicht nachgewiesen werden können oder für die Antikörper für FFPE-Gewebe nicht verfügbar sind.

Nachweis von einscheinigten Markern auf gefrorenen Milzabschnitten Da das halbautomatische Bildgebungssystem ein Flüssigkristall-Tunable-Filter-System (LCTF) verwendet, das einen größeren Bereich der Wellenlängendetektion25ermöglicht und hier keine Signalverstärkungsschritte durchgeführt wurden, haben wir zunächst die Detektion unserer primär konjugierten Antikörper für jeden Marker auf dem Mikroskop optimiert. Ein Beispiel ist in Abbildung 1</st...

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A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Diese Methode ist hilfreich, um mehrere Biomarker in einem einzigen Kryoabschnitt zu erkennen und gemeinsam zu lokalisieren, einschließlich Markern, die normalerweise in Paraffinabschnitten nicht nachweisbar sind. Mit dieser experimentellen Färbemethode wird die Färbezeit deutlich reduziert und das Verfahren kann in jedem Labor durchgeführt werden. Demonstriert diese Methode wird Dinesh Jaishankar sein.Er ist ein erfahrener Postdoc aus dem Labor, und auch der Immunotherapy Assessment Core, Facility Manager. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Antikörpern für die Analyse die Auffgungs- und Emissionsfiltersätze, die auf dem halbautomatischen Bildgebungssystem verfügbar sind. Und nach dem Testen verschiedener Kombinationen von fluorophor konjugierten Primärantikörpern bereiten Sie Fluorophore so vor, dass Sie eine minimale spektrale Überlappung haben, wie in der Tabelle vorgeschlagen.Für Multiplex-Färbung, bereiten Sie einen Cocktail von Antikörpern mit kompatiblen Fluorophoren bei vorgegebenen optimalen Wahnvorstellungen, und fügen Sie den Cocktail zu den Gewebeabschnitten von Interesse. Für die Einzelmarkerfärbung fügen Sie den primären konjugierten Antikörper nur dem Dia hinzu. Für alle Färbungen, enthalten eine Kontrolle ungefärbt Dia, die die gleiche Färbung Verfahren ohne die Zugabe eines primären konjugierten Antikörper unterzogen wird.Nach einer einstündigen Inkubation bei Lichtschutz bei Raumtemperatur die Dias zwei Mal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang waschen. Nach der zweiten Wäsche, Gegenfärbung der Multiplex-Buntschlitten mit DAPI für sieben Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen in PBS. Um eine Spektralbibliothek zu erstellen, stellen Sie die Lampenleistung des multispektralen Bildgebungssystems auf 100 % ein und öffnen Sie die Betriebssystemsoftware des Mikroskops.Wählen Sie Protokoll bearbeiten und neues Protokoll aus. Geben Sie einen Protokollnamen ein, und wählen Sie Fluoreszenz im Bildverarbeitungsmodus aus. Geben Sie dann einen Studiennamen an, und laden Sie die einzelnen gebeizten Dias auf die Bühne.Klicken Sie auf Belichtung bearbeiten, und verwenden Sie die Optionen für den automatischen Fokus und die automatische Belichtung, um die Belichtungszeiten anzupassen und Snapshots für die einzelnen gebeizten Folien zu erfassen. Speichern Sie nach der Abbildung der einzelnen gebeizten Dias das Protokoll. Und laden Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte Build Library jedes einzelne gebeizte Bild.Wählen Sie die entsprechende Etage aus, und klicken Sie auf Extrahieren. Die Software extrahiert automatisch das im Boden ausgewählte Fluoreszenzsignal. Um die extrahierte Farbe zu speichern, klicken Sie auf Speichern, um sie zu speichern.Eine neue Gruppe kann erstellt oder die extrahierte Farbe in einer vorhandenen Gruppe gespeichert werden. Passen Sie für die multispektrale Bildgebung nach der Erstellung und Überprüfung der Spektralbibliothek den Fokus und die Belichtungszeiten auf dem Multiplex-Buntdia wie gezeigt an und öffnen gescannte Dias, um eine neue Aufgabe zu erstellen. Geben Sie eine Folien-ID an, und wählen Sie ein Protokoll aus.Wählen Sie unter Aufgabe den gesamten Folienscan aus, um einen ganzen Diascan auf der Multiplex-Buntfolie durchzuführen. Wählen Sie im gesamten Folienscanbild Bereiche aus, die für das gesamte Bild von Interesse sind. Diese Bereiche werden mit den zuvor festgelegten Belichtungszeiten auf dem Multiplex-Dia gescannt, die für die spektrale Unmischung und Analyse verwendet werden sollen.Wählen Sie in der Mikroskop-Betriebssystemsoftware MSI-Felder unter Aufgabe aus, und klicken Sie dann auf Prozessfolie, um Interessenbereiche mit einer 20-fachen Vergrößerung zu erfassen. Sobald die Bereiche von Interesse erworben wurden, klicken Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte manuelle Analyse auf Datei und Öffnen, um die multiplexen gebeizten Bilder zu laden. Wählen Sie die Spektralbibliotheksquelle aus, und klicken Sie auf Flächen auswählen, um die zuvor gespeicherte Spektralbibliothek auszuwählen.Klicken Sie auf Datei und Öffnen, um das unbefleckte Bild zu laden. Klicken Sie dann auf das Symbol für die Autofluoreszenz-Farbmarkierung, und zeichnen Sie eine Linie oder einen Bereich auf der ungefleckten Folie, um die Autofluoreszenz im Gewebe zu identifizieren. Weisen Sie dann unter der Registerkarte Marker und Farben bearbeiten Namen für jeden Marker zu, und klicken Sie auf Alle vorbereiten.Nachdem Sie das spektral ungemischte Bild überprüft haben, wählen Sie in der Machine Learning-Software die Zytoplasmamembran- und Markeroptionen aus dem Panel aus. Und wählen Sie mit der Auslassungstaste dieses Signal aus, um den Marker zu finden, um entweder die Kerne, das Zytoplasma oder die Membran zu erkennen. Wenn ein Zytoplasma- oder Membranmarker ausgewählt ist, wählen Sie die Option Signal verwenden, um die Kernspaltungsoption zu unterstützen.Die Software erkennt und erstellt automatisch individuelle Masken für Den Kern, das Zytoplasma und die Membran. Verwenden Sie die Pathologieansicht für einen bestimmten Marker und die Konfigurationsoptionen in der Software, um die Masken anzupassen, und klicken Sie auf Segment Alle, um eine Zellsegmentierungszuordnung zu erstellen. Wählen Sie nach der Zellsegmentierung die Marker aus, um die positiven Zellen zu phäphieren.Wählen Sie außerdem mindestens fünf Zellen aus, die nicht mit dem ausgewählten Marker befleckt sind, um die negativen Zellen zu phänotypieren. Klicken Sie dann auf Klassifier trainieren, um die Software zu trainieren, um automatisch alle Zellen zu erkennen, die mit den ausgewählten Markern im Bild befleckt sind. Es wird eine Phänotypkarte erstellt.Wie diese Bilder zeigen, könnten Antikörper, die für die Durchflusszytometrie validiert wurden, verwendet werden, um Gewebefärbung mit dem Flüssigkristall-Abstimmfilter im halbautomatischen Bildgebungssystem zu visualisieren. Hier kann ein spektral ungemischtes Bild von gefrorenen menschlichen Mandeln beobachtet werden, das die Kennzeichnung von B-Zellen und Proliferierenden Zellen innerhalb des follikulären Keimzentrums und der interfollikulären T-Zell-Region umfasst. Die Pathologie-Ansichtsoption ermöglicht die Visualisierung des einzelnen Färbemusters für jeden Marker innerhalb des Gewebes von Interesse, was darauf hindeutet, dass die Multiplex-Färbungsmethode und die spektrale Bildgebung auf gefrorenem Gewebe wirken.Wie auf einem gefrorenen Maustumorabschnitt gezeigt, kann multispektrale Bildgebung auch verwendet werden, um Tumor infiltrierende T-Zellen und andere myeloische Zelllinien einschließlich tumorassoziierter Makrophagen zu visualisieren. Zellsegmentierung und Phänotypkarten sowie die Anzahl der von der Software analysierten Fleckenzellen für jeden von der Software analysierten Marker können generiert werden, was zeigt, dass die Software für die Quantifizierung der multispektralen Färbung auf gefrorenen Geweben verwendet werden kann. Für jemanden, der die Technik neu hat, ist es wichtig, die spezifischen Merkmale Ihrer Fluorchrome kennen zu lernen und Qualitätsbibliotheksdias für das spektrale Unmixen mit minimaler spektraler Überlappung vorzubereiten.Es ist auch wichtig, Antikörper-Titration durchzuführen. Unserer Meinung nach kann diese Methode am Krankenbett Informationen über die Wirksamkeit der Immuntherapie bei Krebs und anderen therapeutischen Anwendungen liefern, insbesondere wenn Timing von entscheidender Bedeutung ist.

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