Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل بالمنح المقدمة من وزارة العلوم والتعليم العالي (0295/B/PO1/2008/34 إلى MB وN301 100 31/3043 إلى KS)، من المركز الوطني البولندي للعلوم (UMO-2011/02/A/NZ1/00052، UMO-2014/13/B/NZ1/03991 وUMO-2014/14/M/NZ5/00558 إلى MB) وبزمالة EMBO قصيرة الأجل إلى KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تم اختبار بروتوكول الاختيار الموصوف هنا لNlaIV8، وهو تسلسل التعرف على أضعاف PD-(D/E) XK خافت يتعرف على موقع هدف palindromic مع قواعد NN المركزية ويحفز قطع نهاية حادة بين قواعد NN. تم اختيار NlaIV لأن الانقسام بين قواعد NN يشير إلى أن هذه القواعد قريبة من البروتين في المجمع. ومن حيث المبدأ، يمكن استخدام البروتوكول لأي تسلسل محدد للنهاية أو المونوميريك أو ديميريك، لأي مجموعة أضعاف، مما يحفز فواصل خصلة مزدوجة من أي متداخل، بغض النظر عما إذا كانت المجالات الحفازة والمحددة تتزامن (كما هو الحال في المثال NlaIV) أو منفصلة (على سبيل المثال، FokI). وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول من حيث المبدأ مفيد ليس فقط لتوليد خصوصية إنزيم جديدة أكثر ضيقا، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم للقضاء على أنشطة النجوم، أو لإنشاء endonucleases عالية الدقة. ومع ذلك، لم يتم اختبار كل هذا بعد. على وجه الخصوص، قد يكون القضاء المستهدف على نشاط النجوم معقدًا، لأن نفس بقايا الأحماض الأمينية يمكن أن تشارك في ربط القواعد المرغوبة وغير المرغوب فيها. ولا تقتصر الخطوات المختبرية الموصوفة في هذا البروتوكول على اختيار الخصائص الضيقة، بل يمكن استخدامها أيضاً لتحديد الخصائص التي تم تغييرها بطريقة أخرى. ومع ذلك ، هناك مشكلة مع endonucleases المتغيرة: إذا كان طيف الركائز يتضمن أهدافًا جديدة لا مكورة من قبل endonuclease الأبوية ، فلا توجد بشكل عام طريقة جيدة لحماية الخلايا من الآثار الضارة لهذا النشاط. وعلى النقيض من ذلك، إذا تم تضييق خصوصية endonuclease فقط، فإن الأهداف هي مجموعة فرعية من أهداف النوع البري، وبالتالي ينبغي أن تكون الميثيل ترانسفيلاز المتاحة بالفعل وقائية بالكامل.
يختلف بروتوكولنا من عدة جوانب عن العديد من بروتوكولات التطور الموجهة. يتم إنشاء تنوع إطار القراءة المفتوحة مرة واحدة في بداية التجربة ، وليس في كل تكرار. وعلاوة على ذلك، يتم إنشاؤه عن طريق التوليف الانقسام ومزيج، بدلا من EP-PCR. بالنسبة لبدائل NNS من codons ، كما هو مستخدم في هذا العمل ، هناك (4 × 4 × 2)6 ~ 1.07 × 109 مجموعات لستة وظائف. ولذلك، فإن أي متغير معين موجود في المتوسط مرة واحدة في 1.7 fmoles من ESC. ويمكن زيادة هذه القدرة إلى سبعة مواقع باستخدام التوليف مع خليط من 20 سلائف ترينوكليوتيد التي تقدمها غلين للبحوث أو عن طريق خفض تردد الطفرة في مواقف أقل واعدة مع تخليق oligonucleotide الانقسام ومزيج. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن للحد من مدى الاختلاف إلى ستة وظائف. ومن الواضح أن مثل هذا الاستهداف الطفرات يتطلب بعض المعرفة الموجودة مسبقا حول مناطق REase على الأقل المشاركة في ربط الركيزة. ولبروتوكول التقسيم والمزيج لتوليد التنوع مزايا واضحة بالمقارنة مع EP-PCR. باستخدام EP-PCR، حصلنا على متغيرات وتسلسل اتّصال دون تغيير تحمل ثمانية استبدالات لـ NlaIV ESCs في نفس EP-PCR(الجدول 4). تحتوي المكتبة من EP-PCR على جزء كبير من المستنسخين التي يجب تجنبها (تسلسل اتّحادية نوع، استبدالات متعددة، تحول الإطار والطفرات هراء، والطفرات في الأماكن التي من غير المحتمل أن تؤثر على خصوصية التسلسل).
يختلف بروتوكولنا أيضًا عن العديد من بروتوكولات التطور الموجهة الأخرى من خلال وجود خطوتين اختيار متتاليتين. الاختيار الإيجابي يتأكد من الاحتفاظ بالنشاط المطلوب، وإلا لا تتم إزالة علامة biotin، ويمكن إزالة تسلسل الترميز عن طريق السحب. من الممكن من الناحية الفنية أن يؤدي الظهور الصدفة لخصوصية جديدة غير متداخلة (على سبيل المثال GCATGC) إلى قطع علامة البيوتين أيضًا ، إذا كان موقع الانقسام المناسب موجودًا بالقرب من الانقسام المطلوب ، ولكن ليس في أي مكان آخر. ومع ذلك، ينبغي أن يكون هذا مستبعداً إلى حد كبير. يزيل التحديد السلبي إطارات القراءة المفتوحة التي تعمل على ترميز الإنزيمات التي لا يزال النشاط غير المرغوب فيها. هذه الخطوة ليست إلزامية تماماً، لأن البروتوكول سوف لا يزال إثراء مكتبة الإخراج مع المتغيرات التي هي قادرة على التجانب تسلسل التحديد ولكن غير قادر على التداعي في مكان آخر في ESC، وبالتالي جعلها غير مناسبة لتضخيم PCR. ومع ذلك، من المتوقع أن تكون فعالية الاختيار أقل لأن الإنزيمات ذات خصوصية التسلسل الأصلي لن تتم إزالتها من الإخراج وسوف تتفوق على المتغيرات الواعدة مع تغيير التحديد ولكن أيضًا انخفاض النشاط الأنزيمي. لاحظ أنه على مستوى السكان، يمكن لكل من تسلسل الأهداف المرغوب ة وغير المرغوب فيها، ولكن ليس من الضروري أن تكون، أن تتدهور. وفي المثال NlaIV، كان الهدف المضاد للهدف منحطاً والهدف غير منحط. وحتى عندما يكون هناك انحطاط على مستوى السكان، لا يوجد في قطرة واحدة سوى هدف واحد (غير منحط) أو هدف مضاد. في بروتوكولنا، يتم إعادة إدخال التسلسلات المستهدفة والمضادة للأهداف عند كل تكرار لخطوات الاختيار. لذلك ، يجب أن يقوم إطار القراءة المفتوح بترميز إنزيم قادر على التداعي لجميع الأهداف المحتملة ، وغير قادر على التشعب بأي من الأهداف المضادة ، للبقاء على قيد الحياة في جولات الاختيار المتعددة. لاحظ أن الحاجة إلى إعادة إدخال هدف التحديد المضاد في كل تكرار للبروتوكول يفرض اثنين من PCRs متسلسلة. يستخدم PCR الأول التمهيدي الذي يناز خارج المضادة للهدف، بحيث الانقسام من المضادة للهدف يمنع تفاعل PCR. يتطلب PCR الثاني التمهيدي الذي يتجاوز المضادة للهدف، ويعيد إدخال المضادة للهدف، للتأكد من أنه خلال جولات متعددة من الاختيار، يتم اختبار كل إطار قراءة مفتوحة ضد جميع المتغيرات من المضادة للهدف.
بالنسبة للإنزيمات التي تولد نهايات لزجة ، يمكن استخدام بروتوكول بديل ذي صلة يستند إلى طريقة تم وصفها سابقًا لعزل REase ORF10. يتم استبدال استنفاد المتغيرات غير النشطة بواسطة التقاط البيوتين المستخدم في تجاربنا في البروتوكول البديل بربط المحول المتوافق مع تسلسل يستخدم كموقع ربط التمهيدي في PCR انتقائي(الشكل 9). فقط ESCs التي تنتج الإنزيمات مع التحديد المحدد توليد نهايات قادرة على الربط وبالتالي سيتم اختيارها. يجب تصميم تسلسل النهاية اللاصقة للتسلسل eselected العداد بطريقة لا يمكن المشاركة في الربط مع المحولات. يمكن بسهولة تحقيق تكرار عملية الاختيار عن طريق التبديل بين اثنين من محولات مختلفة وبالتالي اثنين من التمهيديات عكس مختلفة في PCR انتقائية.
حتى مع البروتوكولات الجديدة ، فإن مهمة خصائص الرواية الهندسية في المختبر لا تزال صعبة للغاية. بالنسبة للنوع النموذجي II REases ، تعتمد خصوصية التسلسل والنشاط الأندوكليوليتيك على نفس مناطق البروتين. ولذلك من الصعب تغيير أحدهما دون التأثير على الآخر. يتم تحقيق النجاح على الأرجح من خلال استراتيجية تأخذ في الاعتبار بصمة الإنزيم ، وتحترم التماثل بين تفاعلات البروتين والحمض النووي ، وتبني على التفضيلات الأنزيمية الموجودة مسبقًا ، والتي يجب تحديدها مقدمًا في التجارب الكيميائية الحيوية ، كما تم القيام به للمثال NlaIV8.

تسلسل هندسة خصوصية تحديا للغاية للفئة الثانية REases. في هذه الفئة من endonucleases ، يتم الربط بشكل وثيق الاعتراف بالتسلسل والحفز ، على الأرجح كضمان تطوري ضد إنشاء endonuclease من خصوصية أوسع من ميثيل ترانسهاز cognate ، والتي من شأنها أن تلحق الضرر الحمض النووي المضيف. التطور الموجه للخصائص الجديدة في الخلايا يزداد تعقيدًا بسبب الحاجة إلى حماية الحمض النووي المضيف من نشاط endonuclease المهندس حديثًا. لذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من المحاولات الناجحة للهندسة REase المبلغ عنها وكلها تستغل الميزات الفريدة لإنزيم معين1،2،3،4،5،6،7.
هنا نقدم بروتوكول مفصل لهندسة التحديد التي يمكن استخدامها لتوليد المتغيرات endonuclease التي لها خصوصية أضيق من إنزيم الوالدين الذي يقوم على الهندسة الناجحة لدينا من endonuclease NlaIV8. لأي إنزيم من هذا القبيل مع تسلسل الاعتراف التعسفي، يمكن إدخال خصوصية إضافية للقواعد في الجناحين. بالنسبة للإنزيمات الأبوية التي تتعرف على التسلسلات المنحطة جزئيًا (مثل NlaIV مع هدفGGNNCC) ، يمكن أيضًا إدخال خصوصية إضافية ضمن تسلسل الاعتراف. وبما أن التحديد الإضافي من المرجح أن يتطلب اتصالات بين البروتين والحمض النووي، فإن القواعد المعترف بها حديثاً ينبغي أن تقع ضمن بصمة الإندونوسلي الأبوي على الحمض النووي. ومن حيث المبدأ، يمكن وضع مخططات اختيار لأي تخصص مرغوب فيه لتسلسل الاعتراف. ومع ذلك ، فإن معظم REases التي تعترف palindromic وتسلسل الهدف palindromic تقريبا هي dimers الوظيفية التي تعترف فقط نصف موقع palindrome. وبالتالي، فإن اختيار الخصائص الجديدة التي تنتهك التماثل بين التفاعلات النووية البروتينية من غير المرجح أن ينجح. بالنسبة لـ NlaIV الباهت ، على سبيل المثال ، يمكن نظرياً تضييق تسلسل GGNNCC إلى GGATCC ولكن من المتوقع أن يكون تضييق التحديد وصولاً إلى GGAACC أكثر صعوبة. يتضمن مخططنا الاختيار الإيجابي والسلبي على حد سواء.
تكون العملية أكثر كفاءة عندما يتم استخدام التحديد السلبي أيضًا لإزالة الخصائص القادرة على تَصُل كافة التسلسلات بخلاف التحديد الأضيق المفضل. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين تحديد GGATCC مع التحديد المضاد ضد GGBVCC (حيث B هو أي قاعدة أخرى غير A، وV هو أي قاعدة أخرى غير T). عندما لا يتم تغطية بعض التسلسلات المستهدفة المحتملة، تعتمد نتيجة تجربة الاختيار على فعالية الاختيار الإيجابي والسلبي. في عملنا NlaIV، اخترنا لGGATCC، وضد GGSSCC (حيث S هو G أو C)، وحصلنا على خصوصية أن، تجاهل التماثل كسر الأهداف، يمكن وصفها بأنها GGWWCC (حيث W هو A أو T)، مما يشير إلى أنه في هذه الحالة بالذات، كان الاختيار السلبي أكثر مهم من الاختيار الإيجابي.
نهجنا يبدأ مع إنشاء كاسيت اختيار التعبير (ESC). واللجنة في إطار أقسام. في القسم الأساسي الداخلي ، هناك متغيرات من إطار القراءة المفتوح (ORF) من REase ، تحت سيطرة T7 المروج. لا يمكن أن يحتوي هذا القسم الأساسي من ESC على أي موقع cognate لـ REase المهندسة. يقع النواة بين موقعين cognate لنوع البرية REase: موقع انشقاق للنشاط غير المرغوب فيه (تسلسل محدد مضاد ، GGSSCC في هذا المثال) وموقع انشقاق للنشاط المطلوب (تسلسل محدد ، GGATCC في المثال). الخطوة الأخيرة من إعداد ESC في PCR يضيف البيوتين قريبة من النشاط المطلوب في نهاية 5 ' ويخلق مجموعة متنوعة من تسلسل اتّصال مضادة (GGSSCC في المثال). تعتمد استراتيجية الاختيار على استخدام التصاميم المصممة بعناية في بروتوكول إعادة التضخيم ESC بعد بروتوكول النسخ /الترجمة/الاختيار في المختبر(الشكل 1A). يتم التعبير عن مكتبة ESC في نسخة مجزأة في المختبر مستحلب المياه في الزيت9،10،11. داخل كل قطرة، خصوصية الإنزيم أعرب يؤثر على حالة ESC(الشكل 1B،الخطوة الأولى). بالنسبة للترتيب الموصوف ، يزيل نشاط الانقسام المطلوب للبروتين المترجم علامة البيوتين في الحمض النووي ولكنه لا يؤثر على نهاية ESC الأخرى مع التسلسل المحدد العداد. عندما يتم كسر مستحلب، تتم إزالة شظايا الحيوية tinylated بواسطة السحب تقارب العقدية، بحيث أجزاء فقط من قطرات مع النشاط المطلوب تبقى(الشكل 1B،الخطوة الثانية). هذه الخطوة يزيل المتغيرات REase غير نشط. ثم يتم تضخيم الجزء الفائق من الخطوة المنسدلة بواسطة PCR. في أول التمهيديات تفاعل PCR F2 و R1 يتم استخدامها(الشكل 1A، B،الخطوة الثالثة). يرتبط التمهيدي F2 بقسم ESC بين التسلسل المحدد العداد ونهاية الجزيء. لذلك، لا يتم تضخيم ESCs التعبير عن المتغيرات التي هي قادرة على cleaving تسلسل العداد المحدد (وبالتالي، فصل المواقع ملزمة لالتمهيديF2 و R1 إلى اثنين من جزيئات الحمض النووي المختلفة) وبالتالي يتم إزالتها من المكتبة. يربط التمهيدي R1 بين الموقع المحدد وجوهر ESC بحيث لا يتأثر بحالة الانقسام للموقع المحدد ويستعيد موقع الانقسام للنشاط المطلوب (GGATCC). يتم إغلاق الدورة بواسطة PCR الثاني (مع التمهيديين F1 و R2) الذي يضيف البيوتين في نهاية 5 'بالقرب من الموقع المحدد ويستعيد الاختلاف المصمم في الموقع المحدد العداد بالقرب من الطرف الآخر من ESC(الشكل 1B، الخطوة الرابعة). خليط الحمض النووي الناتج جاهز لجولة أخرى من الاختيار.
يعتمد نجاح بروتوكول الاختيار بشدة على الاختيار الصحيح لتسلسل التعرف على الهدف الجديد الأكثر صرامة وعلى التصميم الدقيق لاستراتيجية الطفرات وتنفيذها الفعال. لأنه من الأسهل بكثير لتحسين على تفضيلات طفيفة موجودة مسبقا من REase من التغلب عليها، نوصي بدءا من دراسة حركية من أي تفضيلات موجودة مسبقا. وينتج عن ضرورة تصميم الطفرات الدقيقة الحجم المحدود لمكتبة متحولة يمكن معالجتها من خلال البروتوكول المقدم (109 مستنسخات في تجربة واحدة). لذلك يمكن اختبار جميع بدائل الأحماض الأمينية الممكنة 20 بشكل فعال في مواقف قليلة فقط (انظر المناقشة). وسيؤدي الطفرات العشوائية، مثل الـ PCR المعرضللخطأ (EP-PCR) المقدمة كطريقة بديلة، إلى اختزال عميق في التعقيد القائم. إذا كانت أي معلومات تتعلق بمواقع الأحماض الأمينية المحتملة المشاركة في الاتصالات مع الحمض النووي (أو حتى تقع على مقربة من النيوكليوتيدات المنحطة في تسلسل cognate) متاحة ، فمن المؤكد أنه ينبغي استخدامها لتحديد بعض الأحماض الأمينية لتولد التشبع التشبع الموجه أوليغونوكليوتيد (خطوات البروتوكول 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

تقييد endonuclease (REase) هندسة التحديد من الصعب للغاية. هنا نحن وصف بروتوكول متعدد الخطوات التي تساعد على إنتاج المتغيرات REase التي لها خصوصية أكثر صرامة من الإنزيم الأبوي. يتطلب البروتوكول إنشاء مكتبة لأشرطة اختيار التعبير (ESCs) للمتغيرات من REase ، من الناحية المثالية مع تباين في المواقف التي من المرجح أن تؤثر على ربط الحمض النووي. ويحيط ESC على جانب واحد من قبل تسلسل لنشاط موقع تقييد المطلوب وعلامة البيوتين وعلى الجانب الآخر من قبل موقع تقييد للنشاط غير المرغوب فيه وموقع تدليل الصلب. يتم نسخ اللجان الاقتصادية والاجتماعية وترجمتها في مستحلب الماء في الزيت، في الظروف التي تجعل وجود أكثر من جزيء الحمض النووي واحد لكل قطرة من غير المرجح. لذلك ، يخضع الحمض النووي في كل جزيء كاسيت فقط لنشاط الإنزيم المترجم والمشفر. REase المتغيرات من خصوصية المطلوب إزالة العلامة البيوتين ولكن ليس موقع الصلب التمهيدي. بعد كسر مستحلب، تخضع جزيئات الحمض النووي إلى سحب البيوتين، ويتم الاحتفاظ فقط تلك الموجودة في supernatant. تضمن هذه الخطوة الاحتفاظ فقط بـ ESCs للمتغيرات التي لم تفقد النشاط المطلوب. ثم تخضع جزيئات الحمض النووي هذه لتفاعل أول PCR. الانقسام في تسلسل غير مرغوب فيه يقطع موقع الربط التمهيدي لأحد التمهيديات. ولذلك، PCR تضخيم ESCs فقط من قطرات دون النشاط غير المرغوب فيه. ثم يتم إجراء رد فعل ثاني PCR لإعادة إدخال موقع التقييد للخصوصية المطلوبة وعلامة الكائنات الحية ، بحيث يمكن تكرار خطوة الاختيار. يمكن التعبير عن إطارات القراءة المفتوحة المختارة بشكل مفرط في الخلايا البكتيرية التي تعبر أيضًا عن ميثيل ترانسفيلاز cognate من REase الأبوية ، لأن REase المتطورة حديثًا لا تستهدف سوى مجموعة فرعية من المواقع المستهدفة لميثيل ترانسلاز.

هذا البروتوكول هو مجرد أداة لزيادة وتيرة المتغيرات المطلوبة من REase هندسيا عن طريق استنفاد (ولكن ليس القضاء) فئتين غير المرغوب فيها: الإنزيمات غير النشطة وendonucleases مع خصوصية تسلسل نوع البرية دون تغيير. من ناحية أخرى ، لأن تغيير خصوصية REase أمر صعب للغاية ، فإن العثور على واحد من هذا النوع من البدائل ينتج نمطًا من الانقسام يختلف عن إنزيم النوع البري في فحص واحد لـ 24 استنساخًا يجب اعتباره نجاحًا. في أيدينا أفضل الشاشات يمكن أن تحدد ما يصل إلى 20٪ من المتغيرات الواعدة(الشكل 8A).
تعتمد النتيجة الإيجابية بشدة على جودة المكتبة (أي التردد المحدود للاستبدالات وتوزيعها العشوائي) والالتقاط الفعال للسكان الضئيلين بيولوجيًا من أعضاء المكتبة (الخطوات 3.6-3.7). يمكن الكشف عن كلتا المشكلتين. وينبغي التحقق من جودة المكتبة قبل الاختيار عن طريق تسلسل أكبر عدد ممكن من المستنسخين (>15) أو عن طريق التسلسل المباشر للمكتبة عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية (الخطوة 3.10، الجدول 3). إذا كانت غالبية المستنسخين المحددين غير نشطة، فهذا مؤشر واضح على فشل اختيار التقاط العقدتافيرين. ويلاحظ تأثير مماثل في حالة المكتبات التي تخضع للعديد من دورات الاختيار، لأن هذه المكتبات هي الأكثر هيمنة من قبل المتغيرات غير النشطة التي نجا من خطوة اختيار التقاط streptavid(الشكل 8B). لذلك ، من المستحسن تشغيل الفحص بعد كل دورة اختيار ومواصلة تطوير متغيرات واعدة مختارة يدويًا بدلاً من الاعتماد على تكرار التحديد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> الشكل 1: في المختبر اختيار تسلسل جديد محدد على أساس الهندسة NlaIV. (أ)يتضمن تنظيم شريط التعبير/التحديد (ESC) موقعي تقدير لـ REase، 1) التسلسل المحدد (GGATCC) بالقرب من الطرف الأيمن و2) التسلسل المحدد للعداد (GGSSCC) بالقرب من الطرف الأيسر، بالإضافة إلى مروج T7p و T7t-T7 ومحدد T7. وترد أدناه مواقع الربط التمهيدي. ويظهر الانقسام حسب النوع البري ومتغيرات NlaIV المحددة كمثلثات حمراء وخضراء على التوالي. (ب)خطوات دورة الاختيار: I) استحلاب النسخ والترجمة الانقسام التفاعل يمزج مع مكتبة ESC؛ II) يتم التقاط جميع الحمض النووي التضمين الحيوي على الجسيمات المغناطيسية المغلفة بالعقدياتوفيافين وإزالتها ، وبالتالي إزالة المتغيرات غير النشطة الترميز ؛ III) ESCs ترميز REases مع نشاط نوع البرية (أي تلك قادرة على شق تسلسل GGSSCC) يتم القضاء لأن انشقاق التسلسل يفصل بين المواقع ملزمة للالتمهيديات إلى الأمام وعكس. ولذلك، لا يحدث أي تضخيم لهذه اللجان؛ 4) يتم إنشاء الإدخال لجولة الاختيار التالية عن طريق إضافة البيوتين على الطرف الأيمن وإعادة إدخال الاختلاف من تسلسل العداد المحدد على الطرف الأيسر. أعيد طبعها من Czapinska وآخرون8 بإذن من إلسفير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> الشكل 2: إعداد اللجنة. تم تعديل جزء مشتق من البناء الأصلي في متجه تعبير يحتوي على NlaIV ORF تحت سيطرة المروج T7 ليكون مناسبًا للتعبير / التحديد. تمت إزالة موقع NlaIV المصب من NlaIV ORF وتم إدخال المواقع الفريدة (SalI و EcoRI و Eco52I) التي تم استخدامها لتبخير مواقع مختارة في NlaIV ORF كطفرات صامتة. تم تضخيم البناء النهائي مع التمهيديات الجناحة التي أدخلت اثنين من المواقع NlaIV الجناحين: تسلسل العداد المحدد (GGSSCC) على التسلسل الأيسر والمحددة (GGATCC) على اليمين. كما قدم التمهيدي العكسي البيوتين. يتم عرض الالتمهيديات المستخدمة في إنشاء ECS المتحولة كأسهم زرقاء وتسمى أدناه (انظر الجدول 1B، C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> الشكل 3: مخطط التوليف المنقسم والمزيج. يشير المثال إلى توليف التمهيدي MutB حيث تم إدخال تسلسل NNS عند تردد 0.8 عند أربعة مواضع (انظر أيضاالجدول 3). لاحظ أن التوليف الكيميائي يتم من 3 'إلى 5' ولكن يتم عرض جميع التسلسلات في اتجاه 5'-3 الكنسي (أي أنه ينطلق من اليمين إلى اليسار في هذا المخطط). يتم عرض تسلسلات النوع البري في المواضع المطفرة باللون الأخضر بينما تكون تسلسلات NNS المطفرة باللون الأحمر. يتم تسطير موقع التعرف على SALI الذي يستخدم لاحقًا لإدخال طفرات في ESCs. يشار إلى نقاط خلط وتقسيم الخطوات (2 و 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> الشكل 4: استخدام مواقع إنزيم تقييد فريدة من نوعها في التولد المعتوّر المستهدف من القلة. تظهر استراتيجية مقدمة الطفرات على مثال على بناء المكتبات A-C (انظر الخطوات 3.1-3.7). أعيد طبعها من Czapinska وآخرون8 بإذن من إلسفير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> الشكل 5: انشقاق الإندونكليوليك في المختبر النسخ والترجمة. (أ)انشقاق ركيزة اختبار في العازلة REase الأمثل: 1) الركيزة، 612 BP PCR المنتج مع موقع التعرف NlaIV واحد؛ 2) منتجات الانقسام، 355 bp و 257 bp.(B)الانقسام في تفاعل النسخ والترجمة في المختبر (التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام من ESC): 1-2) 15 μL aliquots من في المختبر النسخ الركيزة دون (سطر 2: رد فعل مكملة مع 1.5 mM MgCl2)؛ 3-4) 15 μL aliquots من في المختبر النسخ الترجمة مع 1 ميكروغرام من الركيزة الاختبار؛ (line 4: reaction supplemented with 1.5 mM MgCl2). علامة حجم S-DNA (pBR322 مهضومة مع MspI). تم حل العينات في صفحة 6٪ أصلية. الحمض النووي كان ملطخاً ببروميد الإيتيهيديوم <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> الشكل 6: منتجات أول PCR في دورة الاختيار. انظر الشكل 1باء،الخطوة الثالثة؛ بروتوكول الخطوة 5.10. مجموعات الأعمدة 1 و 2 هي aliquots من مكتبتين مختلفتين محملة في triplicate. معيار حجم الحمض النووي S (لامدا الحمض النووي هضمها مع HindIII وEcoRI). يشير السهم إلى موضع ESC كامل الطول (1050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> الشكل 7: المتغيرات NlaIV تنقية لمزيد من الفحص في مقياس صغير. انظر الخطوة 6.3.11. يحتوي كل سطر على 10 ميكرولتر عليوت من متغير مختلف. S-بروتين معيار الوزن الجزيئي. الكتلة الجزيئية للوحدة الفرعية NaIV REase هي 29.9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> الشكل 8: أمثلة على فحص متغيرات NlaIV لتغيير خصوصية التسلسل. انظر الخطوة 6-4-2. (أ)الفحص الناجح مع ارتفاع وتيرة المتغيرات الواعدة. S = علامة حجم الحمض النووي، لامدا الحمض النووي مورقة مع HindIII وEcoRI؛ نوع البرية (wt) = لامدا الحمض النووي مورقة مع نوع البرية NlaIV; = الركيزة الحمض النووي لامدا، وليس مُكَد؛ أعمدة أخرى = متغيرات ذات نشاط منخفض جداً. يتم تسمية المتغيرات! = المتغيرات الواعدة التي تنتج نمط الانقسام متميزة عن إنزيم نوع البرية; = المتغيرات التي قد تكون قد غيرت أيضًا تفضيل التسلسل. (B)فحص غير ناجح، مع غالبية المتغيرات غير نشط ومتغير واحد مع نمط الانقسام دون تغيير على ما يبدو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> الشكل 9: الاختيار البديل عن طريق الربط. يمكن استخدام هذا البديل لجميع REases توليد نهايات لزجة. نقدم هنا بروتوكول مثال لنظام اختيار إنزيم MwoI (غير منشور). I) تسلسل مختار (يقع في الطرف الأيمن من ESC) مع بقايا محددة تظهر باللون الأحمر والاختلاف المحدد من تسلسل cognate هو مبين باللون الأزرق. ويرد بين قوسين أسفل العداد المحدد التسلسل الذي سيتم وضعه في الطرف الأيسر من ESC؛ II) نتاج الانقسام MwoI؛ III) بعد إنهاء في المختبر النسخ / الترجمة، يتم تنقية المنتجات ويتم تنفيذ الربط مع محول الزائدة. يمكن فقط للمنتجات الانقسام التي تم مجسا في تسلسل المحدد المشاركة في الربط. لذلك، يتم إزالة المتغيرات غير النشطة، والخطوة المنسدلة غير ضرورية. لا يمكن أن يشارك منتج الانقسام في التسلسل المحدد العداد (في الطرف الأيسر من ESC، غير مبين) في هذا الربط لأن النهاية البارزة للمحول ليست مكملة للتسلسل المحدد للعداد؛ 4) يستخدم PCR انتقائي نفس الاستراتيجية كما هو الحال في البروتوكول الرئيسي للقضاء على المتغيرات مع نوع البرية منحط تسلسل خصوصية (F1 التمهيدي ربط distal إلى موقع العداد المحدد) في حين يتم القضاء على المتغيرات غير النشطة من قبل التمهيدي العكسي الانتقائي التي لا يمكن ربط إلى غير المنسحب (وبالتالي لا يتم تعديلها بواسطة ربط محول) نهاية الحق. في الدورة التالية يمكن أن يتم إعادة عرض العملية باستخدام محول مطابق للمنتج الانقسام من الخطوة السابقة (أي "كاسيت مكور" في اللوحة III) ، والتمهيدي العكسي الانتقائي المناسب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: البرايمرات المستخدمة في هندسة NlaIV. يتم تسطير تسلسل مواقع التقييد المذكورة في التعليقات. تشير الحروف الصغيرة إلى التسلسلات التي لا تحتوي على مكملات في قوالب الحمض النووي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).</a>
الجدول 2: شروط ردود فعل تفاعل التفاعل المتعددة الكلور لاستخدامها في البروتوكول. Tm = درجة حرارة ذوبان التمهيدي (إذا كان Tm يختلف عن التمهيديات ، يجب استخدام Tm الأقل). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).</a>
الجدول 3: نتائج فحص جودة اثنين من البوابتين المطفرة توليفها مع استراتيجية الانقسام والمزيج. يشار إلى الكودونات المطفرة مع [XXX]. يشير انخفاض رقم المؤشر إلى موضع الأحماض الأمينية المشفرة. مقتبس من Czapinska وآخرون8 بإذن من إلسفير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).</a>
الجدول 4: نتائج برنامج الشراكة البيئية المتعددة الكلور. المعلمات الرئيسية المستمدة من تحليل تسلسل 22 استنساخ ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

يمكن تطوير الإندونوكليس التقييد مع خصوصية تسلسل جديدة من الإنزيمات التي تعترف بتسلسل منحط جزئيًا. هنا نقدم بروتوكول مفصل استخدمناه بنجاح لتغيير خصوصية تسلسل إنزيم NlaIV. المكونات الرئيسية للبروتوكول هي تجزئة المختبر من رد فعل النسخ / الترجمة واختيار المتغيرات مع خصائص تسلسل جديدة.

في المختبر إخراج تطور Endonuclease تقييد مع خصوصية أكثر صرامة

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

يسمح بروتوكولنا بإنشاء أنزيمات تقييد مع خصائص تسلسلية معدلة وأكثر صرامة باستخدام التقسيم في المختبر واستراتيجية اختيار فريدة في التطور الموجه. يحتمل أن يكون عالميًا تمامًا ، حيث يجب أن يكون قابلاً للتطبيق على أي قيود endonuclease ويمكن توجيه الاختيار نحو أي إصدار أكثر صرامة من تسلسل cognate الأصلي. إذا تم التعبير عن المتغيرات المنشأة حديثاً عن طريق الترجمة الحرفية في المختبر، فإن البروتوكول مناسب ليس فقط لتضييق التحديد، ولكن أيضًا لتغيير خصوصية.لتحديد مواقع الطفرات دون التشبع، اختر ترددات الطفرات وفقا للأهمية الافتراضية للمواقع، مع الحفاظ على حدود على تعقيد المكتبة الشاملة في الاعتبار. لبدء التوليف، إدراج الأعمدة التي تم معبأة مع راتنج جديدة في المزج. توليف أوليجنوكليوتيدات في جميع الأعمدة حتى الثلاثية، مباشرة قبل موقع الطفرات الفرعية الثانية العد من نهاية ثلاثة رئيس.توليف، وترك مجموعة trityl خمسة رئيس في نهاية المطاف. ستتم إزالة المجموعة الحماية في بداية دورة التوليف القادمة. فتح أعمدة التوليف وطاردة مركزية لفترة وجيزة في أنابيب جافة 1.5 ملليلتر لجمع الراتنج.سحب دعم التوليف CPG ومزيج من دوامة. إعادة تقسيم الراتنج CPG مختلطة إلى أعمدة توليف جديدة. تجنب إدخال الرطوبة لأنها سوف تقلل من العائد العام.مواصلة التوليف، بدءا من موقع الطفرات دون التشبع الثلاثي. تعيين أعمدة إلى ثلاثة توائم عشوائية NNS أو ثلاثة توائم من النوع البري وفقا لتردد الطفرات المطلوبة. إذا كانت هناك مواقع إضافية دون التشبع، انتقل فقط إلى الثلاثي الذي يسبق موقع الطفرات الفرعية التالية.إذا لم يكن هناك المزيد من المواقع دون التشبع موجودة في المصب، واستكمال التوليف، وترك مجموعة trityl خمسة رئيس في نهاية المطاف. استخدام نصائح الماصات تتحمل واسعة لإعداد خليط النفط السطحي عن طريق إضافة 225 ميكرولترات من سبان 80 و 25 ميكرولترات من توين 80 إلى خمسة ملليلتر من النفط المعدني في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. تخلط جيدا عن طريق انعكاس لطيف 15 مرة.وينبغي أن يكون الخليط في هذه الخطوة شفافة. لكل مكتبة، نقل 950 ميكرولترات من خليط النفط السطحي إلى قارورة قارورة قارورة قاعية مستديرة مليلتر. تسمية مع اسم مكتبة ونقلها إلى الجليد.وضع شريط واحد صغير التحريك أسطواني في كل قارورة. إعداد في المختبر النسخ في الترجمة النسخ التفاعل الخليط وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة. تكملة الخليط مع كلوريد المغنيسيوم إلى تركيز النهائي من 1.5 ميليمولار.Dispense 50 ميكرولتر aliquots من خليط التفاعل في 1.5 ملليلتر أنابيب على الجليد. إضافة 1.7 femtomoles من المكتبة إلى خليط التفاعل على الجليد. إعداد مستحلب الماء في الزيت على التوالي لكل مكتبة عن طريق وضع أول منقار صغير مملوءة بالثلج على مُنشر مغناطيسي مع سرعة التحريك التي تم تعيينها إلى 1150 دورة في الدقيقة.ثم نقل قارورة المبردة مع 950 ميكرولتردات من خليط النفط السطحي وشريط صغير معزّز إلى منقار بارد على المُنقل المغناطيسي. تحقق من أن شريط التحريك يدور. إضافة خمسة 10 ميكرولتر aliquots من مكتبة في المختبر النسخ الترجمة خليط على مدى فترة دقيقتين في 30 فترات ثانية والاستمرار في اثارة لمدة دقيقة إضافية.نقل القارورة مع مستحلب إلى حاوية الجليد. عند هذه النقطة، يجب أن يكون السائل مبهمًا وليس شفافًا. ثم، تابع المكتبة التالية.بعد أن تتم معالجة جميع المكتبات، بدء حضانة جميع المكتبات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للطقم. نقل قارورة إلى درجة الحرارة المثلى لالهندسة endonuclease لمدة ساعتين إضافية قبل وضعها على الجليد لمدة 10 دقائق على الأقل. نقل المستحلبات من قوارير التبريد في أنابيب 1.5 ملليلتر.إضافة ميكرولتر واحد من 5 EDTA المول. وطرد مركزي لهم في 13،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إذا بعد الطرد المركزي لا يمكنك أن ترى واجهة الماء والنفط بوضوح، وتجميد الخليط قبل الطموح من مرحلة النفط العلوي.نقل مرحلة الزيت العلوي مع ماصة والتخلص منها. قم بإجراء الاستخراج على الفور عن طريق إضافة 150 ميكرولترات من كلوروفورم الفينول و100 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl إلى المرحلة مائي. دوامة ثم تنفيذ فصل المرحلة عن طريق الطرد المركزي 30 ثانية في 13، 000 مرات ز.جمع المرحلة مائي العلوي. عجل الحمض النووي عن طريق إضافة 15 ميكرولترات من خلات الصوديوم ثلاثة المولار، 2.5 إلى خمسة ميكروغرام من الجليكوجين، و 375 ميكرولترات من الإيثانول. بعد احتضان العينات في ناقص 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 13،000 مرات ز، أربع درجات مئوية.تجاهل عظمى وغسل لفترة وجيزة بيليه مع ملليلتر واحد من الباردة 70٪ الإيثانول. تجفيف بيليه الجليكوجين الحمض النووي في سرعة vac أو مجفف الهواء لأكثر من خمس دقائق. ثم حل بيليه في 50 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl.المقبل، إضافة خمسة ميكرولترات من الخرز المغناطيسي streptavidin، أعدت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ويفضل في خلاط دواميل أو عن طريق دوامة لطيف. نقل الأنابيب إلى موقف مغناطيسي لفصل الخرز.ثم جمع السائل المخصب في الحمض النووي دون البيوتين. هذا البروتوكول هو أداة لزيادة وتيرة المتغيرات المطلوبة من endonucleases تقييد المهندسة عن طريق استنزاف الانزيمات غير النشطة endonucleases مع عدم تغيير نوعية تسلسل من نوع البرية. يمكن أن يحدد الفحص الناجح ما يصل إلى 20٪ من المتغيرات الواعدة.وتوصف المتغيرات بأنها متغيرات واعدة إذا أنتجت نمطاً من الانقسام يختلف عن الإنزيم البري. كما يتم تصنيف المتغيرات التي قد تكون قد غيرت تفضيلات التسلسل. يظهر هنا هو فحص غير ناجحة مع غالبية التباين غير نشط ومتغير واحد مع نمط الانقسام على ما يبدو دون تغيير.في هذه الحالة، المكتبات هي الأكثر المحتمل dominated بواسطة المتغيرات غير النشطة التي escaped خطوة اختيار التقاط streptavidin. ومن الأهمية بمكان أن يتم بعناية تصميم التسلسلات المختارة والمواعدة، والحد من تنوع المكتبة باستراتيجية الطفرات التي تولد بدائل في عدد قليل فقط من المناصب المختارة. وينبغي أن تتميز أفضل المتغيرات المختارة بدقة للربط والانقسامات الحركية على تسلسلات المفضلة وليس مشقوق استنادا إلى النتائج من الفحص الأولي.في حالة الاختبار الخاصة بنا، تم اختيار مواقع الطفرات بناءً على نموذج homology. ومن المدهش أن هيكل الكريستال في وقت لاحق أظهرت أن بعض المخلفات المعدلة هي على الأرجح ليست على اتصال مباشر مع الحمض النووي.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

إجراءات التكيف مختبر تطور الكائنات الدقيقة باستخدام ناظم كيميائي

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

الجينوم التحرير وإخراج تمايز hPSCs عن التحقيق مع محددات النسب في تنمية البنكرياس الإنسان

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

التحديد الكمي "المعلومات المشفرة" واسطة الجينات التعبير مستويات خلال عمر التحوير تحت نطاق واسع "الغذائية التقييد" في C. ايليجانس

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

اختبار دور البلازميدات Multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

استخدام القناصة-Cas9 إلى أدنى حد من آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف عن طريق التطور الموجه

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...