Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
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L'imaging e l'analisi sono state fornite dal Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core dell'Università dell'Illinois a Chicago istituito con il supporto dell'ufficio del Vice Cancelliere per la Ricerca. Il lavoro è stato supportato da NIH/NCI RO1CA191317 a CLP, da NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) al Dr. A. Paller, e dal sostegno del Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center to the Immunotherapy Assessment Core presso la Northwestern University.

La milza del topo e i tessuti tumorali del topo HLF1623 sono stati ottenuti dal nostro laboratorio. Il tessuto tonsillare umano è stato acquistato da un fornitore commerciale. I dettagli sono forniti nella Tabella dei Materiali.
1. Incorporamento dei tessuti
<ol><li>Incorporare tessuti freschi nella soluzione OCT (temperatura di taglio ottimale) e congelare con lo snap utilizzando ghiaccio secco o azoto liquido.</li>
	<li>Conservare i tessuti a -80 g...

I tessuti congelati sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging mIF per rilevare tradizionalmente da tre a quattro marcatori31 su un tessuto utilizzando il metodo diretto e indiretto32. Nel metodo diretto, gli anticorpi sono coniugati a coloranti fluorescenti o punti quantici33 per etichettare il tessuto, mentre nel metodo indiretto, un anticorpo primario non coniugato viene utilizzato per etichettare il tessuto seguito da un anticorpo secondario ...

I recenti progressi nelle tecniche di imaging microscopico hanno migliorato significativamente le nostre conoscenze e la comprensione dei processi biologici e degli stati della malattia. Il rilevamento in situ delle proteine nei tessuti tramite immunohistochimica cromogenica (IHC) viene regolarmente eseguito in patologia. Tuttavia, il rilevamento di più marcatori che utilizzano la colorazione IHC cromogenica è difficile1 e metodi più recenti per utilizzare approcci di colorazione multifluorescenza (mIF), in cui più marcatori biologici sono etichettati su un singolo campione di tessuto, sono in fase di sviluppo. La rilevazione di più marcatori biologici è utile, perché le informazioni relative all'architettura dei tessuti, alla distribuzione spaziale delle cellule e alla co-espressione dell'antigene sono tutte catturate in un campione di tessuto singolo2. L'uso della tecnologia di imaging a fluorescenza multispettrale ha reso possibile il rilevamento di più marcatori biologici. In questa tecnologia, utilizzando ottiche specifiche, gli spettri di fluorescenza di ogni singolo fluoroforo possono essere separati o "non miscelati", consentendo il rilevamento di più marcatori senza alcun crosstalk spettrale3. L'imaging a fluorescenza multispettrale sta diventando un approccio critico nella biologia cellulare, nello sviluppo di farmaci preclinici, nella patologia clinica e nella profilazione immunitaria del tumore4,5,6. È importante sottolineare che la distribuzione di cellule immunitarie (in particolare le cellule T CD8) può servire come fattore prognostico per i pazienti con tumori esistenti7.
Sono stati sviluppati vari approcci alla colorazione a fluorescenza multiplex che possono essere eseguiti contemporaneamente o in sequenza. Nel metodo di colorazione simultanea, tutti gli anticorpi vengono aggiunti insieme come cocktail in un unico passaggio per etichettare il tessuto. La tecnologia UltraPlex utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati seguiti da un cocktail di anticorpi secondari anti-hapten anti-hapten confluito con fluoroforo. La tecnologia InSituPlex8 utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati in DNA unici che vengono aggiunti contemporaneamente al tessuto seguito da un passo di amplificazione e infine sonde coniugate a fluoroforo che sono complementari a ogni sequenza di DNA unica sull'anticorpo primario. Entrambe queste tecnologie consentono il rilevamento di quattro marcatori più 4',6-diamino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Altri due approcci per la colorazione multiplex simultanea si basano sulla spettrometria di massa iomacisecondaria 9. Hyperion Imaging System utilizza la citometria di massa10 per rilevare fino a 37 marcatori. Questa tecnologia utilizza un cocktail di anticorpi coniugati in metallo per macchiare i tessuti, e specifiche aree dei tessuti sono ablatate da un laser e trasferite in un citometro di massa dove vengono rilevati gli ioni metallici. Un'altra tecnologia simile è l'IONPath, che utilizza la tecnologia di imaging del fascio di ioni multiplexed11. Questa tecnologia utilizza uno strumento di spettrometria di massa modificato e una fonte di ioni di ossigeno invece del laser per ablate gli anticorpi coniugati in metallo. Mentre tutti questi approcci di colorazione multiplex simultanei consentono il rilevamento di più marcatori, i costi per coniugare DNA, apteni o metalli agli anticorpi, la perdita di tessuto a causa dell'ablazione e l'estesa elaborazione delle immagini per lo smistamento non possono essere sottovalutati. Inoltre, i kit e i protocolli di colorazione sono attualmente disponibili solo per i tessuti FFPE e lo sviluppo di pannelli personalizzati comporta tempi e spese aggiuntivi.
Il metodo di colorazione multiplex sequenziale, al contrario, include l'etichettatura del tessuto con un anticorpo a un marcatore, stripping per rimuovere l'anticorpo, seguita da ripetizioni sequenziali di questo processo per etichettare più marcatori12. L'amplificazione del segnale di tirofa (TSA) è il metodo di multiplexing sequenziale più utilizzato. Altre due tecnologie di multiplexing utilizzano una combinazione di metodi di colorazione simultanei e sequenziali. La piattaforma CODEX13 impiega un cocktail di anticorpi coniugati a sequenze uniche di oligonucleotidi di DNA che alla fine vengono etichettate con un fluoroforo utilizzando una fase di polimerizzazione indicizzata seguita dall'imaging, dallo stripping e dalla ripetizione del processo per rilevare fino a 50 marcatori. L'approccio di colorazione multiplex MultiOmyx14 è un'iterazione di colorazione con un cocktail di tre o quattro anticorpi coniugati con fluoroforo, imaging, spegnimento dei fluorofori e ripetizione di questo ciclo per rilevare fino a 60 marcatori su una singola sezione. Simile al metodo di colorazione multiplex simultanea, mentre è possibile rilevare un'ampia gamma di marcatori, il tempo necessario per la colorazione, l'acquisizione dell'immagine, l'elaborazione e l'analisi è ampio. La fase di stripping/spegnimento comporta il riscaldamento e/o lo sbiancamento del campione di tessuto e, pertanto, l'approccio di colorazione multiplex sequenziale viene comunemente eseguito sui tessuti FFPE che mantengono l'integrità dei tessuti al riscaldamento o allo sbiancamento.
La fissazione della formalina e il successivo incorporamento della paraffina vengono prontamente eseguiti in un ambiente clinico, i blocchi di tessuto sono facili da memorizzare e sono disponibili diversi protocolli di colorazione multiplex. Tuttavia, l'elaborazione, l'incorporamento e la deparaffinazione dei tessuti FFPE, così come il recupero dell'antigene15, un processo attraverso il quale gli anticorpi possono accedere meglio agli epitopi, richiede molto tempo. Inoltre, l'elaborazione coinvolta nei tessuti FFPE contribuisce all'autofluorescenza16 e maschera gli epitopi bersaglio, con conseguente variabilità e mancanza di clone di anticorpi disponibili per rilevare gli antigeni nei tessuti FFPE17,18,19. Un esempio è l'antigene di leucocito umano (HLA) di classe I alleli20. Al contrario, lo scatto di congelamento dei tessuti non comporta lunghe fasi di elaborazione prima o dopo il fissaggio, eludendo la necessità di recupero dell'antigene21,22e rendendolo vantaggioso per rilevare una più ampia gamma di obiettivi. Pertanto, l'utilizzo di tessuti congelati per l'imaging a fluorescenza multispettrale può essere utile per rilevare obiettivi per studi preclinici e clinici.
Date le limitazioni di cui sopra quando si utilizzano tessuti FFPE, ci siamo chiesti se l'imaging a fluorescenza multispettrale può essere eseguito su tessuti congelati. Per rispondere a questa domanda, abbiamo testato un metodo di colorazione multiplex simultaneo utilizzando un pannello di anticorpi coniugati a fluoroforo per rilevare più antigeni e analizzato la colorazione utilizzando un sistema di imaging multispettrale semiautomatico. Siamo stati in grado di macchiare simultaneamente fino a sei marcatori in una singola sezione di tessuto entro 90 min.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

L'imaging a fluorescenza multispettrale su tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) consente di rilevare più marcatori in un singolo campione di tessuto in grado di fornire informazioni sulla coespressione dell'antigene e sulla distribuzione spaziale dei marcatori. Tuttavia, la mancanza di anticorpi adatti per i tessuti fissati in formalina può limitare la natura dei marcatori che possono essere rilevati. Inoltre, il metodo di colorazione richiede molto tempo. Qui descriviamo un metodo rapido per eseguire l'imaging a fluorescenza multispettrale sui tessuti congelati. Il metodo include le combinazioni di fluoroforo utilizzate, passaggi dettagliati per la colorazione dei tessuti congelati del topo e dell'uomo e le procedure di scansione, acquisizione e analisi. Per l'analisi della colorazione, viene utilizzato un sistema di imaging a fluorescenza multispettrale semiautomatico disponibile in commercio. Attraverso questo metodo, fino a sei diversi marcatori sono stati macchiati e rilevati in una singola sezione di tessuto congelato. Il software di analisi dell'apprendimento automatico può fenotipo le cellule che possono essere utilizzate per l'analisi quantitativa. Il metodo qui descritto per i tessuti congelati è utile per il rilevamento di marcatori che non possono essere rilevati nei tessuti FFPE o per i quali anticorpi non sono disponibili per i tessuti FFPE.

Rilevamento di marcatori a macchia singola su sezioni di milza congelate Poiché il sistema di imaging semiautomatico utilizza un sistema di filtri regolabili a cristalli liquidi (LCTF) che consente una più ampia gamma di rilevamento della lunghezza d'onda25, e poiché non sono stati eseguiti passaggi di amplificazione del segnale qui, abbiamo prima ottimizzato il rilevamento dei nostri anticorpi coniugati primari per ogni marcatore al microscopio. Un esempio è illustrato nel...

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A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Questo metodo è utile per rilevare e co-localizzare più biomarcatori in una singola criosezione, inclusi marcatori che normalmente non sono rilevabili nelle sezioni di paraffina. Utilizzando questo metodo di colorazione sperimentale, il tempo di colorazione è significativamente ridotto e il metodo può essere eseguito in qualsiasi laboratorio. A dimostrare questo metodo sarà Dinesh Jaishankar.È un abile postdoc del laboratorio, e anche il nucleo di valutazione dell'immunoterapia, responsabile delle strutture. Quando si selezionano gli anticorpi per l'analisi, considerare i set di filtri di eccitazione ed emissione disponibili sul sistema di imaging semi-automatizzato. E dopo aver testato varie combinazioni di anticorpi primari coniugati al fluoroforo, preparate i fluorofori da utilizzare in modo da avere una sovrapposizione spettrale minima come suggerito nella tabella.Per la colorazione multiplex, preparare un cocktail di anticorpi con fluorofori compatibili a delusioni ottimali predeterminate e aggiungere il cocktail alle sezioni tissutali di interesse. Per la colorazione a marcatore singolo, aggiungere l'anticorpo coniugato primario solo alla diapositiva. Per tutte le colorazioni, includere uno scivolo non macchiato di controllo che subisce la stessa procedura di colorazione senza l'aggiunta di un anticorpo coniugato primario.Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce, lavare gli scivoli due volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, ricollere le diapositive macchiate multiplex con DAPI per sette minuti a temperatura ambiente protette dalla luce, seguite da due lavaggi di cinque minuti in PBS. Per creare una libreria spettrale, impostare la potenza della lampada del sistema di imaging multispettrale sul 100% e aprire il software operativo al microscopio.Selezionare Modifica protocollo e nuovo protocollo. Immettere un nome di protocollo e selezionare Fluorescenza in modalità di imaging. Quindi fornire un nome di studio e caricare le singole diapositive macchiate sul palco.Fate clic su Modifica esposizione (Edit Exposure) e utilizzate le opzioni messa a fuoco automatica ed esposizione automatica per regolare i tempi di esposizione e acquisire istantanee per le singole diapositive macchiate. Dopo aver imaging delle singole diapositive macchiate, salvare il protocollo. E nel software di machine learning sotto la scheda Build Library, carica ogni singola immagine macchiata.Selezionare il piano appropriato e fare clic su Estrai. Il software estrae automaticamente il segnale fluorescente selezionato nel pavimento. Per salvare il colore estratto, fare clic su Salva per archiviare.È possibile creare un nuovo gruppo o archiviare il colore estratto in un gruppo esistente. Per l'imaging multispettrale, una volta creata e verificata la libreria spettrale, regolare la messa a fuoco e i tempi di esposizione sulla diapositiva macchiata multiplex come dimostrato e aprire diapositive digitalizzate per creare una nuova attività. Fornire un ID diapositiva e selezionare un protocollo.In Attività selezionare l'analisi dell'intera diapositiva per eseguire un'analisi completa delle diapositive nella diapositiva macchiata multiplex. Nell'intera immagine di scansione delle diapositive selezionare le aree di interesse nell'immagine. Queste aree verranno scansionate utilizzando i tempi di esposizione impostati in precedenza sulla diapositiva multiplex da utilizzare per l'unmixing spettrale e l'analisi.Nel software operativo al microscopio selezionare acquisisci campi MSI in attività, quindi fare clic su Process Slide per acquisire aree di interesse con un ingrandimento di 20x. Una volta acquisite le aree di interesse, nel software di machine learning fare clic su File e Apri nella scheda analisi manuale per caricare le immagini macchiate multiplex. Selezionate l'origine della libreria spettrale e fate clic su Seleziona piani (Select Floors) per scegliere la libreria spettrale salvata in precedenza.Fare clic su File e apri per caricare l'immagine non macchiata. Quindi fare clic sull'icona del marcatore di inchiostro ad autofluorescenza e disegnare una linea o un'area nella diapositiva non macchiata per identificare l'autofluorescenza all'interno del tessuto. Quindi, nella scheda Modifica marcatori e colori assegnare i nomi per ogni marcatore e fare clic su Prepara tutto.Dopo aver verificato l'immagine spettralmente non mixata, nel software di machine learning, selezionare le opzioni di membrana citoplasmatica e marcatore dal pannello. E usando il pulsante con i puntini di sospensione, selezionare usa questo segnale per trovare, per configurare il marcatore per rilevare i nuclei, il citoplasma o la membrana. quando si sceglie un marcatore citoplasmatico o a membrana, selezionare l'opzione Usa il segnale per facilitare la scissione nucleare.Il software rileverà e creerà automaticamente maschere individuali per il nucleo, il citoplasma e la membrana. Utilizzare la visualizzazione patologia per un marcatore specifico e le opzioni di configurazione nel software per regolare le maschere e fare clic su Segmento tutto per creare una mappa di segmentazione cellulare. Dopo la segmentazione delle celle, selezionare i marcatori per fenotipare le celle positive.Inoltre, selezionare almeno cinque celle non macchiate con il marcatore scelto per fenotipare le celle negative. Quindi fare clic su Addestra classificatore per addestrare il software per rilevare automaticamente tutte le celle macchiate con i marcatori selezionati all'interno dell'immagine. Verrà creata una mappa fenotipo.Come dimostrano queste immagini, gli anticorpi convalidati per la citometria a flusso potrebbero essere utilizzati per visualizzare la colorazione dei tessuti utilizzando il filtro tonnibile a cristalli liquidi nel sistema di imaging semi-automatizzato. Qui si può osservare un'immagine spettralmente non mixata della tonsille umana congelata che include l'etichettatura delle cellule B e delle cellule proliferanti all'interno del centro germinale follicolare e la regione inter follicolare delle cellule T. L'opzione visualizzazioni patologia consente la visualizzazione del modello di colorazione individuale per ogni marcatore all'interno del tessuto di interesse, suggerendo che il metodo di colorazione multiplex e l'imaging spettrale funzionano sul tessuto congelato.Come dimostrato su una sezione tumorale del topo congelata, l'imaging multispettrale può anche essere utilizzato per visualizzare le cellule T infiltrazioni tumorali e altre lignaggi delle cellule mieloidi tra cui macrofagi associati al tumore. È possibile generare mappe di segmentazione cellulare e fenotipo e il numero di celle macchiate per ogni marcatore analizzato dal software, dimostrando che il software può essere utilizzato per la quantificazione della colorazione multispettrale sui tessuti congelati. Per qualcuno di nuovo 6 alla tecnica, è importante conoscere le caratteristiche specifiche dei fluorocromi e preparare diapositive della libreria di qualità per l'unmixing spettrale con sovrapposizione spettrale minima.È anche importante eseguire la titolazione degli anticorpi. A nostro avviso, questo metodo può fornire informazioni sul comodino sull'efficacia dell'immunoterapia per il cancro e altre applicazioni terapeutiche, in particolare quando la tempistica è essenziale.

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