Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Videregående Uddannelse (0295/B/PO1/2008/34 til MB og N301 100 31/3043 til KS), fra det polske nationale videnskabscenter (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 og UMO-2014/14/M/NZ5/00558 til MB) og ved kort sigt EMBO stipendium til KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den udvælgelsesprotokol, der er beskrevet her, blev testet for NlaIV8, en dimeric PD-(D/E)XK-foldegenkendelsessekvens, der genkender et palindromisk målsted med centrale NN-baser og katalyserer et stumpt endesnit mellem NN-baserne. NlaIV blev plukket, fordi spaltning mellem NN baser tyder på, at disse baser er tæt på proteinet i komplekset. I princippet kan protokollen anvendes til enhver sekvensspecifik begrænsning endonuclease, monomerisk eller dimeric, af enhver fold gruppe, katalysere dobbelt streng pauser af enhver vakle, uanset om katalytiske og specificitet domæner falder sammen (som i NlaIV eksempel) eller er separate (f.eks FokI). Desuden er protokollen i princippet nyttig ikke kun for generering af nye, mere snævre enzym specificitet, men kan også bruges til at fjerne stjerne aktiviteter, eller at skabe high fidelity endonucleases. Men alt dette er ikke blevet testet endnu. Især kan målrettet eliminering af stjerneaktivitet være kompliceret, fordi de samme aminosyrerester kan være involveret i binding til de ønskede og uønskede baser. De in vitro-trin, der er beskrevet i denne protokol, er ikke begrænset til udvælgelsen af indsnævrede særtræk, men kan også bruges til at vælge ellers ændrede specificiteter. Men der er så et problem med variant endonucleases: hvis spektret af substrater omfatter nye mål ikke kløvet af forældrenes endonuclease, er der generelt ingen god måde at beskytte celler mod de skadelige virkninger af denne aktivitet. Hvis endonuclease-specificiteten derimod kun indsnævres, er målene en delmængde af wild type-målene, og derfor bør det allerede tilgængelige cognate methyltransferase være fuldt beskyttende.
Vores protokol adskiller sig i flere henseender fra mange styrede evolutionsprotokoller. Åben læseramme mangfoldighed genereres én gang i begyndelsen af eksperimentet, ikke i hver iteration. Desuden er det skabt ved split-and-mix syntese, snarere end af EP-PCR. For NNS udskiftninger af codons, som anvendes i dette arbejde, er der (4 x 4 x 2)6 ~ 1,07 x 109 kombinationer for seks positioner. Derfor er en given variant til stede i gennemsnit en gang i 1,7 fmoles af ESC. Denne kapacitet kan øges til syv positioner ved hjælp af syntese med en blanding af 20 trinucleotid prækursorer, der tilbydes af Glen Research eller ved faldende mutationfrekvens i mindre lovende positioner med split-and-mix oligonukleotid syntese. Hvis det er muligt, anbefales det at begrænse omfanget af variation til seks positioner. Det er klart, at en sådan mutagenese målretning kræver en vis allerede eksisterende viden om i det mindste de regioner i REase involveret i substrat bindende. Split-and-mix-protokollen for at skabe mangfoldighed har klare fordele i forhold til EP-PCR. Ved hjælp af EP-PCR opnåede vi uændrede varianter og sekvenser, der medfører otte erstatninger for NlaIV ESCs i samme EP-PCR (tabel 4). Biblioteket fra EP-PCR indeholder en betydelig brøkdel af kloner, der bør undgås (vilde type sekvenser, flere udskiftninger, frameshift og nonsens mutationer, og mutationer på steder, der sandsynligvis ikke vil påvirke sekvens specificitet).
Vores protokol adskiller sig også fra mange andre styrede evolutionsprotokoller ved tilstedeværelsen af to sekventielle udvælgelsestrin. Positiv udvælgelse sikrer, at den ønskede aktivitet bevares, ellers fjernes biotinmærket ikke, og kodningssekvensen kan fjernes ved pull-down. Det er teknisk muligt, at den tilfældige fremkomst af en ny, ikke-overlappende specificitet (f.eks. Dette bør dog være højst usandsynligt. Negativ udvælgelse fjerner åbne læserammer, der koder for enzymer, der stadig har den uønskede aktivitet. Dette trin er ikke strengt obligatorisk, fordi protokollen stadig vil berige outputbiblioteket med varianter, der er i stand til at kløve udvælgelsessekvensen, men ikke er i stand til at kløve andre steder i ØSU, hvilket gør det uegnet til PCR-forstærkning. Udvælgelseseffektiviteten forventes dog at være lavere, fordi enzymer med den oprindelige sekvensspecificitet ikke vil blive fjernet fra outputtet og vil udkonkurrere lovende varianter med ændret specificitet, men også nedsat enzymatisk aktivitet. Bemærk, at på befolkningsniveau, både ønskede og uønskede mål sekvenser kan, men behøver ikke at være, degenerere. I NlaIV-eksemplet var antimålet degenereret, og målet var ikke-degenereret. Selv når der er degeneracy på befolkningsniveau, i en enkelt dråbe kun én (ikke-degenereret) mål eller anti-target er til stede. I vores protokol genindsættes mål- og antimålsekvenser ved hver gentagelse af udvælgelsestrinnene. Derfor skal en åben læseramme indkode et enzym, der kan kløve alle mulige mål, og ude af stand til at kløve nogen af antimålene, for at overleve flere udvælgelsesrunder. Bemærk, at behovet for at genindføre antiselection-målet ved hver gentagelse af protokollen håndhæver to sekventielle PCR'er. Den første PCR bruger en primer, der anneals uden for anti-målet, således at spaltning af anti-målet forhindrer PCR reaktion. Den anden PCR kræver en primer, der rækker ud over anti-målet, og genindfører anti-mål, for at sikre, at under flere runder af udvælgelse, hver åben læseramme er testet mod alle varianter af anti-target.
For enzymer, der genererer klæbrige ender, kan der anvendes en relateret alternativ protokol baseret på en tidligere beskrevet metode til isolering af REase ORF10. Udtømningen af inaktive varianter ved biotinindfangst, der anvendes i vores eksperimenter, erstattes i den alternative protokol ved at gøre den kompatible adapter med en sekvens, der bruges som primerbindingssted i en selektiv PCR (figur 9). Kun økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske Sekvensen af den klistrede ende af den afvalgte tæller skal være konstrueret således, at den ikke kan deltage i ligation med adaptere. Iteration af udvælgelsesprocessen kan nemt opnås ved at skifte mellem to forskellige adaptere og dermed to forskellige omvendte primere i selektiv PCR.
Selv med nye protokoller, opgaven med engineering nye særlige forhold in vitro er stadig meget udfordrende. For typiske type II REases afhænger sekvensspecificitet og endonukleolytisk aktivitet af de samme proteinområder. Det er derfor vanskeligt at ændre det ene uden at påvirke det andet. Succes er gjort mere sandsynligt ved en strategi, der tager hensyn til fodaftryk af enzymet, respekterer symmetrien i protein-DNA interaktioner, og bygger på allerede eksisterende enzymatiske præferencer, som bør bestemmes på forhånd i biokemiske eksperimenter, som det blev gjort for NlaIV eksempel8.

Sekvens specificitet engineering er ekstremt udfordrende for klasse II REases. I denne klasse af endonucleases er sekvensgenkendelse og katalyse tæt forbundet, sandsynligvis som en evolutionær sikkerhedsforanstaltning mod oprettelsen af en endonuclease af bredere specificitet end dets cognate methyltransferase, hvilket ville skade værts-DNA'et. Direkte udvikling af nye særlige forhold i celler kompliceres yderligere af behovet for at beskytte værts-DNA mod den nyudviklede endonuclease aktivitet. Derfor er der kun et par vellykkede forsøg på REase engineering rapporteret, og alle af dem udnytte de unikke funktioner i et bestemt enzym1,2,3,4,5,6,7.
Her giver vi en detaljeret protokol for specificitet engineering, der kan bruges til at generere endonuclease varianter, der har smallere specificitet end en forældrenes enzym, der er baseret på vores succesfulde konstruktion af en NlaIV endonuclease8. For ethvert sådant enzym med en vilkårlig genkendelsessekvens kan der indføres ekstra specificitet for baser i flankerne. For forældreenzymer, der genkender delvist degenererede sekvenser (såsom NlaIV med sit GGNNCC-mål), kan yderligere specificitet også indføres inden for genkendelsessekvensen. Da ekstra specificitet sandsynligvis vil kræve protein-DNA-kontakter, bør de nyligt anerkendte baser ligge inden for fodaftryk af forældrenes endonuclease på DNA. I princippet kan der oprettes udvælgelsesordninger for enhver ønsket specialisering af anerkendelsessekvensen. Men de fleste REases, der genkender palindromiske og næsten palindromiske målsekvenser er funktionelle dimers, der genkender kun et halvt sted af palindrome. Derfor er det usandsynligt, at udvælgelsen af nye specificiteter, der krænker symmetrien i proteinnukleininteraktioner, vil virke. For dimeric NlaIV, for eksempel, ggnNCC sekvens kan teoretisk indsnævres til GGATCC men indsnævring specificitetned til GGAACC forventes at være vanskeligere. Vores ordning indebærer både positiv og negativ udvælgelse.
Processen er mere effektiv, når negativ udvælgelse også bruges til at fjerne de særlige forhold, der kan kløve alle andre sekvenser end den foretrukne snævrere specificitet. F.eks. kan valg af GGATCC kombineres med antiselection mod GGBVCC (hvor B er en anden base end A, og V er en anden base end T). Når nogle af de mulige målsekvenser ikke er dækket, afhænger resultatet af udvælgelseseksperimentet af effektiviteten af positiv og negativ udvælgelse. I vores NlaIV arbejde, valgte vi for GGATCC, og mod GGSSCC (hvor S er G eller C), og opnåede en specificitet, at ignorere symmetri bryde mål, kunne beskrives som GGWWCC (hvor W er A eller T), hvilket tyder på, at i dette særlige tilfælde, negativ udvælgelse var mere vigtigt end positiv udvælgelse.
Vores tilgang starter med oprettelsen af et udtryk udvælgelse kassette (ESC). ØSU er struktureret i sektioner. På den indvendige kerne sektion, er der varianter af den åbne læseramme (ORF) af REase, under T7 promotor kontrol. Denne kernesektion af ESC må ikke indeholde noget cognate-sted for den udviklede REase. Kernen er klemt inde mellem to cognate steder for vilde type REase: en spaltning site for den uønskede aktivitet (counter valgt sekvens, GGSSCC i dette eksempel) og en spaltning site for den ønskede aktivitet (valgt sekvens, GGATCC i eksemplet). Det sidste trin i udarbejdelsen af ØSU i PCR tilføjer biotin tæt på den ønskede aktivitet i 5's ende og skaber en række forskellige modudvalgte sekvenser (GGSSCC i eksemplet). Udvælgelsesstrategien bygger på anvendelse af omhyggeligt designede primere i ESC's reamplificationprotokol efter en in vitro-transskriptions-/oversættelses-/udvælgelsesprotokol (figur 1A). ESC-biblioteket udtrykkes i en in vitro-opdelt transskriptionsoversættelse , som er vand-i-olie-emulsion9,10,11. Inden for hvert dråbe påvirker det udtrykte enzyms specificitet ESC 'ets tilstand (figur 1B,trin I). For det beskrevne arrangement fjerner den ønskede spaltningsaktivitet af det oversatte protein DNA's biotinmærke, men påvirker ikke den anden ESC-ende med den valgte tæller. Når emulsionen er brudt, fjernes biotinylatere fragmenter ved streptavidin affinitetspulldown, således at der kun er fragmenter fra dråber med den ønskede aktivitet tilbage(figur 1B, trin II). Dette trin fjerner inaktive REase-varianter. Den supernatant fraktion af pull-down trin forstærkes derefter af PCR. I de første PCR-reaktionsprimere anvendes F2 og R1(figur 1A,B, trin III). Primer F2 binder sig til ESC-sektionen mellem den valgte tællersekvens og molekyleenden. Derfor forstærkes økonomiske og økonomiske råd, der udtrykker varianter, der er i stand til at kløve den valgte tællersekvens (og derfor adskiller bindingsstederne for primer F2 og R1 i to forskellige DNA-molekyler) ikke og fjernes derfor fra biblioteket. Primer R1 binder sig mellem det valgte sted og kernen i ESC, så det ikke påvirkes af spaltningsstatus for det valgte sted og gendanner spaltningsstedet for den ønskede aktivitet (GGATCC). Cyklussen lukkes med en anden PCR (med primer F1 og R2), der tilføjer biotin i 5's ende tæt på det valgte sted og genskaber designet variation ved det valgte tællersted tæt på den modsatte ende af ESC (Figur 1B, trin IV). Den resulterende DNA-blanding er klar til endnu en valgrunde.
Udvælgelsesprotokollens succes afhænger i høj grad af, at den nye og strengere målgenkendelsessekvens bliver et korrekt valg, og at mutagenesestrategien og dens effektive gennemførelse er udformet omhyggeligt. Fordi det er meget lettere at forbedre på mindre allerede eksisterende præferencer REase end at overvinde dem, anbefaler vi at starte med en kinetisk undersøgelse af eventuelle allerede eksisterende præferencer. Nødvendigheden af omhyggelig mutagenese design skyldes den begrænsede størrelse af en mutant bibliotek, der kan behandles af den præsenterede protokol (109 kloner i et enkelt eksperiment). Derfor kan alle 20 mulige aminosyresubstitutioner testes effektivt i få positioner (se Diskussion). Tilfældig mutagenese, såsom fejlbehæftet PCR (EP-PCR), der præsenteres som en alternativ metode, vil føre til en dybtgående undersampling af eksisterende kompleksitet. Hvis der foreligger oplysninger om potentielle aminosyrepositioner, der er involveret i kontakt med DNA (eller endda placeret i nærheden af de degenererede nukleotider i en cognatesekvens), bør de helt sikkert anvendes til at vælge nogle få aminosyrer til oligonukleotid styret mætningmutagenese (protokoltrin 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

Begrænsning endonuclease (REase) specificitet engineering er yderst vanskeligt. Her beskriver vi en multitrinsprotokol, der hjælper med at producere REase-varianter, der har strengere specificitet end forældreenzymet. Protokollen kræver oprettelse af et bibliotek af udtryk saetter (ESC'er) for varianter af REase, ideelt med variabilitet i positioner, der kan påvirke DNA-binding. ESC er flankeret på den ene side af en sekvens for den ønskede begrænsningsaktivitet og et biotinmærke og på den anden side af et restriktionssted for den uønskede aktivitet og et grundstykke. ECC'erne transskriberes og oversættes i en vand-i-olie-emulsion under forhold, der gør tilstedeværelsen af mere end ét DNA-molekyle pr. dråbe usandsynlig. Derfor udsættes DNA'et i hvert kassettemolekyle kun for aktiviteten af det oversatte, kodede enzym. REase varianter af den ønskede specificitet fjerne biotin tag, men ikke primer glødning site. Efter at have brudt emulsionen udsættes DNA-molekylerne for en biotinnedtagning, og kun dem i supernatanten bevares. Dette trin sikrer, at kun økonomiske og regionale rådgivende råd for varianter, der ikke har mistet den ønskede aktivitet, bevares. Disse DNA-molekyler udsættes derefter for en første PCR-reaktion. Spaltning i den uønskede sekvens afskærer primer binding site for en af de primere. Derfor forstærker PCR kun økonomiske og små økonomiske og små økonomiske og små økonomiske og små, Der udføres derefter endnu en PCR-reaktion for at genindføre begrænsningsstedet for den ønskede specificitet og biotinmærket, således at udvælgelsestrinnet kan gentages. Udvalgte åbne læserammer kan overudtrykkes i bakterieceller, der også udtrykker den bevidste methyltransferase af forældreneS REase, fordi den nyudviklede REase kun er rettet mod en delmængde af methyltransferase målwebstederne.

Denne protokol er blot et værktøj til at øge hyppigheden af ønskede varianter af en manipuleret REase ved at nedbryde (men ikke fjerne) to uønskede klasser: inaktive enzymer og endonucleases med uændret vild type sekvens specificitet. På den anden side, fordi skiftende REase specificitet er yderst vanskeligt, at finde endnu en sådan variant producerer en spaltning mønster, der er forskellig fra den vilde type enzym i en enkelt screening af 24 kloner bør betragtes som en succes. I vores hænder de bedste skærme kunne identificere op til 20% af lovende varianter (Figur 8A).
Det positive resultat afhænger i høj grad af bibliotekets kvalitet (dvs. begrænset hyppighed af udskiftninger og deres tilfældige fordeling) og effektiv indfangning af den biotititerede population af biblioteksmedlemmer (trin 3.6-3.7). Begge problemer kan registreres. Bibliotekets kvalitet skal kontrolleres, før der vælges, ved at sekventere så mange kloner som muligt (>15) eller ved direkte sekvensering af biblioteket ved høj gennemløbsrækkefølge (trin 3.10, tabel 3). Hvis et flertal af de valgte kloner ikke er aktive, er dette en klar indikation af svigt af valget af streptavidin-fangst. En lignende effekt er observeret i tilfælde af biblioteker, der gennemgår mange udvælgelse cykler, fordi sådanne biblioteker er sandsynligvis domineret af inaktive varianter, der undslap streptavidin fange udvælgelse trin (Figur 8B). Derfor er det tilrådeligt at køre screening efter hver udvælgelsecyklus og videreudvikle manuelt udvalgte lovende varianter i stedet for at afhænge af udvælgelsesiteration.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Figur 1: In vitro-valg af en ny sekvensspecificitet baseret på NlaIV-teknik. (A) Organiseringen af udtrykket / udvælgelse kassette (ESC) omfatter to anerkendelse steder for REase, 1) den valgte sekvens (GGATCC) tæt på højre ende og 2) tælleren valgte sekvens (GGSSCC) tæt på venstre ende, samt T7p og T7t-T7 promotor og T7 terminator. De primer binding steder er vist nedenfor. Spaltning efter vild type og udvalgte NlaIV varianter er vist som henholdsvis røde og grønne trekanter. bB) Udvælgelsestrin: I) Emulgering af reaktionsblandinger af transskription-oversættelse og kavalergang med ESC-biblioteket II) Alle biotinylated DNA er fanget på magnetiske partikler belagt med streptavidin og fjernet, og dermed fjerne kodning inaktive varianter; III) Escs kodning REases med vilde type aktivitet (dvs. dem i stand til at kløve GGSSCC sekvens) er elimineret, fordi spaltning af sekvensen adskiller bindende steder for de forreste og omvendte primere. Der forekommer derfor ingen forstærkning af disse e-pc'er. IV) Input til den næste udvælgelsesrunde skabes ved tilsætning af biotin i højre ende og genindførelse af variation af de valgte tællersekvenser i venstre ende. Genoptrykt fra Czapinska et al.8 med tilladelse fra Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Figur 2: Forberedelse af ØSU. Fragment, der er afledt af den oprindelige konstruktion i en udtryksvektor, der indeholder NlaIV ORF under T7-promotors kontrol, blev ændret, så det er egnet til udtryk/udvælgelse. NlaIV-anlægget nedstrøms fra NlaIV ORF blev fjernet, og unikke steder (SalI, EcoRI og Eco52I), der blev brugt til at mutagenisere udvalgte positioner, blev indført i NlaIV ORF som tavse mutationer. Den endelige konstruktion blev forstærket med flankerende primere, der introducerede to flankerende NlaIV steder: Tælleren valgte sekvens (GGSSCC) til venstre og valgte sekvens (GGATCC) til højre. Den omvendte primer også indført biotin. Primere, der anvendes til oprettelse af muteret ECS, vises som blå pile og mærket nedenfor (se tabel 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Figur 3: Ordning for opdeling og blandingssyntese. Eksemplet henviser til MutB-syntese, hvor en NNS-sekvens blev introduceret med 0,8 frekvens ved fire positioner (se også tabel 3). Bemærk, at den kemiske syntese udføres fra 3' til 5', men alle sekvenser er vist i kanonisk 5'-3'-retning (dvs. den stammer fra højre mod venstre i denne ordning). Wild type sekvenser på mutageniserede positioner er vist med grønt, mens NNS mutagene sekvenser er i rødt. Sali-genkendelseswebstedet, der senere bruges til at indføre mutationer i eCC'er, understreges. Punkter for blanding og opdeling trin (2 og 4) er angivet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Figur 4: Anvendelse af unikke restriktionsenzymsteder i oligonukleotid målrettet mutagenese. Strategien for mutationsintroduktion er vist på et eksempel på opførelsen af biblioteker A-C (se trin 3.1-3.7). Genoptrykt fra Czapinska et al.8 med tilladelse fra Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Figur 5: Endonucleolytisk spaltning i in vitro transskription-oversættelse. (A) Spaltning af et testsubstrat i optimal REase buffer: 1) Substrat, 612 bp PCR produkt med en enkelt NlaIV anerkendelse site; 2) Spaltningsprodukter, 355 bp og 257 bp. (B) Spaltning i en in vitro transskriptionsoversættelsesreaktion (indeholdende 0,5 μg ESC): 1-2) 15 μL aliquots af in vitro transskriptionsoversættelse uden substrat (linje 2: reaktion suppleret med 1,5 mM MgCl2); 3-4) 15 μL aliquots af in vitro transskriptionsoversættelse med 1 μg testsubstrat (linje 4: reaktion suppleret med 1,5 mM MgCl2). S-DNA størrelse markør (pBR322 fordøjet med MspI). Prøver blev løst i 6% indfødte SIDE. DNA blev plettet med ethidium bromid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Figur 6: Produkter af den første PCR i udvælgelsescyklussen. Se figur 1B, trin III; protokoltrin 5.10. Kolonnesæt 1 og 2 er aliquots af to forskellige biblioteker indlæst i tre eksemplarer. S-DNA størrelse standard (lambda DNA fordøjet med HindIII og EcoRI). Pilen angiver placeringen af ESC i fuld længde (1.050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Figur 7: NlaIV varianter renset for yderligere screening i mini skala. Se trin 6.3.11. Hver linje indeholder en 10 μL aliquot af en anden variant. S-protein molekylvægt standard. Molekylmassen af NaIV REase-underenheden er 29,9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Figur 8: Eksempler på screening af NlaIV-varianter for sekvensspecificitetsændring. Se trin 6.4.2. (A) Vellykket screening med høj frekvens af lovende varianter. S = DNA størrelse markør, lambda DNA kløvet med HindIII og EcoRI; vild type (wt) = lambda DNA kløvet med vild type NlaIV λ = lambda DNA-substrat, ikke kløvet andre kolonner=varianter med meget lav aktivitet. Varianter er mærket ! = lovende varianter, der producerer et spaltningsmønster, der adskiller sig fra det vilde typeenzym; ? = varianter, der også kan have ændret sekvenspræferencen. (B) Mislykket screening, med et flertal af varianter inaktive og en variant med tilsyneladende uændret spaltning mønster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Figur 9: Alternativ valg ved ligation. Dette alternativ kan bruges til alle REases generere klæbrige ender. Her præsenterer vi et eksempel protokol for en udvælgelse ordning for MwoI enzym (ikke offentliggjort). I) Valgt sekvens (placeret i højre ende af ESC) med definerede restkoncentrationer vist med rødt og udvalgt variation af den cognate sekvens vist med blåt. I parentes under den tæller vises den valgte sekvens, der skal placeres i venstre ende af ESC. II) Produkt af MwoI spaltning; III) Efter afslutning in vitro transskription / oversættelse, er produkter renset og ligation udføres med overskydende adapter. Kun spaltningsprodukter, der blev kløvet i den valgte sekvens, kan deltage i ligation. Derfor elimineres inaktive varianter, og rullegardintrinnet er unødvendigt. Spaltningsproduktet i den valgte tællersekvens (i venstre ende af ØSU, som ikke er vist) kan ikke deltage i denne ligation, fordi den fremspringende ende af adapteren ikke supplerer den valgte tæller. IV) Selektiv PCR bruger den samme strategi som i hovedprotokollen til at eliminere varianter med den vilde type degenererede sekvens specificitet (F1 primer binding distalt til tælleren valgte websted), mens inaktive varianter elimineres af den selektive omvendt primer, der ikke kan binde sig til onkel (og derfor ikke ændret ved adapter ligation) højre ende. I den næste cyklus kan processen gentages ved hjælp af adapter, der er identisk med spaltningsproduktet af det foregående trin (dvs. "kløvet kassette" i panel III) og en passende selektiv omvendt primer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tabel 1: Primere, der anvendes i NlaIV-teknik. Sekvenser af de begrænsningswebsteder, der er nævnt i kommentarerne, understreges. Små bogstaver angiver sekvenser, der ikke har komplementer i DNA-skabelonerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).</a>
Tabel 2: Betingelser for PCR-reaktioner, der skal anvendes i protokollen. Tm = smeltetemperatur for primer (hvis Tm er forskellig for primerne, skal den nederste Tm anvendes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).</a>
Tabel 3: Resultater af kvalitetskontrol af to mutagene primere syntetiseret med split-and-mix strategi. Mutageniserede codons er angivet med [XXX]. Et lavere indekstal angiver placeringen af en kodet aminosyre. Tilpasset fra Czapinska et al.8 med tilladelse fra Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).</a>
Tabel 4: Resultater af EP-PCR. Hovedparametre udledt af sekvensanalyse af 22 kloner af ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Restriktionen endonucleases med ny sekvens specificitet kan udvikles fra enzymer, der genkender en delvist degenereret sekvens. Her giver vi en detaljeret protokol, som vi med succes har brugt til at ændre sekvensspecificiteten af NlaIV-enzymet. De vigtigste ingredienser i protokollen er in vitro-opdelingen af transskriptions-/oversættelsesreaktionen og udvælgelsen af varianter med nye sekvensspecificiteter.

In Vitro Instrueret Udviklingen af en begrænsning Endonuclease med strengere specificitet

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Vores protokol giver mulighed for oprettelse af restriktionsenzymer med ændrede, strengere sekvensspecifikiteter ved hjælp af in vitro-opdeling og en unik udvælgelsesstrategi i styret evolution. Potentielt er det helt universelt, da det bør gælde for enhver begrænsning endonuclease og udvælgelse kan rettes mod en strengere version af en original cognate sekvens. Hvis nyoprettede varianter udtrykkes ved in vitro-transskriptionsoversættelse, er protokollen egnet ikke blot til at indsnævre specificiteten, men også til at ændre specificiteten.For at afgøre steder for undermæt mutagenesis, skal du vælge mutagenese frekvenser i henhold til den hypotetiske betydning af de steder, holde grænser for den samlede bibliotek kompleksitet i tankerne. For at begynde syntesen skal du indsætte kolonner, der er pakket med ny harpiks i synthesizeren. Syntetisere oligonukleotrider i alle kolonner op til triplet, umiddelbart før den anden subsaturation mutagenesis site tælle fra de tre-prime ende.Syntetisere, forlader en fem-prime trityl gruppe i slutningen. Den beskyttende gruppe vil blive fjernet i begyndelsen af den næste syntesecyklus. Åbn syntesøjerne og centrifugeres kortvarigt i tørre 1,5 milliliterrør for at opsamle harpiksen.Træk CPG syntese støtte og bland ved vortexing. Geninddeler den blandede CPG-harpiks i nye syntesekolonner. Undgå at indføre fugtighed, fordi det vil reducere det samlede udbytte.Fortsæt syntesen, startende fra subsaturation mutagenesis site triplet. Tildel kolonner til randomiserede NNS trillinger eller wild-type trillinger i henhold til den ønskede mutagenese frekvens. Hvis der findes yderligere underordnede steder, skal du kun gå videre til den tredobbelte, der går forud for det næste undermætnings mutagenesested.Hvis der ikke er flere underordnede steder til stede nedstrøms, skal du færdiggøre syntesen og efterlade en fem-prime tritylgruppe i slutningen. Brug brede borepipettespidser til at forberede en olie overfladeaktiv blanding ved at tilsætte 225 mikroliter Span 80 og 25 mikroliter Tween 80 til fem milliliter mineralsk olie i et 15 milliliter konisk rør. Bland grundigt ved blid inversion 15 gange.Blandingen på dette trin skal være gennemskinnelig. For hvert bibliotek overføres 950 mikroliter af blandingen af olieoveraktivt stof til et to milliliter rundtyogent hætteglas. Etiket med et biblioteksnavn og overfør til is.Sæt en lille cylindrisk omrøring bar i hvert hætteglas. Forbered en in vitro transskription-oversættelse reaktion blanding i henhold til producentens forslag. Tillæg blandingen med magnesiumchlorid til en endelig koncentration på 1,5 millimolar.Dispenseres 50 mikroliter aliquots af reaktionsblandingen i 1,5 milliliter rør på is. Der tilsættes 1,7 femtomoleer i biblioteket til reaktionsblandingen på is. Forbered vand-i-olie emulsion fortløbende for hvert bibliotek ved først at placere et lille bæger fyldt med is på en magnetisk omrører med omrøringshastigheden indstillet til 1150 omdr./min.Overfør derefter et kryogent hætteglas med 950 mikroliter olie overfladeaktivt blanding og en lille omrøringsstang til et iskoldt bægerglas på den magnetiske omrører. Kontroller, at omrøringsbjælken drejer rundt. Tilføj fem 10-mikroliter aliquots af in vitro bibliotek transskription-oversættelse blanding over en to-minutters periode i 30 sekunder intervaller og fortsætte omrøring i et ekstra minut.Hætteglasset overføres med emulsionen til en isbeholder. På dette tidspunkt skal væsken være uigennemsigtig, ikke gennemsigtig. Fortsæt derefter med det næste bibliotek.Når alle bibliotekerne er behandlet, skal du starte inkubationen af alle bibliotekerne i henhold til kitproducentens anbefalinger. Hætteglassene overføres til den temperatur, der er optimal for den konstruerede endonuclease, i yderligere to timer, før de anbringes på is i mindst 10 minutter. Emulsioner fra kryogene hætteglas i 1,5 milliliterrør.Tilføj en mikroliter af 5 molar EDTA. Og centrifuge dem ved 13,000 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Hvis der efter centrifugering ikke kan se vand-olie interface klart, fryse blandingen før aspiration af den øvre oliefase.Bevæg den øvre oliefase med en pipette og kassér den. Udfør straks ekstraktion ved at tilsætte 150 mikroliter fenolchloroform og 100 mikroliter af 10 millimolar Tris-HCl til den vandige fase. Vortex og derefter udføre fase adskillelse via 30-sekunders centrifugering på 13,000 gange g.Saml den øvre vandige fase. Udfældes DNA'et ved at tilsætte 15 mikroliter tre-molar natriumacetat, 2,5 til fem mikrogram glykogen og 375 mikroliter ethanol. Efter inkubering prøverne ved minus-20 grader Celsius i en time, centrifuge i 15 minutter ved 13, 000 gange g, fire grader Celsius.Kassér supernatanten og vask kort pellet med en milliliter kold 70% ethanol. Dna-glykogenpellet tørres i en hastighedsvac eller lufttørrer i mere end fem minutter. Derefter opløses pellet i 50 mikroliter af 10 millimolar Tris-HCl.Dernæst tilsættes fem mikroliter af streptavidin magnetiske perler, udarbejdet i henhold til producentens anvisninger. Bland i en time ved stuetemperatur, helst i en karruselblander eller ved blid vortexing. Overfør rørene til en magnetisk stander for at adskille perlerne.Derefter indsamles væsken beriget i DNA uden biotin. Denne protokol er et værktøj til at øge hyppigheden af ønskede varianter af manipuleret begrænsning endonucleases ved at nedbryde inaktive enzymer og endonucleases med uændret wild-type sekvens specificitet. Vellykket screening kan identificere op til 20% af lovende varianter.Varianter er mærket som lovende varianter, hvis de producerer en spaltning mønster adskiller sig fra wild-type enzym. Varianter, der kan have ændret sekvenspræferencen, er også mærket. Vist her er en mislykket screening med størstedelen af varians inaktiv og en variant med tilsyneladende uændret spaltning mønster.I dette tilfælde er bibliotekerne sandsynligvis domineret af inaktive varianter, der undslap streptavidin capture valg trin. Det er afgørende omhyggeligt at designe de udvalgte og kontraud valgte sekvenser og begrænse biblioteksdiversiteten efter mutagenesestrategi, der genererer udskiftninger på få udvalgte stillinger. De bedste udvalgte varianter skal karakteriseres grundigt for binding og spaltning kinetik på foretrukne og ikke kløvet sekvenser baseret på resultaterne fra den indledende screening.I vores prøvetilfælde blev mutagenese steder udvalgt baseret på en homologi model. Overraskende nok viste en krystalstruktur senere, at nogle ændrede rester sandsynligvis ikke er i direkte kontakt med DNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design og brug af en Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution Bacteria Under antibiotikum Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution af mikroorganismer Ved hjælp af en kemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Redigering og Directed Differentiering af hPSCs spørgekriterierne Lineage Determinanter i Human pancreas Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Kvantificering af oplysninger kodet af genet udtryk niveauer under levetid graduering Under bred vifte kosten begrænsning i C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Test af flerkopiværktøj plasmider rolle i udviklingen af antibiotikaresistens

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genom-dækkende overvågning af transskription fejl i Eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producerer gen sletninger i Escherichia coli af P1 transduktion med punktafgiftspligtige antibiotikaresistens kassetter

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Ved hjælp af Sniper-Cas9 til at minimere Off target effekter af CRISPR-Cas9 uden tab af målaktiviteten Via styret Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...