Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
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A orientação de imagem e análise foi fornecida pelo Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core da Universidade de Illinois em Chicago, criado com o apoio do escritório do Vice-Chanceler para Pesquisa. O trabalho foi apoiado pelo NIH/NCI RO1CA191317 ao CLP, pelo NIH/NIAMS (subvenção da SBDRC 1P30AR075049-01) ao Dr. A. Paller, e pelo apoio do Centro De Câncer Integral Robert H. Lurie ao Núcleo de Avaliação de Imunoterapia da Universidade Northwestern.

Os tecidos tumorais de camundongos e hlf1623 foram obtidos em nosso laboratório. O tecido de amígdalas humanas foi comprado de um vendedor comercial. Os detalhes estão fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Incorporação de tecidos
<ol><li>Incorpore tecido fresco na solução OCT (temperatura de corte ideal) e congele o snap usando gelo seco ou nitrogênio líquido.</li>
	<li>Armazene tecidos a -80 °C.</li>
</ol>2. Criosecç?...

Os tecidos congelados têm sido amplamente utilizados para a imagem mIF para detectar tradicionalmente três a quatro marcadores31 em um tecido usando o método direto e indireto32. No método direto, os anticorpos são conjugados a corantes fluorescativos ou pontos quânticos33 para rotular o tecido, enquanto no método indireto, um anticorpo primário não conjugado é usado para rotular o tecido seguido por um anticorpo secundário conjugado com f...

Os recentes avanços em técnicas de imagem microscópica melhoraram significativamente nosso conhecimento e compreensão dos processos biológicos e estados de doenças. In situ detecção de proteínas em tecidos via imunohistoquímica cromogênica (IHC) é realizada rotineiramente na patologia. No entanto, a detecção de múltiplos marcadores usando a coloração cromogênica do IHC está desafiando1 e métodos mais novos para usar abordagens de coloração multiplex imunofluorescência (mIF), onde vários marcadores biológicos são rotulados em uma única amostra de tecido, estão sendo desenvolvidos. A detecção de múltiplos marcadores biológicos é útil, pois as informações relacionadas à arquitetura tecidual, distribuição espacial das células e co-expressão de antígenos são capturadas em uma única amostra de tecido2. O uso da tecnologia de imagem de fluorescência multiespectral tornou possível a detecção de múltiplos marcadores biológicos. Nesta tecnologia, utilizando óptica específica, o espectro de fluorescência de cada fluoróforo individual pode ser separado ou "não misturado", permitindo a detecção de múltiplos marcadores sem qualquer crosstalk espectral3. A imagem de fluorescência multiespectral está se tornando uma abordagem crítica na biologia celular, desenvolvimento de fármacos pré-clínicos, patologia clínica e perfil imunológico do tumor4,5,6. É importante ressaltar que a distribuição espaçada das células imunes (especificamente as células CD8 T) pode servir como fator prognóstico para pacientes com tumores existentes7.
Várias abordagens para a coloração de fluorescência multiplex foram desenvolvidas e podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente. No método de coloração simultânea, todos os anticorpos são adicionados como um coquetel em um único passo para rotular o tecido. A tecnologia UltraPlex usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com hapten seguido de um coquetel de anticorpos secundários anti-hapten conjugados com fluoroforre. A tecnologia InSituPlex8 usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com DNA únicos que são simultaneamente adicionados ao tecido seguido de um passo de amplificação e finalmente sondas conjugadas com fluoroforre que são complementares a cada seqüência de DNA única no anticorpo primário. Ambas as tecnologias permitem a detecção de quatro marcadores mais 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Duas outras abordagens para coloração multiplex simultânea são baseadas na espectrometria de massa de íons secundária9. O Sistema de Imagem Hyperion usa citometria de massa de imagem10 para detectar até 37 marcadores. Esta tecnologia usa um coquetel de anticorpos conjugados em metal para manchar os tecidos, e áreas específicas dos tecidos são ablatadas por um laser e transferidas para um citómetro de massa onde os íons metálicos são detectados. Outra tecnologia semelhante é o IONPath, que usa tecnologia de imagem de feixe de íons multiplexados11. Esta tecnologia usa um instrumento de espectrometria de massa modificado e uma fonte de íons de oxigênio em vez de laser para abpartir os anticorpos conjugados com metal. Embora todas essas abordagens simultâneas de coloração multiplex permitam a detecção de múltiplos marcadores, os custos envolvidos para conjugar DNA, haptens ou metais a anticorpos, a perda de tecido devido à ablação e o processamento extensivo de imagem para desmisturanão não podem ser subestimados. Além disso, kits e protocolos de coloração estão atualmente disponíveis apenas para tecidos FFPE e o desenvolvimento de painéis personalizados implica tempo e gastos adicionais.
O método sequencial de coloração multiplex, em contraste, inclui rotular o tecido com um anticorpo para um marcador, descascando para remover o anticorpo, seguido por repetições seqüenciais deste processo para rotular múltiplos marcadores12. A amplificação do sinal de tyramide (TSA) é o método de multiplexação seqüencial mais utilizado. Duas outras tecnologias de multiplexação usam uma combinação de métodos de coloração simultâneas e seqüenciais. A plataforma CODEX13 emprega um coquetel de anticorpos conjugados a sequências únicas de DNA oligonucleotídeo que são eventualmente rotulados com um fluoróforo usando uma etapa de polimerização indexada seguida de imagem, descascamento e repetição do processo para detectar até 50 marcadores. A abordagem de coloração multiplex MultiOmyx14 é uma iteração de coloração com um coquetel de três a quatro anticorpos conjugados com fluoroformes, imagem, saciação dos fluoróforos, e repetindo este ciclo para detectar até 60 marcadores em uma única seção. Semelhante ao método de coloração multiplex simultâneo, enquanto uma ampla gama de marcadores pode ser detectada, o tempo envolvido na coloração, aquisição de imagens, processamento e análise é extenso. A etapa de descascamento/saciedade envolve aquecimento e/ou branqueamento da amostra de tecido e, portanto, a abordagem sequencial de coloração multiplex é comumente realizada em tecidos FFPE que mantêm a integridade do tecido ao aquecer ou branquear.
A fixação da formalina e a incorporação subseqüente de parafina são prontamente realizadas em um ambiente clínico, blocos de tecido são fáceis de armazenar e vários protocolos de coloração multiplex estão disponíveis. No entanto, o processamento, incorporação e deparafinação dos tecidos de FFPE, bem como a recuperação de antígenos15, um processo pelo qual os anticorpos podem acessar melhor os epítopos, é demorado. Além disso, o processamento envolvido nos tecidos ffpe contribui para a autofluorescência16 e mascara epitopes-alvo, resultando na variabilidade e falta de clone de anticorpos disponíveis para detectar antígenos nos tecidos FFPE17,18,19. Um exemplo é o antígeno leucócito humano (HLA) classe I alelos20. Em contraste, o congelamento instantâneo de tecidos não envolve etapas de processamento extensivas antes ou depois da fixação, contornando a necessidade de recuperação de antígenos21,22, e tornando-o benéfico para a detecção de uma gama mais ampla de alvos. Portanto, o uso de tecidos congelados para imagens de fluorescência multiespectrais pode ser valioso para detectar alvos para estudos pré-clínicos e clínicos.
Dadas as limitações acima mencionadas ao usar tecidos FFPE, perguntamos se a imagem de fluorescência multiespectral pode ser realizada em tecidos congelados. Para responder a essa questão, testamos um método de coloração multiplex simultâneo usando um painel de anticorpos conjugados com fluoroforo para detectar múltiplos antígenos e analisamos a coloração usando um sistema de imagem multiespectral semi-automatizado. Conseguimos simultaneamente manchar até seis marcadores em uma única seção de tecido dentro de 90 minutos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

Imagens multiespectrais de fluorescência em tecidos parafina-fixados em parafina (FFPE) permitem a detecção de múltiplos marcadores em uma única amostra de tecido que pode fornecer informações sobre coexpressão de antígeno e distribuição espacial dos marcadores. No entanto, a falta de anticorpos adequados para tecidos formalin-fixos pode restringir a natureza dos marcadores que podem ser detectados. Além disso, o método de coloração é demorado. Aqui descrevemos um método rápido para realizar imagens de fluorescência multiespectral em tecidos congelados. O método inclui as combinações de fluoróforos utilizadas, etapas detalhadas para a coloração de camundongos e tecidos congelados humanos e os procedimentos de varredura, aquisição e análise. Para análise de coloração, é utilizado um sistema de imagem multiespectral multiespectral semiautomatizado disponível comercialmente. Através deste método, até seis marcadores diferentes foram manchados e detectados em uma única seção de tecido congelado. O software de análise de aprendizado de máquina pode fenótipo células que podem ser usadas para análise quantitativa. O método descrito aqui para tecidos congelados é útil para a detecção de marcadores que não podem ser detectados em tecidos FFPE ou para os quais os anticorpos não estão disponíveis para os tecidos FFPE.

Detecção de marcadores manchados únicos em seções congeladas do baço Como o sistema de imagem semi-automatizado usa um sistema de filtro de cristal líquido (LCTF) que permite uma gama mais ampla de detecção de comprimento de onda25, e como não foram realizadas etapas de amplificação de sinal aqui, primeiro otimizamos a detecção de nossos anticorpos conjugados primários para cada marcador no microscópio. Um exemplo é mostrado na Figura 1,</s...

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A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Este método é útil para detectar e co-localizar vários biomarcadores em uma única criosecção, incluindo marcadores que normalmente não são detectáveis em seções de parafina. Usando este método experimental de coloração, o tempo de coloração é significativamente reduzido e o método pode ser realizado em qualquer laboratório. Demonstrando este método será Dinesh Jaishankar.Ele é um pós-doutor qualificado do laboratório, e também o Núcleo de Avaliação de Imunoterapia, Gerente de Instalações. Ao selecionar anticorpos para a análise, considere os conjuntos de filtros de excitação e emissão disponíveis no sistema de imagem semi-automatizado. E depois de testar várias combinações de anticorpos primários conjugados fluoróforos, prepare fluoroforos para serem usados para que você tenha uma sobreposição espectral mínima como sugerido na tabela.Para coloração multiplex, prepare um coquetel de anticorpos com fluoroforos compatíveis em delírios ótimos predeterminados e adicione o coquetel às seções de tecido de interesse. Para coloração de marcador único, adicione o anticorpo conjugado primário apenas ao slide. Para todas as manchas, inclua um controle de lâmina não manchada que passa pelo mesmo procedimento de coloração sem a adição de um anticorpo conjugado primário.Depois de uma incubação de uma hora à temperatura ambiente protegida da luz, lave os slides duas vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Após a segunda lavagem, manche os slides manchados de multiplex com DAPI por sete minutos à temperatura ambiente protegidos da luz, seguido por duas lavagens de cinco minutos em PBS. Para criar uma biblioteca espectral, defina o poder da lâmpada do sistema de imagem multiespectral para 100% e abra o software operacional do microscópio.Selecione Editar protocolo e novo protocolo. Digite um nome de protocolo e selecione Fluorescência no modo de imagem. Em seguida, forneça um nome de estudo e carregue os slides manchados no palco.Clique em Editar exposição e use as opções de foco automático e exposição automática para ajustar os tempos de exposição e adquirir instantâneos para os slides manchados únicos. Depois de fotografar os slides manchados, salve o protocolo. E no software de aprendizado de máquina sob a guia da Biblioteca Build, carregue cada imagem manchada.Selecione o piso apropriado e clique em Extrair. O software extrairá automaticamente o sinal fluorescente selecionado no piso. Para salvar a cor extraída, clique em Salvar para armazenar.Um novo grupo pode ser criado ou a cor extraída pode ser armazenada em um grupo existente. Para imagens multiespectrais, uma vez que a biblioteca espectral tenha sido criada e verificada, ajuste o foco e os tempos de exposição no slide manchado multiplex como demonstrado e abra slides digitalizados para criar uma nova tarefa. Forneça um ID de slides e selecione um protocolo.Em tarefa, selecione a varredura completa de slides para realizar uma varredura de slides inteira no slide manchado multiplex. Em toda a imagem de varredura de slides, selecione regiões de interesse através da imagem. Essas regiões serão digitalizadas usando os tempos de exposição previamente definidos no slide multiplex a ser usado para descompração e análise espectral.No software operacional do microscópio, selecione adquirir campos MSI sob tarefa e, em seguida, clique em Process Slide para adquirir regiões de interesse em uma ampliação de 20x. Uma vez adquiridas as regiões de interesse, no software de aprendizado de máquina, clique em Arquivo e Abra sob a guia de análise manual para carregar as imagens manchadas de multiplex. Selecione a fonte da biblioteca espectral e clique em Selecionar andares para escolher a biblioteca espectral previamente salva.Clique em Arquivo e Abra para carregar a imagem não manchada. Em seguida, clique no ícone do marcador de tinta de autofluorescência e desenhe uma linha ou região no slide não manchado para identificar a autofluorescência dentro do tecido. Em seguida, na guia Editar marcadores e cores, atribua nomes para cada marcador e clique em Preparar tudo.Depois de verificar a imagem espectralmente não misturada, no software de aprendizado de máquina, selecione as opções de membrana de citoplasma e marcador do painel. E usando o botão elipsia, selecione usar este sinal para encontrar, para configurar o marcador para detectar os núcleos, citoplasma ou membrana. quando um marcador citoplasmado ou membrana for escolhido, selecione Usar o sinal para auxiliar na opção de divisão nuclear.O software detectará e criará automaticamente máscaras individuais para o núcleo, citoplasma e membrana. Use a visualização de patologia para um marcador específico e as opções de configuração no software para ajustar as máscaras e clique em Segment All para criar um mapa de segmentação celular. Após a segmentação celular, selecione os marcadores para fenótipo das células positivas.Além disso, selecione pelo menos cinco células que não estão manchadas com o marcador escolhido para fenótipo das células negativas. Em seguida, clique em Treinar Classificador para treinar o software para detectar automaticamente todas as células manchadas com os marcadores selecionados dentro da imagem. Um mapa de fenótipo será criado.Como essas imagens demonstram, anticorpos validados para citometria de fluxo poderiam ser usados para visualizar a coloração tecidual usando o filtro de cristal líquido no sistema de imagem semi-automatizado. Aqui pode-se observar uma imagem espectralmente demilada humana congelada que inclui rotulagem de células B e células proliferantes dentro do centro germinais folicular, e a região inter folicular de células T. A opção de visualização patológica permite a visualização do padrão de coloração individual para cada marcador dentro do tecido de interesse, sugerindo que o método de coloração multiplex e a imagem espectral funcionam em tecido congelado.Como demonstrado em uma seção de tumor de camundongos congelados, imagens multiespectrais também podem ser usadas para visualizar tumores infiltrando células T, e outras linhagens de células mieloides, incluindo macrófagos associados ao tumor. Podem ser gerados mapas de segmentação celular e fenótipo, e o número de células manchadas para cada marcador analisado pelo software, demonstrando que o software pode ser usado para quantificação da coloração multiespectral em tecidos congelados. Para alguém novo 6para a técnica, é importante conhecer as características específicas de seus fluorochromes, e preparar slides de biblioteca de qualidade para descomprturar espectral com sobreposição espectral mínima.Também é importante realizar titulação de anticorpos. Em nossa opinião, este método pode fornecer informações sobre a eficácia da imunoterapia para câncer e outras aplicações terapêuticas, especialmente quando o tempo é essencial.

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