Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
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イメージングと分析のガイダンスは、イリノイ大学シカゴ校の研究資料研究センター、研究組織イメージングコアによって提供され、研究担当副首相の事務所の支援を受けて設立されました。この研究は、NIH/NCI RO1CA191317からCLP、NIH/NIAMS(SBDRCはA.パラー博士に対して1P30AR075049-01)、ロバート・H・ルーリー総合がんセンターのノースウェスタン大学免疫療法評価コアの支援によって支えられた。

マウス脾臓およびHLF16マウス腫瘍組織23は、当研究室から得られた。ヒト扁桃組織は、市販業者から購入した。詳細については、資料一覧を参照してください。
1. 組織埋め込み
<ol><li>新しい組織をOCT(最適な切断温度)溶液に埋め込み、ドライアイスまたは液体窒素を使用して凍結します。</li>
	<li>組織を-80°Cで保存する。</li>
</ol><p class="jove_...

凍結組織は、従来から直接的および間接的な方法32を用いて組織上の3〜4個のマーカー31を検出するmIFイメージングに広く使用されてきた。直接法では、抗体は組織を標識するために蛍光色素または量子ドット33に結合し、一方、間接的な方法では、組織に対して一次抗体を特異的に認識するフルオロフォア共役二次抗体が続く組織を標識?...

顕微鏡イメージング技術の最近の進歩は、生物学的プロセスおよび疾患状態に関する我々の知識と理解を大幅に向上させました。染色原性免疫組織化学(IHC)を介した組織中のタンパク質のインサイチュ検出は、病理において日常的に行われている。しかし、発泡IHC染色を用いた複数のマーカーの検出は、1つ以上の新しい方法で多重免疫蛍光(mIF)染色法を用い、複数の生物学的マーカーが単一の組織サンプル上に標識され、開発されている。複数の生体マーカーの検出は、組織アーキテクチャ、細胞の空間分布、および抗原共発現に関する情報がすべて単一の組織試料2に捕捉されるため有用である。マルチスペクトル蛍光イメージング技術を用いることが、複数の生物学的マーカーの検出を可能にしました。この技術では、個々の蛍光色素の蛍光スペクトルを個別の蛍光スペクトルに特異的な光学を用いて、分離したり「混合しない」と、スペクトルクロストーク3を一切起らなく複数のマーカーを検出することを可能にする。マルチスペクトル蛍光イメージングは、細胞生物学、前臨床薬の開発、臨床病理学、および腫瘍免疫プロファイリング44、5、65,6において重要なアプローチになりつつある。重要なことに、免疫細胞(具体的にはCD8 T細胞)の容量分布は、既存の腫瘍7を有する患者の予後因子として機能し得る。
多重蛍光染色に対する様々なアプローチが開発されており、同時または順次に行うことができます。同時染色法では、すべての抗体をカクテルとして一回のステップで添加し、組織にラベルを付けます。UltraPlex技術は、ハプテン共役一次抗体のカクテルに続いて、フルオロフォア共役抗ハプテン二次抗体のカクテルを使用します。InSituPlex技術8は、組織に同時に付加されるユニークなDNA共役一次抗体のカクテルを使用し、その後に増幅ステップを行い、最後に一次抗体上の各固有DNA配列を補完するフルオロフォア共役プローブを用いる。これらの技術は、4つのマーカーに加えて、核染色のための4',6-diamino-2-フェニリンドール(DAPI)を検出することを可能にする。同時多重染色のための他の2つのアプローチは、二次イオン質量分析9に基づいています。Hyperion Imaging システムは、イメージング質量サイトメトリー10を使用して、最大 37 個のマーカーを検出します。この技術は、組織を染色するために金属共役抗体のカクテルを使用し、組織の特定の領域はレーザーによってアブレートされ、金属イオンが検出される質量サイトメーターに移されます。もう一つの同様の技術は、多重化イオンビームイメージング技術11を使用するIONPathです。この技術は、金属共役抗体をアブラクトするためにレーザーの代わりに、変性質量分析計装置と酸素イオン源を使用します。これらすべての同時多重染色法により、複数のマーカーの検出が可能になりますが、DNA、ハプテン、または金属を抗体に結合するためのコスト、アブレーションによる組織の喪失、および混合解除のための広範な画像処理を過小評価することはできません。さらに、キットおよび染色の議定書はFFPEティッシュのために現在だけ利用でき、カスタムパネルを開発することは付加的な時間および支出を伴う。
シーケンシャル多重染色法には、対照的に、抗体を用いた組織を1つのマーカーに標識し、除去して抗体を除去し、続いてこのプロセスの逐次反復を行い、複数のマーカー12を標識する。このチラミド信号増幅(TSA)は、最も頻繁に使用される逐次多重化法である。他の2つの多重化技術は、同時染色法と逐次染色法の組み合わせを使用します。CODEXプラットフォーム13は、インデックス化された重合ステップを使用して最終的にフルオロフォアで標識されるユニークなDNAオリゴヌクレオチド配列に結合した抗体のカクテルを採用し、その後、最大50個のマーカーを検出するプロセスを繰り返します。MultiOmyx多重染色アプローチ14は、3〜4個のフルオロフォア共役抗体のカクテルで染色し、イメージング、蛍光ホルを焼入れ、このサイクルを繰り返して単一のセクションで最大60個のマーカーを検出する反復である。同時多重染色法と同様に、広範囲のマーカーを検出できる一方で、染色、画像取得、処理、および分析に関わる時間は広範囲に及ぶ。ストリッピング/クエンチングステップは、組織サンプルの加熱および/または漂白を伴い、加熱または漂白時に組織の完全性を維持するFFPE組織に対してシーケンシャルな多重染色アプローチが一般的に行われます。
ホルマリン固定およびそれに続くパラフィン埋め込みは臨床現場で容易に行われ、組織ブロックは保存しやすく、複数の多重染色プロトコルが利用可能である。しかしながら、FFPE組織の処理、埋め込み、および脱パラフィン化、ならびに抗原検索15は、抗体がエピトープに良好にアクセスできるプロセスに、時間がかかる。さらに、FFPE組織に関与する処理は、自己蛍光16およびマスク標的エピトープに寄与し、FFPE組織17、18、1918,19における抗原を検出するために利用可能な抗体クローンのばら17つきおよび欠如をもたらす。例としては、ヒト白血球抗原(HLA)クラスIアレル20である。対照的に、組織のスナップ凍結は、固定前または後に広範な処理ステップを伴わない、抗原検索21、22の必要性を回避し、22より広い範囲の標的を検出するのに有益である。したがって、マルチスペクトル蛍光イメージングに凍結組織を用い、前臨床および臨床研究の標的を検出する価値がある。
FFPE組織を用いた上述の制限を踏まえると、冷凍組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行うことができるかどうか尋ねた。この問題に対処するため、複数の抗原を検出するフルオロフォア共役抗体のパネルを用いて同時多重染色法を試験し、半自動マルチスペクトルイメージングシステムを用いて染色を解析した。90分以内に1つの組織セクションで最大6つのマーカーを同時に染色することができました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織上のマルチスペクトル蛍光イメージングは、抗原共発現およびマーカーの空間分布に関する情報を提供できる単一の組織サンプル内の複数のマーカーの検出を可能にする。しかしながら、ホルマリン固定組織に対する適切な抗体の欠如は、検出できるマーカーの性質を制限する可能性がある。また、染色方法は時間がかかります。ここでは、凍結組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行う迅速な方法について説明する。この方法には、使用されるフルオロフォアの組み合わせ、マウスおよびヒト凍結組織の染色に関する詳細なステップ、およびスキャン、取得、および分析手順が含まれる。染色解析には、市販の半自動マルチスペクトル蛍光イメージングシステムが使用されている。この方法を通じて、1つの凍結組織セクションで最大6つの異なるマーカーが染色され、検出された。機械学習解析ソフトウェアは、定量分析に使用できる表現型細胞を使用できます。ここで説明する凍結組織の方法は、FFPE組織では検出できないマーカーや、FFPE組織に対して抗体が利用できないマーカーの検出に有用である。

凍結した脾臓セクション上の単染色マーカーの検出 半自動撮像システムは、より広い範囲の波長検出25を可能にする液晶調整フィルター(LCTF)システムを使用し、ここで信号増幅ステップが行われなかったため、まず顕微鏡上の各マーカーに対して一次共役抗体の検出を最適化しました。図1に示す例を示し、各単色マーカーは疑似色の赤?...

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A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

この方法は、パラフィンセクションでは通常検出できないマーカーを含む単一のクライオセクション内の複数のバイオマーカーを検出し、共局化するのに役立ちます。この実験染色法を用い、染色時間が大幅に短縮され、どの研究室でも実施できます。この方法のデモンストレーションはディネシュ・ジャイシャンカルです。彼は研究室の熟練したポスドクであり、免疫療法評価コア、施設マネージャーでもあります。分析用の抗体を選択する場合は、半自動イメージングシステムで利用可能な励起フィルタと発光フィルタセットを検討してください。また、フルオロフォア結合された一次抗体の様々な組み合わせをテストした後、表に示されているようにスペクトルの重複を最小限に抑えるためにフルオロフォアを調製します。多重染色の場合は、所定の最適妄想で相性の高いフルオロフォアを有する抗体のカクテルを調製し、目的の組織セクションにカクテルを加えます。単一マーカー染色の場合は、一次共役抗体のみをスライドに追加します。すべての染色に対して、一次共役抗体を添加することなく同じ染色手順を経るコントロール未染色スライドが含まれる。光から保護された室温で1時間のインキュベーションの後、PBSで2回、1回の洗浄で5分間洗浄します。2回目の洗浄後、DAPIで多重染色スライドを光から保護された室温で7分間カウンター染色し、続いてPBSで5分間洗浄します。スペクトルライブラリを作成するには、マルチスペクトルイメージングシステムのランプパワーを100%に設定し、顕微鏡動作ソフトウェアを開きます。[プロトコルの編集] と [新しいプロトコル] を選択します。プロトコル名を入力し、イメージングモードで蛍光を選択します。次に、スタディ名を指定し、単一の染色されたスライドをステージにロードします。露出を編集をクリックし、自動焦点と自動公開オプションを使用して露出時間を調整し、単一の染色されたスライドのスナップショットを取得します。単一の染色されたスライドを撮像した後、プロトコルを保存します。また、ビルドライブラリのタブの下の機械学習ソフトウェアで、各単一の染色された画像をロードします。適切なフロアを選択し、[抽出]をクリックします。ソフトウェアは、フロアで選択された蛍光信号を自動的に抽出します。抽出した色を保存するには、[保存] をクリックして保存します。新しいグループを作成するか、抽出した色を既存のグループに保存できます。マルチスペクトルイメージングの場合、スペクトルライブラリを作成して検証したら、多重染色スライドのフォーカスと露出時間を調整し、スキャンしたスライドを開いて新しいタスクを作成します。スライド ID を指定し、プロトコルを選択します。[タスク] で、スライド スキャン全体を選択して、マルチプレックススライドでスライド全体のスキャンを実行します。スライド スキャン イメージ全体で、画像全体の対象地域を選択します。これらの領域は、スペクトルの非混合および分析に使用される多重スライド上で以前に設定された露出時間を使用してスキャンされます。顕微鏡操作ソフトウェアで、タスクの下で MSI フィールドを取得するを選択し、[スライドを処理] をクリックして、20 倍の倍率で対象領域を取得します。対象地域を取得したら、機械学習ソフトウェアで、[手動解析] タブの [ファイルとオープン] をクリックして、マルチプレックス染色画像をロードします。スペクトル ライブラリ ソースを選択し、[床を選択]をクリックして、以前に保存したスペクトル ライブラリを選択します。[ファイル]をクリックして[開く]をクリックして、未染色イメージをロードします。次に、自己蛍光インクマーカーアイコンをクリックし、未染色スライド上に線または領域を描き、組織内の自己蛍光を識別します。次に、[マーカーと色の編集] タブで、各マーカーの名前を割り当てて[すべて準備]をクリックします。スペクトル的に混合されていない画像を検証した後、機械学習ソフトウェアで、パネルから細胞質膜とマーカーのオプションを選択します。そして、省略記号ボタンを使用して、この信号を使用して、核、細胞質または膜のいずれかを検出するようにマーカーを設定するために選択します。細胞質または膜マーカーを選択した場合は、「シグナルを使用して核分裂を支援する」オプションを選択します。ソフトウェアは自動的に核、細胞質および膜のための個々のマスクを検出し、作成する。特定のマーカーの病理ビューとソフトウェアの設定オプションを使用してマスクを調整し、[セグメント全体]をクリックしてセルセグメンテーションマップを作成します。細胞のセグメンテーションの後、正のセルを表現するマーカーを選択します。さらに、選択したマーカーで染色されていないセルを少なくとも 5 つ選択して、負のセルを表現します。次に、[分類器のトレーニング] をクリックして、イメージ内で選択したマーカーで染色されたすべてのセルを自動的に検出するようにソフトウェアをトレーニングします。表現型マップが作成されます。これらの画像が示すように、フローサイトメトリーについて検証された抗体は、半自動イメージングシステムの液晶チューナブルフィルターを使用して組織染色を可視化するために使用することができます。ここで、凍結したヒト扁桃のスペクトル的に混ざっていない画像は、濾胞性胚中心内のB細胞および増殖細胞の標識、および濾胞間T細胞領域を含む観察することができる。病理ビューオプションは、対象組織内の各マーカーの個々の染色パターンの可視化を可能にし、多重染色法およびスペクトルイメージングが凍結組織に働くことを示唆している。凍結マウス腫瘍セクションで示されるように、マルチスペクトルイメージングは、腫瘍浸潤T細胞、および腫瘍関連マクロファージを含む他の骨髄細胞系統を視覚化するためにも使用することができる。細胞のセグメンテーションおよび表現型マップ、およびソフトウェアによって解析された各マーカーの染色細胞数を生成することができ、凍結組織上のマルチスペクトル染色の定量にソフトウェアを使用できることを実証する。新しい6toの技術のために、あなたのフルオロクロムの特定の特徴を知り、最小限のスペクトルオーバーラップでスペクトルをアンミックスするための品質ライブラリスライドを準備することが重要です。抗体の滴定を行うことも重要です。我々の意見では、この方法は、特にタイミングが本質である場合、癌および他の治療用途のための免疫療法の有効性に関するベッドサイド情報を提供することができる。

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