Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections at JoVE.com

इमेजिंग और विश्लेषण मार्गदर्शन अनुसंधान संसाधन केंद्र द्वारा प्रदान किया गया था - अनुसंधान विज्ञान और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में ऊतक इमेजिंग कोर अनुसंधान के लिए कुलपति के कार्यालय से समर्थन के साथ स्थापित किया। इस काम को NIH/NCI RO1CA191317 द्वारा सीएलपी को, NIH/NIAMS (SBDRC अनुदान 1P30AR075049-01) द्वारा डॉ ए पल्लर को, और नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में इम्यूनोथेरेपी मूल्यांकन कोर के लिए रॉबर्ट एच Lurie व्यापक कैंसर केंद्र के समर्थन से समर्थन किया गया था ।

माउस तिल्ली और HLF16 माउस ट्यूमर ऊतक23 हमारी प्रयोगशाला से प्राप्त किए गए थे। मानव टॉन्सिल ऊतक एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा गया था। सामग्री की तालिका में विवरण प्रदान किया जाता है।
<p class="jo...

मआईफ इमेजिंग के लिए जमे हुए ऊतकों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है ताकि प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष विधि32का उपयोग करके ऊतक पर पारंपरिक रूप से तीन से चार मार्कर31 का पता लगाया जा सके । प्?...

सूक्ष्म इमेजिंग तकनीकों में हाल ही में हुई प्रगति ने जैविक प्रक्रियाओं और रोग राज्यों के हमारे ज्ञान और समझ में काफी सुधार किया है। क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के माध्यम से ऊतकों में प्रोटीन का सीटू पता लगाने में नियमित रूप से विकृति में किया जाता है। हालांकि, गुणसूत्र आईएचसी धुंधला का उपयोग कर कई मार्कर का पता लगानेके लिए 1 और नए तरीकों को चुनौती दे रहा है मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (mIF) धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग करें, जिसमें कई जैविक मार्कर एक ही ऊतक नमूने पर लेबल कर रहे हैं, विकसित किया जा रहा है । कई जैविक मार्कर का पता लगाना उपयोगी है, क्योंकि ऊतक वास्तुकला से संबंधित जानकारी, कोशिकाओं का स्थानिक वितरण, और एंटीजन सह-अभिव्यक्ति सभी एक ऊतक नमूना2में कैप्चर किए जाते हैं। बहुप्रतिक्षित फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीक के उपयोग ने कई जैविक मार्कर का पता लगाना संभव बना दिया है। इस तकनीक में, विशिष्ट प्रकाशिकी का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्ति फ्लोरोफोर के फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा को अलग या "अमिश्रित" किया जा सकता है, जिससे बिना किसी स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक3के कई मार्कर का पता लगाया जा सकता है। मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग सेल बायोलॉजी, प्रीक्लीनिकल ड्रग डेवलपमेंट, क्लीनिकल पैथोलॉजी और ट्यूमर इम्यून-प्रोफाइलिंग4,5,5,6में एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण बनता जा रहा है। महत्वपूर्ण बात, प्रतिरक्षा कोशिकाओं (विशेष रूप से CD8 टी कोशिकाओं) के स्थानिक वितरण मौजूदा ट्यूमर7के साथ रोगियों के लिए एक शकुन कारक के रूप में काम कर सकते हैं ।
मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं और या तो एक साथ या क्रमिक रूप से किया जा सकता है। एक साथ धुंधला विधि में, सभी एंटीबॉडी ऊतक लेबल करने के लिए एक ही कदम में एक कॉकटेल के रूप में एक साथ जोड़ा जाता है। अल्ट्राप्लेक्स तकनीक हैप्टेन-कॉन्जुरेटेड प्राइमरी एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग करती है जिसके बाद फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेड एंटी-हैपटेन सेकेंडरी एंटीबॉडी का कॉकटेल होता है। InSituPlex प्रौद्योगिकी8 अद्वितीय डीएनए-conjugated प्राथमिक एंटीबॉडी के एक कॉकटेल का उपयोग करता है जो एक साथ ऊतक में जोड़ा जाता है जिसके बाद एक प्रवर्धन कदम और अंत में फ्लोरोफोर-कॉन्जुगाट जांच होती है जो प्राथमिक एंटीबॉडी पर प्रत्येक अद्वितीय डीएनए अनुक्रम के पूरक हैं। ये दोनों प्रौद्योगिकियां परमाणु धुंधला करने के लिए चार मार्कर प्लस 4',6-डिमिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) का पता लगाने में सक्षम बनाती हैं। एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला करने के लिए दो अन्य दृष्टिकोण माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री9पर आधारित हैं । हाइपरियन इमेजिंग सिस्टम 37 मार्कर तक का पता लगाने के लिए इमेजिंग मास साइटोमेट्री10 का उपयोग करता है। यह तकनीक ऊतकों को दाग देने के लिए धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग करती है, और ऊतकों के विशिष्ट क्षेत्रों को लेजर द्वारा बरी किया जाता है और एक बड़े पैमाने पर साइटोमीटर में स्थानांतरित किया जाता है जहां धातु आयनों का पता लगाया जाता है। इसी तरह की एक और तकनीक आयनपाथ है, जो मल्टीप्लेक्स्ड आयन बीम इमेजिंग टेक्नोलॉजी11का इस्तेमाल करती है । यह तकनीक धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी को त्यागने के लिए लेजर के बजाय एक संशोधित द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण और ऑक्सीजन आयन स्रोत का उपयोग करती है। हालांकि ये सभी एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण कई मार्कर का पता लगाने में सक्षम होते हैं, डीएनए, हैप्टेन्स या धातुओं को एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित करने के लिए शामिल लागत, एब्लेशन के कारण ऊतक ों की हानि, और अमिश्रण के लिए व्यापक छवि प्रसंस्करण को कम करके नहीं आंका जा सकता है। इसके अलावा, किट और धुंधला प्रोटोकॉल वर्तमान में केवल FFPE ऊतकों के लिए उपलब्ध है और कस्टम पैनलों के विकास के अतिरिक्त समय और व्यय पर जोर देता है ।
अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि, इसके विपरीत, एक मार्कर के लिए एक एंटीबॉडी के साथ ऊतक लेबलिंग, एंटीबॉडी को हटाने के लिए अलग करना, इस प्रक्रिया के अनुक्रमिक दोहराता के बाद कई मार्कर12लेबल शामिल हैं । टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्सिंग विधि है। दो अन्य मल्टीप्लेक्सिंग प्रौद्योगिकियां एक साथ और अनुक्रमिक धुंधला तरीकों के संयोजन का उपयोग करती हैं। कोडएक्स प्लेटफॉर्म13 अद्वितीय डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दृश्यों के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी का कॉकटेल कार्यरत है जिसे अंततः इमेजिंग, स्ट्रिपिंग और 50 मार्कर तक का पता लगाने की प्रक्रिया को दोहराने के बाद एक अनुक्रमित बहुलीकरण कदम का उपयोग करके फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है। मल्टीोमेक्स मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण14 तीन से चार फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेट एंटीबॉडी, इमेजिंग, फ्लोरोफोर्स को बुझाने और एक ही खंड पर 60 मार्कर तक का पता लगाने के लिए इस चक्र को दोहराने के कॉकटेल के साथ धुंधला होने का एक पुनरावृत्ति है। एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि के समान है, जबकि मार्कर की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाया जा सकता है, धुंधला, छवि अधिग्रहण, प्रसंस्करण, और विश्लेषण में शामिल समय व्यापक है । अलग-अलग/शमन कदम में ऊतक के नमूने को हीटिंग और/या ब्लीचिंग शामिल है और इस प्रकार, अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण आमतौर पर एफएफपीई ऊतकों पर किया जाता है जो हीटिंग या ब्लीचिंग पर ऊतक अखंडता को बनाए रखते हैं ।
फॉर्मेलिन फिक्सेशन और बाद में पैराफिन एम्बेडिंग आसानी से नैदानिक सेटिंग में की जाती है, ऊतक ब्लॉक स्टोर करना आसान होता है, और कई मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। हालांकि, एफएफपीई ऊतकों के प्रसंस्करण, एम्बेडिंग और डिपरफिनाइजेशन के साथ-साथ एंटीजन रिट्रीवल15,एक प्रक्रिया जिसके द्वारा एंटीबॉडी बेहतर एपीटोप का उपयोग कर सकते हैं, समय लेने वाली है। इसके अलावा, एफएफपीई ऊतकों में शामिल प्रसंस्करण ऑटोफ्लोरेसेंस16 में योगदान देता है और मास्क एपिटोप को लक्षित करता है, जिसके परिणामस्वरूप एफएफपीई ऊतकों17,,18,,19में एंटीजन का पता लगाने के लिए उपलब्ध एंटीबॉडी क्लोन की परिवर्तनशीलता और कमी होती है। एक उदाहरण मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) वर्ग मैं एलील्स20है। इसके विपरीत, ऊतकों की स्नैप फ्रीजिंग में फिक्सिंग से पहले या बाद में व्यापक प्रसंस्करण चरण शामिल नहीं हैं, एंटीजन पुनर्प्राप्ति21,,22की आवश्यकता को दरकिनार करते हैं, और लक्ष्यों की एक व्यापक श्रृंखला का पता लगाने के लिए इसे फायदेमंद बनाते हैं। इसलिए, बहुप्रतिक्षित फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए जमे हुए ऊतकों का उपयोग पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों के लिए लक्ष्यों का पता लगाने के लिए मूल्यवान हो सकता है।
एफएफपीई ऊतकों का उपयोग करते समय उपरोक्त सीमाओं को देखते हुए, हमने पूछा कि क्या जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग की जा सकती है। इस सवाल का समाधान करने के लिए, हमने कई एंटीजन का पता लगाने के लिए फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेरेट एंटीबॉडी के पैनल का उपयोग करके एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि का परीक्षण किया और एक अर्धस्वचालित बहुस्पेक्ट्रल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके धुंधला का विश्लेषण किया। हम एक साथ ९० मिनट के भीतर एक ही ऊतक अनुभाग में छह मार्कर को दाग करने में सक्षम थे ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग एक ऊतक नमूने में कई मार्कर का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो मार्कर के एंटीजन सहअभिव्यक्ति और स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। हालांकि, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी की कमी मार्कर की प्रकृति को प्रतिबंधित कर सकती है जिसका पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा धुंधला तरीका समय लेने वाला होता है। यहां हम जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग करने के लिए एक त्वरित विधि का वर्णन करते हैं। विधि में इस्तेमाल किए गए फ्लोरोफोर संयोजन, माउस और मानव जमे हुए ऊतकों के धुंधला होने के लिए विस्तृत कदम, और स्कैनिंग, अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रियाएं शामिल हैं। धुंधला विश्लेषण के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अर्धस्वचालित बहुआयामी फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया जाता है। इस विधि के माध्यम से, एक ही जमे हुए ऊतक अनुभाग में छह अलग-अलग मार्कर दाग और पाए गए। मशीन लर्निंग एनालिसिस सॉफ्टवेयर फेनोटाइप कोशिकाओं को फेनोटाइप कर सकता है जिसका उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। जमे हुए ऊतकों के लिए यहां वर्णित विधि मार्कर का पता लगाने के लिए उपयोगी है जिसे एफएफपीई ऊतकों में पता नहीं लगाया जा सकता है या जिसके लिए एफएफपीई ऊतकों के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं।

जमे हुए तिल्ली वर्गों पर एकल दाग मार्कर का पता लगाने चूंकि अर्धस्वचालित इमेजिंग सिस्टम एक तरल क्रिस्टल tunable फिल्टर (LCTF) प्रणाली का उपयोग करता है जो तरंगदैर्ध्य का पता लगाने25की एक व्यापक ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections at JoVE.com

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

हम जमे हुए ऊतकों पर बहुनिरीक्षण इमेजिंग करने के लिए एक तेजी से धुंधला विधि का वर्णन करते हैं।

जमे हुए ऊतक वर्गों के मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए एक रैपिड विधि

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

यह विधि एक ही क्रायोसेक्शन में कई बायोमार्कर का पता लगाने और सह-स्थानीयकरण करने में सहायक है, जिसमें मार्कर शामिल हैं जो सामान्य रूप से पैराफिन अनुभागों में पता लगाने योग्य नहीं हैं। इस प्रयोगात्मक धुंधला विधि का उपयोग करना, धुंधला समय काफी कम हो जाता है और विधि किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है। इस विधि का प्रदर्शन दिनेश जयशंकर करेंगे।वह लैब से एक कुशल पोस्टडॉक है, और इम्यूनोथेरेपी असेसमेंट कोर, सुविधाएं प्रबंधक भी है। विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी का चयन करते समय, अर्ध-स्वचालित इमेजिंग सिस्टम पर उपलब्ध उत्तेजन और उत्सर्जन फ़िल्टर सेट पर विचार करें। और फ्लोरोफोर कंजम्पर्ड प्राथमिक एंटीबॉडी के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण करने के बाद, फ्लोरोफोरस का उपयोग करने के लिए तैयार करें ताकि आपके पास तालिका में सुझाए गए न्यूनतम स्पेक्ट्रल ओवरलैप हो।मल्टीप्लेक्स धुंधला के लिए, पूर्व निर्धारित इष्टतम भ्रम में संगत फ्लोरोफोरेस के साथ एंटीबॉडी का कॉकटेल तैयार करें, और ब्याज के ऊतक वर्गों में कॉकटेल जोड़ें। एकल मार्कर धुंधला के लिए, केवल स्लाइड करने के लिए प्राथमिक संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें। सभी धुंधला के लिए, एक नियंत्रण अन दाग स्लाइड शामिल है कि एक प्राथमिक संयुग्मित एंटीबॉडी के अलावा बिना एक ही धुंधला प्रक्रिया से गुजरता है ।एक घंटे के बाद कमरे में प्रकाश से संरक्षित तापमान पर इनक्यूबेशन, प्रति धोने पांच मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड दो बार धोएं । दूसरे वॉश के बाद काउंटर दाग मल्टीप्लेक्स दाग ने प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर सात मिनट के लिए DAPI के साथ स्लाइड दाग, इसके बाद पीबीएस में २ ५ मिनट की वॉश की । स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी बनाने के लिए मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग सिस्टम की लैंप पावर को 100% तक सेट करें और माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें।एडिट प्रोटोकॉल और नए प्रोटोकॉल का चयन करें। एक प्रोटोकॉल नाम दर्ज करें और इमेजिंग मोड के तहत फ्लोरेसेंस का चयन करें। फिर एक अध्ययन का नाम प्रदान करें, और मंच पर एकल दाग स्लाइड लोड करें।एडिट एक्सपोजर पर क्लिक करें, और एक्सपोजर समय को समायोजित करने और एकल दाग वाली स्लाइड्स के लिए स्नैपशॉट प्राप्त करने के लिए ऑटो-फोकस और ऑटो-बेनकाब विकल्पों का उपयोग करें। सिंगल दाग वाली स्लाइड्स इमेजिंग के बाद प्रोटोकॉल को सेव करें। और बिल्ड लाइब्रेरी के टैब के तहत मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर में, प्रत्येक एक दाग छवि लोड करें।उपयुक्त मंजिल का चयन करें और निकालने पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर अपने आप फ्लोर में चुने गए फ्लोरोसेंट सिग्नल निकाल देगा। निकाले गए रंग को बचाने के लिए, स्टोर करने के लिए सेव पर क्लिक करें।एक नया समूह बनाया जा सकता है या निकाले गए रंग को मौजूदा समूह में संग्रहीत किया जा सकता है। मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग के लिए, एक बार स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी बनाई गई है और सत्यापित हो गई है, प्रदर्शन के रूप में मल्टीप्लेक्स दाग स्लाइड पर फोकस और एक्सपोजर समय को समायोजित करें, और एक नया कार्य बनाने के लिए स्कैन स्लाइड खोलता है। एक स्लाइड आईडी प्रदान करें और एक प्रोटोकॉल का चयन करें।टास्क के तहत, मल्टीप्लेक्स दाग स्लाइड पर एक पूरी स्लाइड स्कैन करने के लिए पूरी स्लाइड स्कैन का चयन करें। पूरी स्लाइड में छवि स्कैन, छवि भर में ब्याज के क्षेत्रों का चयन करें । इन क्षेत्रों को स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले मल्टीप्लेक्स स्लाइड पर पहले सेट एक्सपोजर समय का उपयोग करके स्कैन किया जाएगा।माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर में, कार्य के तहत एमएसआई फ़ील्ड का अधिग्रहण करें, और फिर 20x आवर्धन पर रुचि के क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए प्रोसेस स्लाइड पर क्लिक करें। एक बार ब्याज के क्षेत्रों का अधिग्रहण किया गया है, मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें फ़ाइल और मैनुअल विश्लेषण टैब के तहत खुला मल्टीप्लेक्स दाग छवियों लोड करने के लिए । स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी स्रोत का चयन करें, और पहले सेव किए गए स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी को चुनने के लिए चुनिंदा फ्लोर पर क्लिक करें।अन दाग वाली छवि लोड करने के लिए फ़ाइल पर क्लिक करें और खोलें। फिर ऑटोफ्लोरेसेंस इंक मार्कर आइकन पर क्लिक करें और ऊतक के भीतर ऑटोफ्लोरेसेंस की पहचान करने के लिए अन दाग वाली स्लाइड पर एक लाइन या क्षेत्र खींचें। फिर संपादित मार्कर और रंग टैब के तहत, प्रत्येक मार्कर के लिए नाम आवंटित करें और सभी को तैयार करने पर क्लिक करें।मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर में स्पेक्ट्रैल अनमिक्स इमेज को सत्यापित करने के बाद, पैनल से साइटोप्लाज्म झिल्ली और मार्कर विकल्पों का चयन करें। और एलिप्सिस बटन का उपयोग करके, नाभिक, साइटोप्लाज्म या झिल्ली का पता लगाने के लिए मार्कर को कॉन्फ़िगर करने के लिए, खोजने के लिए इस संकेत का उपयोग करें। जब एक साइटोप्लाज्मिक या झिल्ली मार्कर चुना जाता है, तो परमाणु बंटवारे के विकल्प में सहायता करने के लिए सिग्नल का उपयोग करें।सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से नाभिक, साइटोप्लाज्म और झिल्ली के लिए व्यक्तिगत मास्क का पता लगाएगा और बनाएगा। मास्क को समायोजित करने के लिए एक विशिष्ट मार्कर और सॉफ्टवेयर में विन्यास विकल्पों के लिए पैथोलॉजी दृश्य का उपयोग करें, और सेल सेगमेंटेशन मानचित्र बनाने के लिए सेगमेंट सभी पर क्लिक करें। सेल विभाजन के बाद, सकारात्मक कोशिकाओं को फेनोटाइप करने के लिए मार्कर का चयन करें।इसके अतिरिक्त, कम से कम पांच कोशिकाओं का चयन करें जो नकारात्मक कोशिकाओं को फेनोटाइप करने के लिए चुने गए मार्कर के साथ दाग नहीं हैं। फिर छवि के भीतर चयनित मार्कर के साथ दाग कोशिकाओं के सभी स्वचालित रूप से पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित करने के लिए ट्रेन क्लासिफायर पर क्लिक करें। एक फेनोटाइप मैप बनाया जाएगा।जैसा कि इन छवियों को प्रदर्शित करता है, प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मान्य एंटीबॉडी का उपयोग अर्ध-स्वचालित इमेजिंग सिस्टम में तरल क्रिस्टल ट्यूनेबल फिल्टर का उपयोग करके ऊतक धुंधला कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। यहां जमे हुए मानव टॉन्सिल की एक स्पेक्ट्रली अनमिक्स छवि देखी जा सकती है जिसमें कूप अंकुरण केंद्र के भीतर बी-कोशिकाओं और प्रोलिफाइंग कोशिकाओं की लेबलिंग और अंतर कूप टी-सेल क्षेत्र शामिल है। पैथोलॉजी विचार विकल्प ब्याज के ऊतकों के भीतर प्रत्येक मार्कर के लिए व्यक्तिगत धुंधला पैटर्न के दृश्य की अनुमति देता है, सुझाव है कि मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि और जमे हुए ऊतक पर स्पेक्ट्रल इमेजिंग काम करते हैं ।जैसा कि एक जमे हुए माउस ट्यूमर अनुभाग पर प्रदर्शित किया गया है, मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग ट्यूमर घुसपैठ टी-कोशिकाओं, और ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज सहित अन्य माइलॉयड सेल वंश की कल्पना करने के लिए भी किया जा सकता है। सेल विभाजन और फेनोटाइप नक्शे, और सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किए गए प्रत्येक मार्कर के लिए दाग कोशिकाओं की संख्या उत्पन्न की जा सकती है, यह प्रदर्शित करते हुए कि सॉफ्टवेयर का उपयोग जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल धुंधला के परिमाणीकरण के लिए किया जा सकता है। तकनीक के लिए, अपने फ्लोरोक्रोम की विशिष्ट विशेषताओं को जानना और न्यूनतम स्पेक्ट्रल ओवरलैप के साथ स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के लिए गुणवत्ता पुस्तकालय स्लाइड तैयार करना महत्वपूर्ण है।एंटीबॉडी टिटररेशन करना भी महत्वपूर्ण है। हमारी राय में, यह विधि कैंसर और अन्य चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इम्यूनोथेरेपी की प्रभावकारिता के बारे में बेडसाइड जानकारी प्रदान कर सकती है, खासकर जब समय सार का हो।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

चिपकने वाला टेप आधारित नमूनाकरण और प्रतिदीप्ति का संयोजन बगल में</emरैपिड पता लगाने के लिए> संकरण साल्मोनेला ताजा उपज पर

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

ताला न्यूक्लिक एसिड प्रवाह cytometry प्रतिदीप्ति बगल में (LNA के प्रवाह मछली) संकरण: बैक्टीरियल लघु शाही सेना जांच के लिए विधि

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

गैर इनवेसिव एक माउस के लसीका वाहिका संरचना के ऑप्टिकल इमेजिंग

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

के 4D multimodality इमेजिंग<em&gt; Citrobacter rodentium</emचूहे में&gt; संक्रमण

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

पूरा का प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग<em&gt; एस। venezuelae</em&gt; जीवन चक्र एक microfluidic युक्ति का प्रयोग

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

रक्त प्रसंस्करण के लिए एक तेजी से विधि मानव रक्त में प्लाज्मा पेप्टाइड स्तर की पैदावार बढ़ाने के लिए

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

गैर इनवेसिव<em&gt; विवो में</em&gt; प्रतिदीप्ति भड़काऊ एमएमपी गतिविधि के ऑप्टिकल इमेजिंग एक सक्रिय फ्लोरोसेंट इमेजिंग एजेंट का प्रयोग

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

रैपिड न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस के लिए एक ऑल-ऑन-चिप विधि रक्त के एक बूंद से सीधे विश्लेषण

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा visualizing Intracellular जाल ्े

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

इमेजिंग रिपोर्टर एंजाइम प्रतिदीप्ति के साथ चूहों में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...