Name: a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00
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La guía de imágenes y análisis fue proporcionada por el Centro de Recursos de Investigación – Investigación histológica y núcleo de imágenes de tejidos en la Universidad de Illinois en Chicago establecido con el apoyo de la oficina del Vicecanciller de Investigación. El trabajo fue apoyado por NIH/NCI RO1CA191317 a CLP, por NIH/NIAMS (SBDRC otorgan 1P30AR075049-01) al Dr. A. Paller, y por el apoyo del Centro Integral del Cáncer Robert H. Lurie al Núcleo de Evaluación de Inmunoterapia en la Universidad Northwestern.

El bazo de ratón y los tejidos tumorales de ratón HLF1623 se obtuvieron de nuestro laboratorio. El tejido de las amígdalas humanas fue comprado a un vendedor comercial. Los detalles se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Incorporación de tejidos
<ol><li>Incruste tejido fresco en la solución OCT (temperatura de corte óptima) y congele a presión utilizando hielo seco o nitrógeno líquido.</li>
	<li>Conservar los tejidos a -80oC.</li>
</ol...

Los tejidos congelados se han utilizado ampliamente para la toma de imágenes mIF para detectar tradicionalmente de tres a cuatro marcadores31 en un tejido utilizando el método directo e indirecto32. En el método directo, los anticuerpos se conjugan con los tintes fluoresciosos o los puntos cuánticos33 para etiquetar el tejido, mientras que en el método indirecto, se utiliza un anticuerpo primario no conjugado para etiquetar el tejido seguido de ...

Los avances recientes en las técnicas de imágenes microscópicas han mejorado significativamente nuestro conocimiento y comprensión de los procesos biológicos y los estados de las enfermedades. La detección in situ de proteínas en los tejidos a través de la inmunohistoquímica cromogénica (IHC) se realiza rutinariamente en patología. Sin embargo, la detección de múltiples marcadores mediante la tinción cromogénica de IHC es un desafío1 y se están desarrollando métodos más recientes para utilizar enfoques de tinción de inmunofluorescencia múltiple (mIF), en los que se están desarrollando múltiples marcadores biológicos etiquetados en una sola muestra de tejido. La detección de múltiples marcadores biológicos es útil, ya que la información relacionada con la arquitectura tisular, la distribución espacial de las células y la coexpresión de antígenos se capturan en una sola muestra de tejido2. El uso de la tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia ha hecho posible la detección de múltiples marcadores biológicos. En esta tecnología, utilizando ópticas específicas, los espectros de fluorescencia de cada fluoróforo individual pueden separarse o "sin mezclar", permitiendo la detección de múltiples marcadores sin ninguna conversación cruzada espectral3. La fluorescencia multiespectral se está convirtiendo en un enfoque crítico en biología celular, desarrollo de fármacos preclínicos, patología clínica y perfilinmune tumoral4,,5,6. Es importante destacar que la distribución espacial de las células inmunitarias (específicamente células T CD8) puede servir como factor pronóstico para los pacientes con tumores existentes7.
Se han desarrollado varios enfoques para la tinción de fluorescencia multiplex y se pueden realizar simultáneamente o secuencialmente. En el método de tinción simultánea, todos los anticuerpos se suman como un cóctel en un solo paso para etiquetar el tejido. La tecnología UltraPlex utiliza un cóctel de anticuerpos primarios conjugados con ya hapten seguido de un cóctel de anticuerpos secundarios anti-hapten conjugados con fluoróforos. La tecnología InSituPlex8 utiliza un cóctel de anticuerpos primarios únicos conjugados por EL ADN que se añaden simultáneamente al tejido seguido de un paso de amplificación y finalmente sondas conjugadas con fluoróforoque que son complementarias a cada secuencia de ADN única en el anticuerpo primario. Ambas tecnologías permiten la detección de cuatro marcadores más 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para la tinción nuclear. Otros dos enfoques para la tinción multiplexación simultánea se basan en espectrometría de masas iónquinassecundarias 9. El sistema de imágenes Hyperion utiliza citometría de masa de imágenes10 para detectar hasta 37 marcadores. Esta tecnología utiliza un cóctel de anticuerpos conjugados metálicos para manchar los tejidos, y áreas específicas de los tejidos son abladas por un láser y transferidas a un citómetro de masa donde se detectan los iones metálicos. Otra tecnología similar es la IONPath, que utiliza la tecnología de imágenes de haz iónico multiplexado11. Esta tecnología utiliza un instrumento de espectrometría de masas modificado y una fuente de iones de oxígeno en lugar de láser para ablar los anticuerpos conjugados de metal. Si bien todos estos enfoques simultáneos de tinción múltiple permiten la detección de múltiples marcadores, no se pueden subestimar los costos involucrados por la conjugación de ADN, hapens o metales a anticuerpos, la pérdida de tejido debido a la ablación y el procesamiento de imágenes extenso para la desmezcla. Además, los kits y los protocolos de tinción están actualmente disponibles sólo para los tejidos FFPE y el desarrollo de paneles personalizados implica tiempo y gastos adicionales.
El método de tinción múltiple secuencial, en cambio, incluye etiquetar el tejido con un anticuerpo en un marcador, desmontar para eliminar el anticuerpo, seguido de repeticiones secuenciales de este proceso para etiquetar múltiples marcadores12. La amplificación de señal de tiramida (TSA) es el método de multiplexación secuencial más utilizado. Otras dos tecnologías de multiplexación utilizan una combinación de métodos de tinción simultáneos y secuenciales. La plataformaCODEX 13 emplea un cóctel de anticuerpos conjugados con secuencias únicas de oligonucleótidos de ADN que finalmente se etiquetan con un fluoróforo utilizando un paso de polimerización indexado seguido de imágenes, desmontaje y repetición del proceso para detectar hasta 50 marcadores. El enfoque de tinción múltiple MultiOmyx14 es una iteración de tinción con un cóctel de tres a cuatro anticuerpos conjugados con fluoróforos, imágenes, temple los fluoróforos y repetición de este ciclo para detectar hasta 60 marcadores en una sola sección. Al igual que el método de tinción múltiple simultánea, mientras que se puede detectar una amplia gama de marcadores, el tiempo involucrado en la tinción, la adquisición de imágenes, el procesamiento y el análisis es extenso. El paso de desmontaje/enfriamiento implica calentar y/o blanquear la muestra de tejido y, por lo tanto, el enfoque secuencial de tinción multiplex a los tejidos FFPE que mantienen la integridad del tejido al calentarse o blanquear.
La fijación de formalina y la posterior incrustación de parafina se realiza fácilmente en un entorno clínico, los bloques de tejido son fáciles de almacenar y varios protocolos de tinción multiplex están disponibles. Sin embargo, el procesamiento, incrustación y desparafinación de los tejidos FFPE, así como la recuperación de antígeno15, un proceso por el cual los anticuerpos pueden acceder mejor a los epítopos, es lento. Además, el procesamiento implicado en los tejidos FFPE contribuye a la autofluorescencia16 y enmascara los epítopos diana, lo que resulta en la variabilidad y falta de clon de anticuerpos disponible para detectar antígenos en los tejidos FFPE17,,18,,19. Un ejemplo es el antígeno leucocito humano (HLA) clase I alelos20. Por el contrario, la congelación rápida de los tejidos no implica extensos pasos de procesamiento antes o después de la fijación, eludiendo la necesidad de recuperación de antígenos21,22, y lo que es beneficioso para detectar una gama más amplia de objetivos. Por lo tanto, el uso de tejidos congelados para la fluorescencia multiespectral puede ser valioso para detectar dianas para estudios preclínicos y clínicos.
Dadas las limitaciones mencionadas anteriormente al usar tejidos FFPE, preguntamos si se pueden realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. Para abordar esta pregunta, probamos un método de tinción múltiple simultánea utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluoróforos para detectar múltiples antígenos y analizamos la tinción utilizando un sistema de imágenes multiespectrales semiautomáticos. Pudimos manchar simultáneamente hasta seis marcadores en una sola sección de tejido en un solo radio de 90 minutos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone (histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16F-1GAL</td>
			<td>Fixing tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100212</td>
			<td>Clone - 17A2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>53-0202-82</td>
			<td>Clone - L26; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558617</td>
			<td>Primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300446</td>
			<td>Clone - UCHT1; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100758</td>
			<td>Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372906</td>
			<td>Clone - C8/144B; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>141711</td>
			<td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100426</td>
			<td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>27</td>
			<td>Mouse frozen tissues used for multispectral training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6016-6EA</td>
			<td>Rehydrating and washing slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>Nucleic Acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond White Glass Charged Slides</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>DW7590W</td>
			<td>Adhering tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CV</td>
			<td>Washing and diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Slips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>Protecting stained tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block</td>
			<td>AMSBio</td>
			<td>AMS6023</td>
			<td>Human frozen tissue used for multispectral staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum 1X</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-512</td>
			<td>Blocking and diluent for human tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td>Machine learning software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300529</td>
			<td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenochart</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 1.0.8</td>
			<td>Whole slide scan software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>Sectioning tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superblock 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td>Blocking mouse tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Solution</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Embedding tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS142568</td>
			<td>Semi-automated multispectral imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>Version 3.0.5</td>
			<td>Software to operate microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid method for multispectral fluorescence imaging of frozen tissue sections

Las imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos de parafina incrustada en formalina (FFPE) permiten la detección de múltiples marcadores en una sola muestra de tejido que pueden proporcionar información sobre la coexpresión de antígenos y la distribución espacial de los marcadores. Sin embargo, la falta de anticuerpos adecuados para los tejidos fijados con formalina puede restringir la naturaleza de los marcadores que se pueden detectar. Además, el método de tinción consume mucho tiempo. Aquí describimos un método rápido para realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. El método incluye las combinaciones de fluoróforos utilizadas, pasos detallados para la tinción de tejidos congelados de ratón y humanos, y los procedimientos de escaneo, adquisición y análisis. Para el análisis de tinción, se utiliza un sistema de imágenes de fluorescencia multiespectral semiautomática disponible en el comercio. A través de este método, se teñen y detectaron hasta seis marcadores diferentes en una sola sección de tejido congelado. El software de análisis de aprendizaje automático puede fenotipo células que se pueden utilizar para el análisis cuantitativo. El método descrito aquí para los tejidos congelados es útil para la detección de marcadores que no se pueden detectar en tejidos FFPE o para los que los anticuerpos no están disponibles para los tejidos FFPE.

Detección de marcadores de un solo mancha en secciones de bazo congelado Como el sistema de imágenes semiautomatizadautiliza un sistema de filtro ajustable de cristal líquido (LCTF) que permite una gama más amplia de detección de longitud de onda25,y debido a que no se realizaron pasos de amplificación de señal aquí, primero optimizamos la detección de nuestros anticuerpos conjugados primarios para cada marcador en el microscopio. Un ejemplo se muestra en <strong class...

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A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Este método es útil para detectar y co-localizar varios biomarcadores en una sola criosecta, incluidos marcadores que normalmente no se pueden detectar en secciones de parafina. Utilizando este método de tinción experimental, el tiempo de tinción se reduce significativamente y el método se puede realizar en cualquier laboratorio. Demostrar este método será Dinesh Jaishankar.Es un experto postdoctorado del laboratorio, y también el Núcleo de Evaluación de Inmunoterapia, Gerente de Instalaciones. Al seleccionar anticuerpos para el análisis, tenga en cuenta los conjuntos de filtros de excitación y emisión disponibles en el sistema de imágenes semiautomático. Y después de probar varias combinaciones de anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo, prepare los fluoróforos para que se utilicen de modo que tenga una superposición espectral mínima como se sugiere en la tabla.Para la tinción multiplex, preparar un cóctel de anticuerpos con fluoróforos compatibles en delirios óptimos predeterminados, y añadir el cóctel a las secciones de tejido de interés. Para la tinción de un solo marcador, agregue el anticuerpo conjugado primario solo a la diapositiva. Para todas las tinciones, incluya un portaobjetos sin manchar de control que se someta al mismo procedimiento de tinción sin la adición de un anticuerpo conjugado primario.Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente protegida de la luz, lave los portaobjetos dos veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Después del segundo lavado, el contador mancha los portaobjetos múltiplex con DAPI durante siete minutos a temperatura ambiente protegido de la luz, seguido de dos lavados de cinco minutos en PBS. Para crear una biblioteca espectral, establezca la potencia de la lámpara del sistema de imágenes multiespectrales en 100% y abra el software operativo del microscopio.Seleccione Editar protocolo y nuevo protocolo. Introduzca un nombre de protocolo y seleccione Fluorescencia en modo de imagen. A continuación, proporcione un nombre de estudio y cargue las diapositivas manchadas individuales en el escenario.Haga clic en Editar exposición y utilice las opciones de enfoque automático y exposición automática para ajustar los tiempos de exposición y adquirir instantáneas para las diapositivas manchadas individuales. Después de tomar imágenes de las diapositivas manchadas individuales, guarde el protocolo. Y en el software de aprendizaje automático en la pestaña Biblioteca de compilación, cargue cada imagen manchada.Seleccione el suelo adecuado y haga clic en Extraer. El software extraerá automáticamente la señal fluorescente seleccionada en el suelo. Para guardar el color extraído, haga clic en Guardar para almacenar.Se puede crear un nuevo grupo o el color extraído se puede almacenar en un grupo existente. Para imágenes multiespectrales, una vez creada y verificada la biblioteca espectral, ajuste los tiempos de enfoque y exposición en la diapositiva teñida de multiplex como se ha demostrado y abra las diapositivas escaneadas para crear una nueva tarea. Proporcione un ID de diapositiva y seleccione un protocolo.En la tarea, seleccione el escaneo completo de la diapositiva para realizar un escaneo de diapositivas completo en la diapositiva manchada de multiplex. En toda la imagen de escaneo de diapositivas, seleccione regiones de interés en toda la imagen. Estas regiones se escanearán utilizando los tiempos de exposición previamente establecidos en la diapositiva multiplex que se utilizará para la desmezcla y el análisis espectral.En el software operativo del microscopio, seleccione adquirir campos MSI en tarea y, a continuación, haga clic en Procesar diapositiva para adquirir regiones de interés con un aumento de 20 veces. Una vez adquiridas las regiones de interés, en el software de aprendizaje automático, haga clic en Archivo y abrir en la pestaña de análisis manual para cargar las imágenes manchadas multiplex. Seleccione el origen de la biblioteca espectral y haga clic en Seleccionar pisos para elegir la biblioteca espectral guardada anteriormente.Haga clic en Archivo y Abrir para cargar la imagen no manchada. A continuación, haga clic en el icono de marcador de tinta de autofluorescencia y dibuje una línea o región en la diapositiva no manchada para identificar la autofluorescencia dentro del tejido. A continuación, en la pestaña Editar marcadores y colores, asigne nombres para cada marcador y haga clic en Preparar todo.Después de verificar la imagen espectralmente no mezclada, en el software de aprendizaje automático, seleccione las opciones de membrana y marcador de citoplasma en el panel. Y usando el botón de puntos suspensivos, seleccione utilizar esta señal para encontrar, para configurar el marcador para detectar los núcleos, citoplasma o membrana. cuando se elija un marcador citoplasmático o de membrana, seleccione la opción Usar la señal para ayudar en la división nuclear.El software detectará y creará automáticamente máscaras individuales para el núcleo, el citoplasma y la membrana. Utilice la vista de patología para un marcador específico y las opciones de configuración del software para ajustar las máscaras y haga clic en Segmentar todo para crear un mapa de segmentación de celdas. Después de la segmentación celular, seleccione los marcadores para fenotipo las celdas positivas.Además, seleccione al menos cinco celdas que no estén manchadas con el marcador elegido para fenotipo las celdas negativas. A continuación, haga clic en Clasificador de trenes para entrenar el software para detectar automáticamente todas las celdas manchadas con los marcadores seleccionados dentro de la imagen. Se creará un mapa de fenotipos.Como demuestran estas imágenes, los anticuerpos validados para la citometría de flujo podrían utilizarse para visualizar la tinción de tejido utilizando el filtro de cristal líquido sintonizable en el sistema de imágenes semiautomat automatizado. Aquí se puede observar una imagen espectralmente no mezclada de amígdalas humanas congeladas que incluye el etiquetado de células B y células proliferantes dentro del centro germinal folicular, y la región de células T interfoliculares. La opción de vistas patológicas permite visualizar el patrón de tinción individual para cada marcador dentro del tejido de interés, lo que sugiere que el método de tinción multiplex y las imágenes espectrales funcionan en tejido congelado.Como se muestra en una sección de tumor de ratón congelado, las imágenes multiespectrales también se pueden utilizar para visualizar las células T infiltrantes de tumores y otros linajes celulares mieloides, incluidos los macrófagos asociados a tumores. Se pueden generar mapas de segmentación y fenotipo de células, y el número de células manchadas para cada marcador analizado por el software, lo que demuestra que el software se puede utilizar para la cuantificación de la tinción multiespectral en tejidos congelados. Para alguien nuevo 6a la técnica, es importante conocer las características específicas de sus fluorocromos, y preparar diapositivas de biblioteca de calidad para la desmezcla espectral con una superposición espectral mínima.También es importante realizar la valoración de anticuerpos. En nuestra opinión, este método puede proporcionar información junto a la cama sobre la eficacia de la inmunoterapia para el cáncer y otras aplicaciones terapéuticas, particularmente cuando el tiempo es esencial.

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